專利名稱：一種山梨糖還原酶在生物法制備(s)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種山梨糖還原酶，特別涉及該山梨糖還原酶在通過生物方法生產(chǎn)(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
(S)-4-氯-3 羥基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate, (S) -CHBE) 是一種重要的有機(jī)中間體，可用于很多活性藥物的合成，如他汀類藥物——羥甲基戊二酰 CoA(HMG-CoA)還原酶抑制劑和4-羥基吡啶烷酮(4-hydroxypyrrolidone)等[1]。以4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetate Ethyl C0BE)作為還原反應(yīng)的潛手性底物，易于合成且價(jià)格低廉，以其為底物進(jìn)行不對稱還原反應(yīng)獲取(S)-CHBE是非常經(jīng)濟(jì)有效的制備途徑。迄今為止關(guān)于COBE不對稱還原制備手性CHBE已進(jìn)行了很多的研究報(bào)道。概括起來主要有化學(xué)法和生物法。化學(xué)催化不對稱還原法，所用催化劑包括價(jià)格昂的貴銠、釕等金屬，采用化學(xué)法合成手性CHBE的缺點(diǎn)是產(chǎn)物的光學(xué)純度不夠高，且催化還原反應(yīng)需要很高的氫氣壓，耗能高，污染大。生物法分為酶催化和全細(xì)胞催化法，Shimi zu等用來自Sporobolomyces salmonicoIorAKU 4429的NADPH依賴的醛基還原酶分別在單一水相體系[2]和水/有機(jī)溶劑兩相體系[3]催化還原COBE制備手性CHBE，由于應(yīng)用酶催化還原反應(yīng)所用的酶要從微生物細(xì)胞中分離純化得到，過程操作繁瑣且酶容易失活，與全細(xì)胞催化相比，應(yīng)用較少。 全細(xì)胞法則分為采用野生酵母和基因工程菌催化COBE為(S) — CHBE兩種，Yasohara等 [4]從400株酵母菌中篩選得到了一株Omdida 卵Wiae，在水/乙酸正丁酯體系中， 在添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脫氫酶以及反應(yīng)過程中需要控制pH值的條件下產(chǎn)物(S)-CHBE在有機(jī)相的積累濃度可達(dá)90 g/L，產(chǎn)物的光學(xué)純度對映體過量值(enantiomeric excess e. e)達(dá)到96%。由于采用野生酵母中往往含有多種能夠催化COBE為不同構(gòu)型CHBE 的還原酶，因此采用野生酵母進(jìn)行催化所獲得的產(chǎn)物的光學(xué)活性往往很低，需要篩選到高立體選擇性的優(yōu)良微生物菌株非常困難，所以近來的研究著重集中于運(yùn)用重組大腸桿菌不對稱合成具有高立體選擇性的(S)-CHBE。Yasohara等[5]從木蘭假絲酵母菌Candida magnoliae中分離得到了一個輔酶NADPH依賴型的羰基還原酶，將該酶與葡萄糖脫氫酶基因克隆到大腸桿菌中共表達(dá)，在定時添加適量的輔酶NADP和葡萄糖以及分批添加底物的條件下，催化COBE的不對稱還原(S) -CHBE,其得率和光學(xué)純度分別為85%和100%e. e. [6]。綜上所述，現(xiàn)有催化COBE為(S) -CHBE的技術(shù)存在底物得率低、產(chǎn)物光學(xué)活性底、 成本高等問題。本專利中涉及到的還原酶是山梨糖還原酶的一種，其包含281個氨基酸，其 Genbank 巾白勺 & i # 力 XP_715552. 1， (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/XP—715552. 1)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。編碼該蛋白的基因含有843bp堿基 ，^^ Genbank 巾白勺力 ΕΑΚ96529. 1， (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/ EAK96529)，其基因序列如SEQ ID NO :1所示。至今未發(fā)現(xiàn)該山梨糖還原酶用于COBE不對稱還原制備(S)-CHBE的報(bào)道。參考文獻(xiàn)
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種山梨糖還原酶在COBE不對稱還原制備 (S)-CHBE中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所釆用的技術(shù)方案如下
一種氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的山梨糖還原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯((S)-CHBE)中的應(yīng)用。即以氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的山梨糖還原酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。具體反應(yīng)是將表達(dá)基因序列如SEQ ID N0:1所示的重組菌，1.5 300g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯，在ρΗ6. (Γ7. 5、2(T30°C、18(T280rpm條件下，分別與200mmol/L 2mol/L山梨醇、甘露醇、木糖醇，反應(yīng)16 20h，得到(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。其中，加入糖醇可生成 NADPH，且使反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，降低了加入量以減少了生產(chǎn)成本。發(fā)明人基于現(xiàn)代生物 信息學(xué)思想，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，采用基因工程的手段從白色念珠菌Candida a從ica/^克隆山梨糖還原酶的基因，在大腸桿菌中表達(dá)后發(fā)現(xiàn)其在水相中能夠高效的催化COBE為⑶-CHBE，e. e值為100%。同時，通過在水/有機(jī)相中反應(yīng)、 分批添加底物COBE等方式，解除了底物和產(chǎn)物對細(xì)胞和酶的抑制作用，顯著的提高了轉(zhuǎn)化效果。通過對山梨糖還原酶的基因進(jìn)行重組表達(dá)，獲得了具有新型催化功能的酶蛋白，開發(fā)了該條基因的新功能——催化非天然底物COBE為高立體選擇性的(S)-CHBE。有益效果本發(fā)明首次將氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的山梨糖還原酶應(yīng)用于 COBE不對稱還原制備(S)-CHBE中，取得很好的效果，其酶活高達(dá)5. 6U/mg。氨基酸序列如 SEQ ID NO 2所示的山梨糖還原酶對底物COBE的得率高(大于90%)、產(chǎn)物CHBE的光學(xué)活性高(e.戰(zhàn)為100%)，且產(chǎn)量高，大大降低了生產(chǎn)成本。


圖1為山梨糖還原酶基因的構(gòu)建圖。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1
步驟一、山梨糖還原酶基因的獲取
白色念珠菌 Candida albicansi^^ Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversiry Centre)，培養(yǎng)基YPD (g ·廠1)酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖 20g，補(bǔ)蒸餾水至1L。將白色念珠菌Candida a從icaas接種于5mLYPD液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用基因組DNA提取試劑盒(北京天為生物工程有限公司酵母基因組提取試劑盒) 提取基因組。構(gòu)建表達(dá)載體所用的引物加設(shè)酶切位點(diǎn)，引物序列如下
上游引物(SOUl-sense 含 NdeI)為5，- GGAATTCCATATGATGAGTGAAGAAATCATTTCA -3， 下游引物(SOUl-anti 含 EcoRI)為5，- CCGGAATTCTTATGGACATGTATAACCCCCAT -3， 所有引物均由美吉生物公司合成。基因的PCR條件
94 °C變性7 min，按如下參數(shù)循環(huán)30次94 °C變性1 min，60 °C退火50 s，72 ！延伸 1. 5 min。最后 72 °C延伸 10 min。步驟二、基因的表達(dá)用Nde I及EcoRI分別酶切pE T_22b (pET_22b購于Novagen (默克中國))及所擴(kuò)增含有兩個酶切位點(diǎn)的目的基因，分別膠回收已雙酶切的目的片段和表達(dá)載體，將已雙酶切的表達(dá)載體pET-22b與目的基因用T4連接酶進(jìn)行連接過夜，將IOuL的連接產(chǎn)物pET-22b-S0Ul加入IOOuL的Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min，42°C熱激 90sec。冰上放置2min。加入預(yù)熱的0. 45mL培養(yǎng)基。220rpm 37°C Ih0將200uL菌液加入分別含有ΙΟΟμ g/mL的氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)12— 16h。構(gòu)建圖譜見圖1。步驟三、酶活的測定
挑取重組菌萬.co/iRosseta (pET_22b_S0Ul)及出發(fā)大腸桿菌Rosseta (DE3)至含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。然后按2 %接種量分別接種到新鮮培養(yǎng)液中， 37 °C培養(yǎng)至OD600約為0. 6時，加入IPTG至終濃度0. 8 mmol · Γ1，25°C，220rpm，誘導(dǎo)表達(dá) 10 h后，離心(4°C，5000rpm，15min)，菌泥用IOOmM磷酸鉀緩沖(ρΗ7. 0)重懸，超聲破碎細(xì)胞(功率300W,超聲5s，間歇5s，共5min)，離心(4°C，12000rpm, 15min)，測定上清中的酶活。酶反應(yīng)體系包括IOOmM 磷酸鉀緩沖液(pH6. 0)，5mM NADPH，2OmM C0BE,30°C, 340nm處測定吸光值的下降。酶活定義為每分鐘內(nèi)氧化1 μ mol NADPH所需要的酶量為一個酶活單位U。蛋白采用Brandford法進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，出發(fā)大腸桿菌Rosseta (DE3)的比酶活為0. 12U/mg，而重組菌E. coli Rosseta (pET22b_S0Ul)的比酶活為 5. 6U/mg。
步驟四、重組大腸桿菌萬.co/i Rosseta (pET22b_S0Ul)的發(fā)酵挑取重組菌五co/iRosseta (pET_22b_ S0U1)至含抗生素的LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。然后按2 %接種量分別接種到新鮮培養(yǎng)液中，37 °C培養(yǎng)至OD6tltl約為0.6時，加入 IPTG 至終濃度 0.8 mmol .L-1JSOJZOrpm,誘導(dǎo)表達(dá) 10 h 后，8000 rpm,4 °C 離心 10 min,
棄上清，沉淀備用。步驟五、取上述沉淀用磷酸鉀緩沖(100 mmol -L-l, pH 6. 5)洗滌兩次，稱取0. 5g (濕重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于總體系25 mL的反應(yīng)液中(pH 6.5磷酸鉀緩沖與醋酸丁酯體積比為 1:1)。加入山梨醇 1300mmol/L，C0BE 200g/L，30°C，180rpm，16h。產(chǎn)物(S)-CHBE 的產(chǎn)量為180g/L，產(chǎn)物的得率為90%，光學(xué)純度e.⑷為100%。產(chǎn)物的檢測方法
對于水相反應(yīng)反應(yīng)結(jié)束后，8000 rpm離心10 min分離有機(jī)層和水層。小心吸取上層乙酸乙酯過有機(jī)膜，加入內(nèi)標(biāo)，保存測樣。對于水/有機(jī)兩相反應(yīng)反應(yīng)結(jié)束后8000 rpm離心10 min分離有機(jī)層和水層。 小心吸取上層乙酸乙酯過有機(jī)膜，加入內(nèi)標(biāo)，保存測樣。PEG-20M毛細(xì)管柱，內(nèi)標(biāo)物為萘。程序?yàn)闄z測器FID，溫度210°C，汽化室溫度 210°C，柱溫 150°C，柱頭壓 0. 03MPa，氫氣 0. 05MPa，空氣 0. IMPa,尾吹 0. 08MPa。用 HPLC 對⑶-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的旋光性進(jìn)行分析(手性柱Chiralcel 0B, 4. 6X250mm; Daicel Chemical Industries,日本)，檢測條件流動相為正己烷正己烷(9 1)，波長 214nm，流量為0. 8mL/min,，R型禾口 S型CHBE的出峰時間分別為10. 5min禾口 11. 6min。
實(shí)施例2
如實(shí)施例1步驟一至步驟四，制備得沉淀備用，取上述沉淀用磷酸鉀緩沖(100 mmol -L-1, pH 6. 5)洗滌兩次，稱取0. 5g (濕重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于總體系25 mL的反應(yīng)液中(pH 6. 5磷酸鉀緩沖與醋酸丁酯體積比為1:1)。加入甘露醇1300mmol/L，COBE 200g/L，30°C，180rpm，16h。產(chǎn)物(S)-CHBE 的產(chǎn)量為 185g/L，產(chǎn)物的得率為92. 5%，光學(xué)純度e. 6%為100%。產(chǎn)物的檢測方法同實(shí)施例1 實(shí)施例3
如實(shí)施例1步驟一至步驟四，制備得沉淀備用，取上述沉淀用磷酸鉀緩沖(100 mmol -L-1, pH 6. 5)洗滌兩次，稱取0. 5g (濕重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于總體系25 mL的反應(yīng)液中(pH 6. 5磷酸鉀緩沖與醋酸丁酯體積比為1:1)。加入木糖醇1300mmol/L，COBE 200g/L，30°C，180rpm，16h。產(chǎn)物(S)-CHBE的產(chǎn)量為130g/L，產(chǎn)物的得率為:65%，光學(xué)純度 e. e% 為 100%。產(chǎn)物的檢測方法同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.一種山梨糖還原酶在生物法制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用，其特征在于以氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的山梨糖還原酶為催化劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以NADPH為輔因子，不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于表達(dá)基因序列如SEQID NO :1所示的重組菌，與200mmol/L 2mol/L糖醇、1. 5 300g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯，在pH6. 0 7. 5、2(T30°C、 18(T280rpm條件下反應(yīng)16 20h，得到(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述糖醇為山梨醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述糖醇為甘露醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述糖醇為木糖醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種山梨糖還原酶在生物法制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。即以氨基酸序列如SEQIDNO2所示的山梨糖還原酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以NADPH為輔因子，不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。本發(fā)明首次將氨基酸序列如SEQIDNO2所示的山梨糖還原酶應(yīng)用于4-氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中，取得很好的效果，其酶活高達(dá)5.6U/mg，其對底物的得率高達(dá)90%、產(chǎn)物的對映體過量值為100％，且產(chǎn)量高，大大降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12R1/19GK102286556SQ201110225388
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者嚴(yán)明, 安明東, 李艷, 歐陽平凱, 蔡萍, 許晟, 許琳, 郝寧 申請人:南京工業(yè)大學(xué)