專利名稱：從關(guān)節(jié)軟骨中提取rna的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種從組織中提取優(yōu)質(zhì)RNA方法，尤其是從關(guān)節(jié)軟骨中高效率地提取出優(yōu)質(zhì)RNA的方法，以供進一步分析、檢測之用。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)炎軟骨的損傷對人類身體健康有嚴重影響，能引起強烈的關(guān)節(jié)疼痛，甚至會導致關(guān)節(jié)喪失活動能力。為尋找修復關(guān)節(jié)軟骨損傷有效手段，現(xiàn)有技術(shù)有應用先進的分子生物學技術(shù)研究關(guān)節(jié)軟骨損傷的發(fā)生、發(fā)展過程。而深入了解損傷過程軟骨細胞的基因表達變化是很重要的環(huán)節(jié)之一，而提取出足夠數(shù)量和質(zhì)量的RNA (核糖核酸)以供分析，是軟骨細胞基因表達研究工作得以進行的先決條件。然而，常規(guī)的、被廣泛應用于各種動物組織的RNA硫氰酸胍提取方法(Chomczynski P, Sacchi N于1987年發(fā)表于Anal Biochem. 1987 Apr;162(1)156-9. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.)，其是將組織直接在硫氰酸胍溶液中勻漿，然后用苯酚-氯仿混合溶劑抽提，乙醇沉淀。此法實際難以從關(guān)節(jié)軟骨組織中有效地提取足夠高純的RNA，所得RNA得率很低，純度不高，使得對RNA分析、檢測、研究帶來困難。其主要原因是軟骨組織中含有大量的水分和細胞外基質(zhì)蛋白，軟骨細胞只占整個組織重量的3%左右，并且軟骨細胞又被大量軟骨基質(zhì)所包裹，細胞不易從基質(zhì)中分離出來，這樣在常規(guī)硫氰酸胍法提取中相當數(shù)量的軟骨細胞仍被在基質(zhì)包裹中，未能從基質(zhì)中分離出來， 由此造成RNA得率很低；另外基質(zhì)糖蛋白與RNA會形成共沉淀，使RNA難以被進一步純化。 這些因素導致了常規(guī)硫氰酸胍方法提取關(guān)節(jié)軟骨中RNA得率和純度低下，直接影響了后續(xù)的研究工作。中國專利CN101182343動物關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA提取方法，(1)取動物關(guān)節(jié)軟骨組織，立即投入液氮中研磨至粉末狀，每50重量份的關(guān)節(jié)軟骨組織加入1體積變性液(異硫氰酸胍23. 6320重量份，檸檬酸三鈉0.3676重量份，十二烷基肌氨酸鈉0. 25重量份， 加入25重量份三蒸水，定容至50體積)，0. 007體積的β -巰基乙醇，勻漿至無明顯組織塊；(2)將勻漿液置于冰水浴上，加酸性水飽和酚搖勻，加2mol/L濃度醋酸鈉，氯仿、異戊醇混合液(氯仿異戊醇為49 1)，置于冰水浴上15min;(3)4°C下，離心，取上清液，加入氯仿、異戊醇混合液，離心取上清液加入異丙醇，-20°C下沉淀30min，離心30分鐘，得到凝膠狀RNA和蛋白多糖混合沉淀，加入無RNA酶水，溶解沉淀得到膠狀溶液；(4)取膠狀溶液用 plant RNAout試劑盒的RNA提取步驟得到總RNA沉淀，取沉淀，乙醇洗滌二次后用無RNA 酶水溶解沉淀即得關(guān)節(jié)軟骨組織總RNA溶液。申請人實驗發(fā)現(xiàn)，由于軟骨組織在液氮中冷凍以后，非常堅硬，通過研磨而形成的粉末顆粒較大，勻漿至無明顯組織塊，也表明有細顆粒存在，導致仍有相當數(shù)量的軟骨細胞未能被釋放出來，會導致最終的RNA得率相對低下； 其次，采用“得到凝膠狀RNA和蛋白多糖混合沉淀，加入無RNA酶水，溶解沉淀得到膠狀溶液”，會使RNA和大量蛋白多糖形成共沉淀，造成清除混雜其中的蛋白相對困難，使得在最終的RNA樣品中往往有蛋白遺留，這會形成對后續(xù)研究工作的干擾。
上述不足仍有值得改進的地方。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種得率高，高純度的從關(guān)節(jié)軟骨中提取RNA的方法。本發(fā)明目的實現(xiàn)，主要改進一是將軟骨組織低溫冷凍、用粉碎機粉碎，以提高分離軟骨細胞的得率；二是加入聚乙二醇辛基苯基醚后冰浴冷卻提取，以提高分離RNA純度，從而克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，實現(xiàn)本發(fā)明目的。具體說，本發(fā)明從關(guān)節(jié)軟骨中提取RNA的方法， 其特征在于將軟骨組織在-20°C及以下冷凍用粉碎機粉碎成粉末狀；在粉碎的軟骨組織中加入復合變性液制成勻漿，離心收集上清液；加入聚乙二醇辛基苯基醚蛋白變性劑，使其濃度為0. 25-0. 35% V/V，冰浴冷卻，用苯酚-氯仿-異戊醇混合溶劑多次抽提上清液；加入乙酸銨或乙酸鈉，然后用異丙醇或乙醇沉淀RNA ；對沉淀物用RNA純化藥盒進一步純化。在詳細說明前，先通過對發(fā)明能夠達到的基本功能及效果作一介紹，以使本領域技術(shù)人員對本專利總體構(gòu)思技術(shù)方案及達到的基本效果有一個明確了解。本發(fā)明方法，軟骨組織低溫冷凍、粉碎機粉碎，充分利用軟骨組織在冷凍下會變得很硬脆，試驗發(fā)現(xiàn)用粉碎機粉碎，可以使得軟骨組織易于被充分粉碎，克服了研磨存在顆粒的不足，使軟骨細胞得以從基質(zhì)中最大程度釋放出來，有利于提高后續(xù)分離RNA得率，同時在低溫下粉碎相對產(chǎn)生熱量小也易保證RNA不被變性；選擇采用聚乙二醇辛基苯基醚(商品代號Triton X-100)蛋白變性劑并在冰浴中冷卻，有助于粉碎物中各種蛋白進一步充分變性，使得RNA與基質(zhì)糖蛋白等可以更完全分離，有利于蛋白在后續(xù)苯酚_氯仿_異戊醇混合溶劑抽提過程中被充分去除，從而提高了獲取RNA的純度。本發(fā)明中。在-20°C及以下環(huán)境中粉碎，就已經(jīng)可以比較充分將軟骨組織充分粉碎，試驗發(fā)現(xiàn)冷凍溫度越低粉碎效果越好，因此一種更好為采用深度低溫冷凍(例如-80°C及以下)粉碎，例如在充滿液氮的粉碎機中冷凍、充分粉碎。所用冷凍粉碎機，試驗比較較好采用Spex Industries公司產(chǎn)的Spex Freezer Mill粉碎機，可以獲得足夠細度的細粉，使軟骨細胞得以從基質(zhì)中最大程度釋放出來。加入乙酸銨或乙酸鈉，主要是使RNA在鹽度環(huán)境下沉淀。試驗較好加入乙酸銨或乙酸鈉至最終濃度為0. 3-0. 5 M(mol)，可以使RNA在較高鹽濃度中沉淀完全，如果鹽濃度過低，則沉淀會不完全，鹽濃度過高，鹽會與RNA —起沉淀，會影響以后分析。RNA純化藥盒，其作用是進一步純化軟骨RNA樣品溶液，清除仍可能遺留的蛋白， 并縮小體積，最終獲得優(yōu)質(zhì)RNA樣品。雖然現(xiàn)有技術(shù)中RNA純化藥盒都能應用，但經(jīng)試驗比較QIAGEN公司(美國)產(chǎn)的RNeasy RNA純化藥盒，具有較通常RNA純化藥盒更好的純化效果，因而優(yōu)先被采用。此外，為更充分使蛋白變性易于除去，并且保證RNA的完整性，試驗復合變性液更好采用由0. 1-0. 15 M三羥甲基氨基甲烷，pH7. 0-7. 5; 20-25 mM乙二胺四乙酸，pH 7. 0-7.5; 0. 5-0. 6微升/毫升巰基乙醇；3. 5-4. 5 M硫氰酸胍組成的復合硫氰酸胍溶液。本發(fā)明方法中，未特別提及說明的方法、步驟，與現(xiàn)有技術(shù)從動物組織中提取RNA 方法相同，可以直接被應用。
本發(fā)明從關(guān)節(jié)軟骨中提取RNA的方法，相對于現(xiàn)有技術(shù)，由于采用冷凍、粉碎機粉碎，使得軟骨組織易于被充分粉碎，克服了現(xiàn)有技術(shù)采用冷凍研磨的不足，使軟骨細胞得以從基質(zhì)中最大程度釋放出來，從而提高了 RNA得率；加入聚乙二醇辛基苯基醚蛋白變性劑并在冰浴中冷卻，有助于各種蛋白進一步充分變性，使得RNA與基質(zhì)糖蛋白等可以更完全地分離，有利于蛋白在后續(xù)苯酚_氯仿_異戊醇混合溶劑抽提過程中被充分去除，從而提高了獲取RNA的純度。采用本發(fā)明中的復合硫氰酸胍系統(tǒng)處理，使蛋白變性更充分因而更易于除去，并且有利于更好保證RNA的完整性。本發(fā)明方法為高效地從軟骨組織中獲取優(yōu)質(zhì) RNA的提供了有效手段，實驗表明采用本發(fā)明方法獲得的RNA，具有得率高，純度高，其數(shù)量和質(zhì)量都足以用來進行軟骨細胞基因表達的研究，從而為進一步研究軟骨細胞基因的表達提供了基礎，解決了現(xiàn)有技術(shù)從軟骨細胞中提取RNA得率低和純度低的兩大問題。檢測表明采用本發(fā)明方法獲得的RNA，不僅其得率大大高于常規(guī)的提取手段，較常規(guī)方法提高 5 — 8倍，而且提取的RNA具有很高的純度，RNA的260 μ m紫外吸收值/280 μ m紫外吸收值的比值> 2 (表明純度很高)，并且所得RNA的原有特性沒有發(fā)生任何改變。由于動物其他組織的RNA相對較軟骨組織更容易降解，因而提取較軟骨組織中更容易，因此本發(fā)明方法不僅可以用于從軟骨組織中提取RNA，顯然更能用于動物其他組織的RNA提取。以下結(jié)合一個具體實施例，示例性說明及幫助進一步理解本發(fā)明實質(zhì)，但實施例具體細節(jié)僅是為了說明本發(fā)明，并不代表本發(fā)明構(gòu)思下全部技術(shù)方案，因此不應理解為對本發(fā)明總的技術(shù)方案限定，一些在技術(shù)人員看來，不偏離本發(fā)明構(gòu)思的非實質(zhì)性增加和/ 或改動，例如以具有相同或相似技術(shù)效果的技術(shù)特征簡單改變或替換，均屬本發(fā)明保護范圍。


圖1為RNA印跡法試驗凝膠電泳結(jié)果。圖中
A動物(馬)肝臟組織RNA中纖維連接蛋白mRNA模式 B動物(馬)軟骨組織RNA中纖維連接蛋白mRNA模式 C動物(馬)軟骨組織RNA中纖維連接蛋白mRNA模式 D動物(馬)肌肉組織RNA中纖維連接蛋白mRNA模式 E動物(馬)培養(yǎng)軟骨細胞RNA中纖維連接蛋白mRNA模式。圖2為聚合酶鏈式反應(PCR)凝膠電泳結(jié)果。圖中
A以馬軟骨組織RNA為模板鏈式反應擴增出的軟骨組織特有的纖維連接蛋白基因剪切
模式
B以馬肝臟組織RNA為模板鏈式反應擴增出的纖維連接蛋白基因剪切模式 C以馬軟骨組織RNA為模板鏈式反應擴增出的軟骨組織特有的纖維連接蛋白基因剪切
模式
D以馬肌肉組織RNA為模板鏈式反應擴增出的纖維連接蛋白基因剪切模式 E以兔軟骨組織RNA為模板鏈式反應擴增出的軟骨組織特有的纖維連接蛋白基因剪切模式。
具體實施方式
實施例從馬膝關(guān)節(jié)中采集軟骨組織標本，其組織標本被存儲在-80 ° C低溫下待用。1、取約25克軟骨組織標本，置于充滿液氮的粉碎機(Spex Freezer Mill)樣品管中，以最高速度粉碎3次，每次不短于1分鐘。2、取1-2克粉碎后的軟骨組織，加入30-40毫升復合硫氰酸胍溶液，臨時加入巰基乙醇至0. 5-0. 6微升/毫升，高速勻漿(Bio-Gen PR0200勻漿器，10000-15000 rpm速度勻漿3次，每次10秒鐘，在冰浴冷卻10秒鐘，再次勻漿)，低速離心(1500-2000g，10-15分
鐘，4° C)，收集上清液。3、在沉淀物中再次加入30-40毫升復合硫氰酸胍溶液，重復上述勻漿、離心步驟。 合并兩次上清液(最終體積為45-65毫升左右)。4、加入聚乙二醇辛基苯基醚使最終濃度為0. 20-0. 25% V/V，混勻；冰浴中放置 15-30分鐘。加入相同體積的苯酚一氯仿一異戊醇(24 24 1)混合液，充分震蕩均勻，靜置， 取出上清液；重復數(shù)次，直至白色中間層不再存在。5、在上清液中加入乙酸銨或乙酸鈉溶液至終濃度為300_500mM(本例為400mM)， 混勻后在冰浴中放置30-60分鐘，再加入0. 8體積的異丙醇，混勻后再在冰浴中放置30-60 分鐘；高速離心(15000-20000g，30-45分鐘，4° C)。棄去上清液，沉淀物在室溫下空氣干燥 10分鐘。6、在沉淀物中加入RNA純化藥盒(QIAGEN (美國公司)產(chǎn)的RNeasy)中的裂解緩沖液(RLT)，然后按照藥盒所規(guī)定的步驟進一步純化樣品，并溶解RNA樣品。用紫外分光光度計測定所得RNA在260 μ m和280 μ m的紫外吸收值260 μ m吸收值/280 μ m吸收值的比值為2. 2-2. 3，說明RNA純度達到要求。復合硫氰酸胍溶液制備，用0.1-0. 15 M三羥甲基氨基甲烷，用鹽酸調(diào)節(jié) ρΗ7· 0-7. 5; 20-25 mM 乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 7. 0-7. 5; 0. 5-0. 6 微升 / 毫升巰基乙醇 (2-Mercaptoethanol) ；3. 5-4. 5 M 硫氰酸胍(Guanidinium Thiocyanate)，進行勻漿并離心收集的上清液；重復以上步驟兩次，合并所有上清液。比較例用前述常規(guī)Chomczynski方法提取軟骨組織RNA，最終所得RNA純度偏低，260 μ m吸收值/280 μ m吸收值為1. 6-1. 8。兩者比較，本發(fā)明方法較常規(guī)方法得率提高6倍。按例1方法分別提取馬肝臟組織、肌肉組織、培養(yǎng)軟骨細胞的RNA。以本發(fā)明方法提取的5種RNA，進行RNA印跡法試驗，結(jié)果如圖1，由圖顯示5種 RNA中的mRNA非常完整，表明本發(fā)明方法提取的RNA沒有任何性質(zhì)上的改變；再以本發(fā)明方法制備的5種RNA為模板，進行聚合酶鏈式反應(PCR)；由圖2照片每個樣品中都沒有觀察到混雜的背景，充分證明提取的RNA具有很高的純度。通過對聚合酶鏈式反應產(chǎn)物的分析，發(fā)現(xiàn)了一種新的纖維連接蛋白基因在軟骨組織中特有的剪切模式，證明本方法制備的優(yōu)質(zhì)RNA在后續(xù)的軟骨細胞基因表達的研究中所起的重要作用。對于本領域技術(shù)人員來說，在本專利構(gòu)思及具體實施例啟示下，能夠從本專利公開內(nèi)容及常識直接導出或聯(lián)想到的一些變形，本領域普通技術(shù)人員將意識到也可采用其他方法，或現(xiàn)有技術(shù)中常用公知技術(shù)的替代，以及特征的等效變化或修飾，特征間的相互不同組合，例如復合變性液改變，例如在復合液中增或減少個別成份，或采用現(xiàn)有技術(shù)中的復合變性液，粉碎機的改變，冷凍溫度的改變，提純試劑藥盒品種的改變，等等的非實質(zhì)性改動， 同樣可以被應用，都能實現(xiàn)本專利描述功能和效果，不再一一舉例展開細說，均屬于本專利保護范圍。
權(quán)利要求
1.從關(guān)節(jié)軟骨中提取RNA的方法，其特征在于將軟骨組織在-20°c及以下冷凍用粉碎機粉碎成粉末狀；在粉碎的軟骨組織中加入復合變性液制成勻漿，離心收集上清液；加入聚乙二醇辛基苯基醚蛋白變性劑，使其濃度為0. 25-0. 35% V/V，冰浴冷卻，用苯酚-氯仿-異戊醇混合溶劑多次抽提上清液；加入乙酸銨或乙酸鈉，然后用異丙醇或乙醇沉淀 RNA ；對沉淀物用RNA純化藥盒進一步純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述從關(guān)節(jié)軟骨中提取RNA的方法，其特征在于冷凍為在液氮中進行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述從關(guān)節(jié)軟骨中提取RNA的方法，其特征在于粉碎用粉碎機為 Spex Industries 公司產(chǎn)的 Spex Freezer Mill 粉碎機。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述從關(guān)節(jié)軟骨中提取RNA的方法，其特征在于復合變性液為由0.1-0. 15 M三羥甲基氨基甲烷，pH7. 0-7. 5; 20-25 mM乙二胺四乙酸，pH 7.0-7.5; 0. 5-0. 6微升/毫升巰基乙醇；3. 5-4. 5 M硫氰酸胍組成的復合硫氰酸胍溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述從關(guān)節(jié)軟骨中提取RNA的方法，其特征在于RNA純化藥盒為 QIAGEN 產(chǎn)的 Rneasy。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述從關(guān)節(jié)軟骨中提取RNA的方法，其特征在于加入乙酸銨或乙酸鈉至最終濃度為0. 3-0. 5M。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5或6所述從關(guān)節(jié)軟骨中提取RNA的方法，其特征在于所得 RNA的260 μ m紫外吸收值/280 μ m紫外吸收值的比值彡2。
全文摘要
本發(fā)明是對從關(guān)節(jié)軟骨中提取RNA方法的改進，其特征是將軟骨組織在-20℃及以下冷凍用粉碎機粉碎成粉末狀；在粉碎的軟骨組織中加入復合變性液制成勻漿，離心收集上清液；加入聚乙二醇辛基苯基醚蛋白變性劑，使其濃度為0.25-0.35%V/V，冰浴冷卻，用苯酚-氯仿-異戊醇混合溶劑多次抽提上清液；加入乙酸銨或乙酸鈉至最終濃度為0.3M，然后用異丙醇或乙醇沉淀RNA；對沉淀物用RNA純化藥盒進一步純化。本發(fā)明方法從關(guān)節(jié)軟骨中獲得的RNA，得率高，純度高，數(shù)量和質(zhì)量都足以進行軟骨細胞基因表達研究，得率較常規(guī)方法提高5－8倍，RNA260μm紫外吸收值/280μm紫外吸收值比值≥2，具有很高純度，并RNA原有特性沒有發(fā)生任何改變，解決了現(xiàn)有技術(shù)從軟骨細胞中提取RNA得率低和純度低的兩大問題。
文檔編號C12N15/10GK102250887SQ20111022585
公開日2011年11月23日 申請日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者劉軍, 李則孝, 王平, 顧大年, 顧烽 申請人:劉軍, 王平, 顧烽