專利名稱：一株棘孢曲霉菌株及用該菌株制備5,7,8,4’-四羥基異黃酮的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備5，7，8，4’ -四羥基異黃酮的新方法，特別是用微生物或酶轉(zhuǎn)化染料木素及其糖苷生成5，7，8，4’ -四羥基異黃酮的方法。屬于中藥新藥研究開發(fā)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
5，7，8，4’-四羥基異黃酮分子式=C15HltlO6
分子量386 分子結(jié)構(gòu)5，7，8，4’-四羥基異黃酮，固體呈微黃色，溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑，難溶于水。5，7，8，4’ -四羥基異黃酮屬異黃酮類物質(zhì)，是染料木素加上一個羥基后的衍生物。染料木素是一種雌激素樣化合物藥物，被稱為植物性雌激素類藥物，醫(yī)藥中主要用于治療婦女病和老年性骨質(zhì)疏松癥(中國專利CN101497594A)。此外
在抗月中瘤(Sanjeev Banerjee et al, 2005, Molecular evidence for increased antitumoractivity of gemcitabine by genistein invitro and invivo using an or the topic model of Pancreatic cancer[J]. Cancer Res. 2005, 65: 9064-9072)、抗
炎、陣痛、降尿酸(黃敬群等.染料木素抗炎、鎮(zhèn)痛、降尿酸作用實驗研究[J].西北藥學(xué)雜志，2001，26(3): 193-195)、降血脂(金永生，劉超美.金雀異黃素的藥理作用[J]. 國外醫(yī)藥與植物藥分冊等，2002，17(5): 191-193)、體外抗肝纖維化(李建芳，陳必成等.染料木素對硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠PDGF-BB表達的影響[J].肝膽胰外科雜志，2009，21(3): 118-125)等方面都具有明顯的生物活性。染料木素作為藥物使用時，進入人體內(nèi)的染料木素一部分被腸內(nèi)細菌轉(zhuǎn)化，一部分自小腸黏膜吸收經(jīng)代謝，5，7，8，4’-四羥基異黃酮就是代謝產(chǎn)物之一。(楊秀偉.中藥成分的吸收、分布、代謝、排泄、毒性與藥效(上).北京中國醫(yī)藥科技出版社，2006)。由染料木素衍生而來的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮是酪氨酸酶的有效抑制劑， 具有很強的酪氨酸酶抑制活性(TE-SHENG CHANG. Two potent suicide substrates of
mushroom tyrosinase:5, 7, 4' -trihydroxyisoflavone and 5,7,8,4' -tetrahydroxyis
oflavone[J], FoodChem, 2007, (55): 2010-2015),研究表明黃酮母核上的羥基的數(shù)量對黃酮類化合物的活性影響很大(Sabine Ε. Kulling, Doris Μ. Honig, Thomas J. Simat, Manfred. Metzler. Oxidative in viruo metabolism of the soy phytoestrogens daidzein and genistein[J]. J. Agric. Food Che, 2000, 48(10) : 4963-4972)。研究發(fā)現(xiàn)異黃酮的A環(huán)上5，7位及B環(huán)上的4’的羥基是抑制前列腺癌和乳腺癌的主要基團。由于酚羥基作為供氧體能與自由基反應(yīng)使之形成相應(yīng)的離子或分子，大豆異黃酮含有的酚羥基可減少氧自由基，降低其對生物大分子的損傷，可能減少了腫瘤的發(fā)生(毛峻琴， 宓鶴鳴.大豆異黃酮的研究進展[J].第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，2000，(31): 61-64)。因此比染料木素多一個羥基的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮在水溶性方面更有研究價值。酪氨酸酶(tyrosinase)廣泛存在于自然界中，是黑色素生物合成的關(guān)鍵酶和限速酶。酪氨酸酶的活性與色素沉著性疾病、食品褐變等均有密切關(guān)系。酪氨酸酶抑制劑的研發(fā)對人類皮膚色素疾病的治療、食品保鮮及農(nóng)業(yè)抗蟲領(lǐng)域具有重要意義。(李娜，魯曉翔.酪氨酸酶抑制劑的研究進展[J].食品工業(yè)科技，2009，(7): 406-409)。目前氫醌、熊果苷、曲酸、壬二酸等酪氨酸酶抑制劑已用于臨床(閆軍，陳聲利，李春陽.酪氨酸酶抑制劑及對黑素生物合成的影響[J].國外醫(yī)學(xué)皮膚性病醫(yī)學(xué)分冊，2003，29(4): 250-253), 5，7，8，4’ -四羥基異黃酮作為一種酪氨酸酶抑制劑有重要的研究價值。染料木素廣泛存在于植物的葉子和種子中，但含量很低，如葛根 0. 065%-0. 078%,大豆0. 04%-0. 24%;紅車軸草約0. 3% ；豆豉0. 34%,從大豆中得到染料木素是目前工業(yè)化的方法，成品收率約為原料的0.04%。(中國專利CN101497594A)，因含量低的原因，分離成本較高。而槐角中含染料木素含量為0.5-1%比大豆等高幾十倍。大豆中染料木苷含量在0. 025%?；睒湓谌珖芏嗟胤蕉寄苌L，槐角資源豐富，槐角含有大量糖苷化合物，其中染料木素的糖苷化合物-染料木苷的含量很高，有的產(chǎn)地可達9. 14%(房敏峰，曲歡歡，文頌華，李靜，孫文基.槐角不同炮制品種槐角苷的含量測定[J]. 中藥材，2007，30(1): M-25)。現(xiàn)有的研究大多從大豆發(fā)酵產(chǎn)品中提取分離得到了 5, 7,8,4'-四羥基異黃酮，TE-SHENG，CHANG利用黑曲霉從500g大豆胚芽固體曲中提取得至Ij 33. 5mg5，7，8，4，_ 0 基異黃Sf (Te-Sheng Chang. Mushroom tyrosinase inhibitory effct isofisoavone sisolated from soygerm koji fermented with Aspergillus oryzae BCRC32288 [J]. Food Chemistry, 2007，(105) : 1430-1438)，收率僅為 0. 0067 且純度未提，大豆中染料木素的含量在0. 04-0. 1%,染料木苷的含量在0. 0 左右(毛峻琴，宓鶴鳴.大豆異黃酮的研究進展[J].中草藥，2000，31(1): 60-64)，的因此槐角是生產(chǎn)染料木苷或染料木素或5，7，8，4’ -四羥基異黃酮的理想原料。本發(fā)明利用特異性強的棘孢曲霉將槐角中高含量的染料木苷等高效地轉(zhuǎn)化為 5，7，8，4’ -四羥基異黃酮，從槐角得到5，7，8，4’ -四羥基異黃酮產(chǎn)品。該方法條件溫和 (常溫)，操作簡便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一株棘孢曲霉菌，以及利用該項菌轉(zhuǎn)化槐角得到 5，7，8，4’-四羥基異黃酮的方法。所述的一株棘孢曲霉菌，是棘孢曲霉ZjrAs/^r^/BM aculeatus ZJ入該菌株的保藏編號是 CCTCC NO :Μ 2011264ο本發(fā)明所說的制備5，7，8，4’-四羥基異黃酮的方法，其特征在于包含以下步驟 將棘孢曲霉ZJ (Aspergillus aculea tusZJ )接種到含有染料木素或染料木苷的
槐角粉末或提取液中，在一定條件下進行轉(zhuǎn)化；得到的物料經(jīng)分離純化處理，得到 5，7，8，4’ -四羥基異黃酮; 或者是
將棘孢曲霉Z J (Aspergillus aculea tusZJ )的菌曲加入到含有染料木素或染料木苷的槐角粉末或提取液中，進行生物轉(zhuǎn)化，得到的物料經(jīng)分離純化處理，得到 5，7，8，4’-四羥基異黃酮; 或者是
將從棘孢曲霉ZJ (Aspergillus acWeatosZ/」中得到的酶液或酶粉加入到含有染料木素或染料木苷的槐角粉末或提取液中，進行生物轉(zhuǎn)化，得到的轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化處理，得到5，7，8，4’-四羥基異黃酮。上述方法中所說的轉(zhuǎn)化底物為槐角浸提液，或是槐角或是粉碎后的槐角粉末。上述方法中所說的槐角浸提液為10%的(w/w)煮提液，其中染料木苷的濃度為 0. 1-0. 9%,染料木素的濃度為0. 01-2. 5%。上述方法中所說的固體為槐角原料或粉碎至任意目數(shù)，其中染料木苷的含量為 0. 1-9%,染料木素的含量為0. 01-2. 5%.
上述方法中所說的轉(zhuǎn)化體系中接菌量為轉(zhuǎn)化底物體積的0.廣10%優(yōu)選5 15%(V/V)， 最好纊12%(V/V)；或者加入菌粉量為底物重量的0. 019Γ20% ；或者加入的酶量為底物重量的 0.01% 15%。上述方法中所說的轉(zhuǎn)化溫度為5_55°C，優(yōu)選25_35°C，轉(zhuǎn)化時間為0.5小時-5d，優(yōu)選3-4d ；轉(zhuǎn)化體系的pH值為2-10. 5。本發(fā)明將一定量的固體槐角粉末，按一定的固液比用水充分浸提后，過濾得到浸提液，接入微生物，在適當(dāng)?shù)臏囟群蚉H下轉(zhuǎn)化，即可獲得轉(zhuǎn)化液，經(jīng)除雜和分離純化后獲得高純度的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮產(chǎn)品?；蛘呷∫欢康墓腆w槐角粉末，加水做成固體培養(yǎng)基，在適當(dāng)?shù)臏囟群蚉H下轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化到得轉(zhuǎn)化液，再經(jīng)分離純化即可得到高純度的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮。將選育的棘孢曲霉按常規(guī)的液體或固體發(fā)酵培養(yǎng)后接入含染料木苷(0. 1-1%)和染料木素0. 01-0. 5%的體系中，接菌量為0. 5 10%(V/V)，培養(yǎng)24-144 h。10%(ff/ff)轉(zhuǎn)化原液HPLC圖見圖2，轉(zhuǎn)化完全后的HPLC如圖3所示。本發(fā)明的優(yōu)點
1)槐角資源豐富，廉價易得，是制備5，7，8，4’ -四羥基異黃酮理想原材料；
2)微生物轉(zhuǎn)化特異性強，轉(zhuǎn)化效率高，可達100%；
3)從20g原料中得到366mg成品，收率高，純度可達98%。


圖1 5, 7，8，4，-四羥基異黃酮轉(zhuǎn)化工藝。圖2 轉(zhuǎn)化原液HPLC圖。
圖3 轉(zhuǎn)化完全后的HPLC圖。圖4 制備收集后的純度檢測HPLC圖。
具體實施例方式從江蘇省植物中經(jīng)富集培養(yǎng)分離得到10株菌，分別對槐角浸提液進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條件如實施例1所述。HPLC方法檢測轉(zhuǎn)化效果，選擇轉(zhuǎn)化效果好的一株作為研究菌株， 命名為ZJ。該菌在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天可長出菌落，菌落形態(tài)開始為白色，后逐漸變?yōu)楹谏a(chǎn)生孢子為黑色，通過顯微鏡觀察，菌絲無色，有隔，光滑，無規(guī)則分枝，分生孢子梗光滑，無隔，上端膨大呈球形，孢子簇生，孢子為圓形，大小在3. 5-4. 5 μ m， 孢子表面有小突刺，經(jīng)鑒定為棘孢曲霉{Aspergillus aculeatus)。上述棘孢曲霉ZJ于2011年7月25日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏單位地址武漢大學(xué)；分類命名為棘孢曲霉ZjOs/^r^/BM aculeatusZJ),保藏編號為CCTCC NO M 2011264。棘孢曲霉菌粉或酶粉的制備使用常規(guī)的液體或固體發(fā)酵培養(yǎng)和酶的分離方法即可得到菌粉或酶粉。例如，菌粉的制備包括菌的發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液的分離、菌泥乳化和乳化液真空冷凍干燥。將棘孢曲霉產(chǎn)酶發(fā)酵的酶液經(jīng)冷凍后在真空度廣5 條件下真空干燥30 h即可得到酶粉。本發(fā)明所用的材料即轉(zhuǎn)化底物從江蘇南京市南京師范大學(xué)校園采摘。本發(fā)明本發(fā)明制備的流程如圖1，下面結(jié)合具體的實驗和數(shù)據(jù)為本發(fā)明進一步說明，舉例是為說明本發(fā)明的過程而非僅限于實施例。以下實施例中所說的菌液、菌粉、酶粉或酶液均指棘孢曲霉CCTCC NO =M 2011264的菌液、菌粉、酶粉或酶液。實施例1 配制10%的轉(zhuǎn)化原液pH5，HPLC檢測結(jié)果見圖2，將棘孢曲霉菌液按 5%的接種量接種，30°C，培養(yǎng)4天，搖瓶結(jié)束后，SOOOrpm離心，取上清，HPLC檢測結(jié)果見圖3所示，用常規(guī)提取方法得到5，7，8，4’-四羥基異黃酮固體產(chǎn)品，純度為98%， HPLC檢測結(jié)果見圖4所示。實施例2 取槐角粉末適量，加水適量，加10%(W/W)菌液，30°C轉(zhuǎn)化3. 5天。 結(jié)束后分離純化得到高純度的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮。實施例3 500 mL轉(zhuǎn)化瓶裝10%(W/W)、ρΗ5· 5轉(zhuǎn)化原液，加15%(W/W)菌液，30°C 轉(zhuǎn)化3天。結(jié)束后分離純化得到高純度的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮。實施例4 500 mL轉(zhuǎn)化瓶裝10%(W/W)、pH5轉(zhuǎn)化原液，加5%(W/W)酶液，30°C轉(zhuǎn)化3天。結(jié)束后分離純化得到高純度的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮。實施例5 500 mL轉(zhuǎn)化瓶裝10%(W/W)、ρΗ6· 5轉(zhuǎn)化原液，力Π 10%(ff/ff)酶液，30°C 轉(zhuǎn)化2天。結(jié)束后分離純化得到高純度的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮。實施例6 500 mL轉(zhuǎn)化瓶裝10%(W/W)、ρΗ5· 5轉(zhuǎn)化原液，加15%(W/W)酶液，30°C 轉(zhuǎn)化2天。結(jié)束后分離純化得到高純度的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮。實施例7 500 mL轉(zhuǎn)化瓶裝10%(W/W)、pH4轉(zhuǎn)化原液，加5%(W/W)菌粉，30°C轉(zhuǎn)化4天。結(jié)束后分離純化得到高純度的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮。
實施例8 500 mL轉(zhuǎn)化瓶裝10%(W/W)、ρΗ6· 5轉(zhuǎn)化原液，力Π 10%(ff/ff)菌粉，30°C 轉(zhuǎn)化4天。結(jié)束后分離純化得到高純度的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮。實施例9 500 mL轉(zhuǎn)化瓶裝10%(ff/ff)、pH5轉(zhuǎn)化原液，加15%(W/W)菌粉，30°C轉(zhuǎn)化3天。結(jié)束后分離純化得到高純度的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮。實施例10 500 mL轉(zhuǎn)化瓶裝10%(ff/ff)、pH5轉(zhuǎn)化原液，加15%(ff/ff)菌粉，30°C 轉(zhuǎn)化2天。結(jié)束后分離純化得到高純度的5，7，8，4’ -四羥基異黃酮。實施例11
與實施例1基本相同，所不同的是溫度為^°c。實施例12
與實施例1基本相同實施例13 與實施例1基本相同實施例14 與實施例4基本相同實施例15 與實施例4基本相同實施例16 與實施例7基本相同實施例17 與實施例2基本相同實施例18 與實施例2基本相同實施例19 與實施例2基本相同
所不同的是溫度為25°C。
所不同的是溫度為35°C。
所不同的是轉(zhuǎn)化時間為4天。
所不同的是轉(zhuǎn)化時間為1天。
所不同的是接種量為20%。
所不同的是用菌粉轉(zhuǎn)化。
所不同的是用酶液轉(zhuǎn)化。
所不同的是用酶粉轉(zhuǎn)化。
權(quán)利要求
1.一種棘孢曲霉ZJ {Aspergillus aculeatus ZJ)菌株，其特征在于該菌株的保藏編號是 CCTCC NO :Μ 2011264ο
2.一種制備5，7，8，4’ -四羥基異黃酮的方法，其特征在于包含以下步驟將棘孢曲霉ZJ (Aspergillus aculea tuslS)接種到含有染料木素或染料木苷的槐角粉末或提取液中，在一定條件下進行轉(zhuǎn)化；得到的物料經(jīng)分離純化處理，得到 5，7，8，4’ -四羥基異黃酮;或者是將棘孢曲霉ZJ (Aspergillus aculeatus ZJ) 的菌曲加入到含有染料木素或染料木苷的槐角粉末或提取液中，進行生物轉(zhuǎn)化，得到的物料經(jīng)分離純化處理，得到 5，7，8，4’-四羥基異黃酮;或者是將棘孢曲霉ZJ (Aspergillus aculeatuslS)中得到的酶液或酶粉加入到含有染料木素或染料木苷的槐角粉末或提取液中，進行生物轉(zhuǎn)化，得到的轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化處理， 得到5，7，8，4’-四羥基異黃酮。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化底物為槐角浸提液，或是槐角或是粉碎后的槐角粉末。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，槐角浸提液為10%的(w/w)煮提液， 其中染料木苷的濃度為0. 1-9%,染料木素的濃度為0. 01-2. 5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，固體為槐角原料或粉碎至任意目數(shù)， 其中染料木苷的含量為0. 1-9%,染料木素的含量為0. 01-2. 5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化體系中接菌量為轉(zhuǎn)化底物體積的0.廣10% ；或者加入菌粉量為底物重量的0. 019Γ20% ；或者加入的酶量為底物重量的 0. 019Tl5%。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化溫度為5-55°C，轉(zhuǎn)化時間為0.5 小時-5d，轉(zhuǎn)化體系的pH值為2. 0-10. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種棘孢曲霉ZJ(AspergillusaculeatusZJ)菌株及其應(yīng)用。所說的棘孢曲霉ZJ,保藏編號為CCTCC No.M2011264。該菌株主要用于轉(zhuǎn)化槐角的有用成分生產(chǎn)5,7,8,4’-四羥基異黃酮。具體方法是用專一性強的棘孢曲霉ZJ或其產(chǎn)生的酶作用于槐角或其提取液,使其中的槐角苷等糖苷類化合物、染料木素等經(jīng)過轉(zhuǎn)化,生成5,7,8,4’-四羥基異黃酮,通過常規(guī)方法分離提取(純度可達98%)。本發(fā)明提供了一種專一性強,轉(zhuǎn)化效率高的棘孢曲霉轉(zhuǎn)化槐角苷生成5,7,8,4’-四羥基異黃酮的方法,條件溫和,過程綠色,工藝與設(shè)備要求簡單,有很好的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N1/14GK102277304SQ20111022585
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者唐超, 張玉千, 玄燕, 陳育如 申請人:南京師范大學(xué)