專利名稱：具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白及編碼基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬傳染性胸膜肺炎是由放線桿菌(A. pleuropneimoniae、驗(yàn)輕，是豬的一種高度接觸傳染性、致死性呼吸道傳染病。自1957年由英國(guó)人I^ttison等首次報(bào)道，至20世紀(jì)80年代己在世界各地廣泛流行。近年來(lái)國(guó)際公認(rèn)其為危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，在美國(guó)、丹麥、瑞士本病被列為主要豬病之一。隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)?；⒓s化的發(fā)展，本病的發(fā)生呈爆發(fā)趨勢(shì)，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害日益嚴(yán)重。發(fā)病率視各地的管理和所采取的預(yù)防措施不同，但一般較高(8. 5%—100%)，死亡率根據(jù)環(huán)境和菌株毒力不同，可在0. 4%—100%之間。 近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究及臨床實(shí)踐表明，豬患呼吸系統(tǒng)疾病時(shí)，容易發(fā)生繼發(fā)感染或混合感染。如本病與豬偽狂犬病、蘭耳病、豬肺疫、豬支原體肺炎等病的混合感染，危害更加嚴(yán)重這也是近年來(lái)該病呈現(xiàn)的最主要的流行方式。我國(guó)1987年由哈爾濱獸醫(yī)研究所首次報(bào)道該病，以后陸續(xù)在許多省市發(fā)生本病。據(jù)報(bào)道1999發(fā)病率40%，死亡率10%，2000年發(fā)病率 75%，死亡率2%，2003年發(fā)病率10份80%，死亡率6%—20%，2006年多洛陽(yáng)地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，陽(yáng)性率為30. 39%, 2009年，對(duì)四川部分地區(qū)的非免疫豬進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，陽(yáng)性率為18.5%。給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。病原為胸膜肺炎放線桿菌(ActinobacillusPleuropeumoniae，APP)。APP 血清型多達(dá)15個(gè)，其中生物I型中的1、5、9、10、11五種血清型致病力最強(qiáng)。我國(guó)發(fā)現(xiàn)或流行的血清型有1、2、3、4、5、7、8、9、10等型。由于主要血清型之間無(wú)有效的交叉免疫保護(hù)，嚴(yán)重制約了多價(jià)疫苗的開發(fā)研究，因而使得本病的預(yù)防變得非常困難。目前我國(guó)使用豬胸膜肺炎放線桿菌三價(jià)滅活疫苗預(yù)防豬傳染性胸膜肺炎，對(duì)部分血清型具有一定的保護(hù)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供在胸膜肺炎放線桿菌感染和免疫過(guò)程中能夠刺激特異性免疫應(yīng)答，并且能夠產(chǎn)生免疫保護(hù)功能的異源蛋白的具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白及編碼基因的應(yīng)用。本發(fā)明具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因的核苷酸序列是SEQ ID NO 1, SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6。本發(fā)明具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的氨基酸殘基序列是SEQ ID NO :7, SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10, SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12。本發(fā)明所述SEQ ID NO =USEQ ID NO SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO 6的基因載體。本發(fā)明所述SEQ ID NO =USEQ ID NO SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO 6的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。本發(fā)明所述SEQ ID NO =USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO 6的宿主菌。表達(dá)本發(fā)明具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的方法是將含有SEQ ID NO 1, SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 編碼具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白。本發(fā)明所述表達(dá)具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的方法是用于構(gòu)建含有SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6所述編碼具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因的重組大腸桿菌表達(dá)載體的出發(fā)載體為 PGEX-PA3-SSDB、pGEX_PA4_PSPA、pGEX_PA6_GAPDH、pGEX_PA7_PK、pGEX-PA8_SHMT 禾口 pGEX-PA9-AST0本發(fā)明所述表達(dá)具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的方法以 PGEX-4T-1為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有編碼具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因的大腸桿菌表達(dá)載體為 pGEXPA3-SSDB-DE3、pGEXPA4_PSPA_DE3、pGEXPA6_GAPDH_DE3、 pGEXPA7-PK-DE3、pGEXPA8-SHMT-DE3 和 pGEXPA9_AST_DE3。本發(fā)明具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白在制備胸膜肺炎放線桿菌疫苗以及其它生物制品中的應(yīng)用。本發(fā)明編碼具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因在制備胸膜肺炎放線桿菌核酸疫苗及其它生物制品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌異源蛋白及其編碼基因。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的蛋白在胸膜肺炎放線桿菌的感染和免疫過(guò)程中能夠刺激特異性體液免疫反應(yīng)，并且能夠產(chǎn)生免疫保護(hù)作用?？梢员景l(fā)明的蛋白或基因?yàn)榛钚猿煞种苽湫啬し窝追啪€桿菌疫苗。本發(fā)明為尋找胸膜肺炎放線桿菌具有免疫保護(hù)功能的蛋白提供了一種新手段， 將在豬傳染性胸膜肺炎的防治中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。


圖 1 是構(gòu)建表達(dá)載體 PGEX-PA3、pGEX_PA4、pGEX_PA6、pGEX_PA7、pGEX_PA8 和 PGEX-PA9的雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖譜；
其中M1、M2分別為D2000分子量標(biāo)準(zhǔn)和D15000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3、4、5和6號(hào)泳道分別依次對(duì)應(yīng)六個(gè)載體。圖2是表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)并純化后的六個(gè)蛋白PA3-SSDB、PA4-PSPA、PA6-GAPDH、 PA7-PK、PA8-SHMT 和 PA9-AST 的 SDS-PAGE 電泳圖譜；
M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1、2、3、4、5和6號(hào)泳道分別依次對(duì)應(yīng)六個(gè)蛋白。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所提供的具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌異源蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一(氨基酸殘基序列來(lái)源于痤瘡丙酸桿菌分離株S14):SEQ ID NO :1(PA3-SSDB)、SEQ ID NO 2 (PA4-PSPA)、SEQ ID NO :3 (PA6-GAPDH)、SEQ ID NO :4 (PA7-PK)、SEQ ID NO :5 (PA7-SHMT)、的 SEQ ID NO :6 (PA7-AST)；
SEQ ID NO 1由185個(gè)氨基酸殘基組成。SEQ ID NO :2由268個(gè)氨基酸殘基組成。SEQID NO 3由336個(gè)氨基酸殘基組成。SEQ ID NO 4由478個(gè)氨基酸殘基組成。SEQ ID NO 5由492個(gè)氨基酸殘基組成。SEQ ID NO 6由371個(gè)氨基酸殘基組成。編碼上述具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一 SEQ ID NO 7 (PA3-SSDB)、SEQ ID NO 8 (PA4-PSPA)、SEQ ID NO 9 (PA6-GAPDH)、 SEQ ID NO 10 (PA7-PK)、SEQ ID NO :11 (PA7-SHMT)、SEQ ID NO :12 (PA7-AST)；
SEQ ID NO 7由555個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架為自5、端第1-第555位堿基，編碼具有中SEQ ID NO :1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。SEQ ID NO :8由804個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架為自5、端第1-第804位堿基，編碼具有SEQ ID NO :2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。SEQ ID NO 9由1008個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架為自5、端第1-第1008位堿基， 編碼具有SEQ ID NO :3的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。SEQ ID NO 10由1434個(gè)堿基組成， 其開放閱讀框架為自5、端第1-第1434位堿基，編碼具有SEQ ID NO :4的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。SEQ ID NO :11由1476個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架為自5、端第1-第1476位堿基，編碼具有SEQ ID NO :5的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。SEQ ID NO :12由1113個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架為自5、端第1-第1113位堿基，編碼具有SEQ ID NO 6的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體。含有本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。含有本發(fā)明基因的宿主菌。本發(fā)明所提供的表達(dá)具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌異源蛋白的方法，是將含有編碼具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌異源蛋白的相應(yīng)基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)表達(dá)從而獲得具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌異源蛋白。所述宿主可為任一可表達(dá)外源基因的原核或真核細(xì)胞，如大腸桿菌、酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。所述大腸桿菌可為E. coli DH5a。、E. coli BL21、E. coli ΤορΙΟ,Ε. coli JM109、 E.coli BLR, Ε. coli BLR(DE3)等。所述真核細(xì)胞可為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞等，包括C0S-7、CH0、 BHK-2UC0S2. 7、VeroE6、HeLa、HEK293 和酵母細(xì)胞等。用于構(gòu)建含有上述編碼具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因的重組大腸桿菌表達(dá)載體的出發(fā)載體為pGEX-PA3-SSDB、pGEX_PA4_PSPA、pGEX_PA6_GAPDH、 PGEX-PA7-PK、pGEX-PA8-SHMT 和 pGEX_PA9_AST。以pGEX-4T-l為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有編碼具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌異源蛋白的基因的大腸桿菌表達(dá)載體可為PGEX-PA3、pGEX-PA4、pGEX_PA6、pGEX_PA7、 pGEX-PA8、pGEX-PA9。上述重組表達(dá)載體和表達(dá)菌株或細(xì)胞系均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。培養(yǎng)含有編碼具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌異源蛋白的基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。其中，培養(yǎng)所述重組大腸桿菌宿主時(shí)需加入誘導(dǎo)劑，如IPTG等，所加入IPTG的濃度可為0. 01-5. 0mM/L，優(yōu)選為1. OmM/ L;所述誘導(dǎo)溫度可為15-42°C，優(yōu)選為37°C ；所述誘導(dǎo)時(shí)間可為2_8小時(shí)，優(yōu)選為4小時(shí)。本發(fā)明具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌異源蛋白可用于制備胸膜肺炎放線桿菌亞單位疫苗，編碼該蛋白的基因可用于制備胸膜肺炎放線桿菌核酸疫苗。需要的時(shí)候，以具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌異源蛋白制備的胸膜肺炎放線桿菌亞單位疫苗或核酸疫苗中還可以融入顆粒白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、 干擾素一 Y (IFN- Y )、白介素2 (IL-2)、TGF- β 4等一種或多種細(xì)胞因子或微生物的成分 (CpG，脂質(zhì)A，霍亂毒素，脂蛋白，大腸桿菌不耐熱腸毒素)作為免疫佐劑。本發(fā)明的疫苗可以制成注射液、微球體、干粉針劑或氣霧劑等多種劑型。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。上述核酸疫苗和亞單位疫苗的用量可采用藥學(xué)領(lǐng)域中核酸疫苗和亞單位疫苗的常規(guī)劑量，并可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的篩選
用下述方法篩選具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白，具體過(guò)程包括以下步
驟
對(duì)本室分離鑒定并保存的PAS14分離株，培養(yǎng)7 收集菌體。取本室保存的胸膜肺炎放線桿菌血清1型(CVCC259)、血清5型(CVC(^63)菌種，培養(yǎng)Mi后收集菌體，將制備好的菌體樣品作為蛋白樣品。常規(guī)方法對(duì)痤瘡丙酸桿菌蛋白進(jìn)行二維電泳，方法參照GE公司 2DE Manual0痤瘡丙酸桿菌與胸膜肺炎放線桿菌共同抗原蛋白的質(zhì)譜鑒定。制備樣品質(zhì)譜檢測(cè)，方式正離子，反射檢測(cè)，基質(zhì)為HCCA (5ml/mL)。獲取PMF圖譜，與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后獲得報(bào)告數(shù)據(jù)。比對(duì)后得到報(bào)告數(shù)據(jù)蛋白序列，比對(duì)NCBI數(shù)據(jù)得到6個(gè)假定核酸序列。對(duì)假定序列兩端設(shè)計(jì)引物，PCR方法擴(kuò)增出6個(gè)核酸片段，測(cè)序獲得核苷酸序列。具有異源免疫功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化
用下述原核表達(dá)的方法獲得具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白，具體方法為利用位點(diǎn)特異性重組，通過(guò)限制性酶切克隆技術(shù)，將具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白相應(yīng)基因編碼序列(PA3-SSDB、PA4-PSPA、PA6-GAPDH、PA7-H(、PA8-SHMT 和 PA9-AST) 克隆入表達(dá)載體PGEX-4T-1 (GE公司)，得到具有免疫保護(hù)功能的鼠疫菌蛋白的原核表達(dá)載體(分別命名為 pGEX-PA3-SSDB、pGEX_PA4_PSPA、pGEX_PA6_GAPDH、pGEX_PA7_PK、 PGEX-PA8-SHMT和pGEX-PA9-AST)。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑取PCR鑒定陽(yáng)性的單克隆，接種至5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C、150rpm培養(yǎng)12小時(shí)，然后按 1:100的比例接種于200mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、150rpm下振蕩培養(yǎng)，待0. D600=0. 8 時(shí)，加入IPTG (終濃度為ImM/L)，37°C誘導(dǎo)4小時(shí)。離心收集菌體，重懸于7mL細(xì)菌裂解液 (50mM/L NaH2P04,300mM/L NaCI，10mM/L咪唑pH=8)。超聲波裂解儀裂解細(xì)胞，通過(guò)高速低溫冷凍離心機(jī)IOOOOrpm離心30分鐘，將上清與沉淀分開，SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)形式。以GST-S印horose 4B親和層析柱純化相應(yīng)蛋白，以包涵體形式表達(dá)的蛋白以包涵體復(fù)性液稀釋(0. 1M/L Tris. Cl, ImM/L EDTA, 1M/L Urea, 0. 25mM/L GSSG, 2mM/L GSH, 0.4M/L L-Arg,pH=8)復(fù)性。用12%SDS — PAGE檢測(cè)表達(dá)蛋白的純化效果，經(jīng)表達(dá)獲得了純度較高的約46. 4KD、55. 5KD、61. 9KD、77. 7KD、76. 1KD、65. 2KD的具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白。具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白對(duì)小鼠感染胸膜肺炎放線桿菌血清1、5 型的免疫保護(hù)。ICR小鼠購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄各半，體重18_22g。按常規(guī)免疫程序免疫小鼠。每組10只。免疫組免疫表達(dá)蛋白每只劑量20ug溶于0. Iml生理鹽水，加等提及的弗氏完全佐劑，腹腔注射進(jìn)行首免。14天后按IOug每只劑量加弗氏不完全佐劑腹腔注射進(jìn)行二免。二免后14天斷尾采血，檢測(cè)抗體效價(jià)，并進(jìn)行胸膜肺炎放線桿菌血清1、5型感染實(shí)驗(yàn)。胸膜肺炎放線桿菌血清1型攻毒每只8. OX IO7CFU,胸膜肺炎放線桿菌血清5型攻毒每只5. 1X106CFU。每6小時(shí)觀察小鼠死亡情況，連續(xù)觀察7天。小鼠免疫共同抗原蛋白 PA3-SSDB、PA4-PSPA、PA6-GAPDH、PA7-H(、PA8-SHMT 和 PA9-AST 后，對(duì)胸膜肺炎放線桿菌血清1型感染保護(hù)率分別達(dá)80%、50%、20%、30%、50%和30% ；對(duì)胸膜肺炎放線桿菌血清5型感染保護(hù)率分別達(dá)60%、40%、40%、30%、40%和10%。小鼠免疫痤瘡丙酸桿菌蛋白 PA3-SSDB、PA4-PSPA、PA6-GAPDH、PA7-PK、PA8-SHMT 和 PA9-AST 后對(duì)其特異性抗體水平達(dá) 14000、11200、60、1200、4020 和 720。具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白與滅活胸膜肺炎放線桿菌血清5、1型混合免疫對(duì)小鼠感染胸膜肺炎放線桿菌血清1、5型的免疫保護(hù)。ICR小鼠購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄各半，體重18_22g。按常規(guī)免疫程序免疫小鼠。每組10只。免疫組免疫痤瘡丙酸桿菌PA3-SSDB、PA4-PSPA、PA6-GAPDH、 PA7-PK、PA8-SHMT和PA9-AST蛋白每只劑量20ug和0. 2%甲醛滅活胸膜肺炎放線桿菌血清 1型(8. OX IO8CFU)或5型(5. IX IO7CFU)溶于0. Iml生理鹽水，加等提及的弗氏完全佐劑， 腹腔注射進(jìn)行首免。14天后按IOug每只劑量加弗氏不完全佐劑腹腔注射進(jìn)行二免。二免后14天進(jìn)行胸膜肺炎放線桿菌血清1、5型感染實(shí)驗(yàn)。胸膜肺炎放線桿菌血清1型攻毒免疫了痤瘡丙酸桿菌 PA3-SSDB、PA4-PSPA、PA6-GAPDH、PA7-H(、PA8-SHMT 和 PA9-AST 蛋白和滅活胸膜肺炎放線桿菌血清5型的小鼠，每只8. OX IO7CFU,胸膜肺炎放線桿菌血清5型攻毒免疫了痤疫丙酸桿菌 PA3-SSDB、PA4-PSPA、PA6-GAPDH、PA7-PK、PA8-SHMT 和 PA9-AST 蛋白和滅活胸膜肺炎放線桿菌血清1型的小鼠，每只5. 1X106CFU。每6小時(shí)觀察小鼠死亡情況， 連續(xù)觀察7天。小鼠免疫痤瘡丙酸桿菌PA3-SSDB、PA4-PSPA、PA6-GAPDH、PA7-H(、PA8-SHMT 和PA9-AST和滅活胸膜肺炎放線桿菌血清5型后，對(duì)胸膜肺炎放線桿菌血清1型感染保護(hù)率分別達(dá)80%、70%、70%、50%、50%和30% ；小鼠免疫痤疫丙酸桿菌PA3-SSDB、PA4-PSPA、 PA6-GAPDH、PA7-PK、PA8-SHMT和PA9-AST和滅活胸膜肺炎放線桿菌血清1型后，對(duì)胸膜肺炎放線桿菌血清5型感染保護(hù)率分別達(dá)70%、40%、50%、50%、50%和60%。
權(quán)利要求
1.一種編碼具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列是SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6ο
2.權(quán)利要求1中基因編碼的具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白，其特征在于其氨基酸殘基序列是:SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12。
3.含有權(quán)利要求1所述基因的基因載體。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
5.含有權(quán)利要求1所述基因的宿主菌。
6.表達(dá)權(quán)利要求2所述具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的方法，其特征在于將含有權(quán)利要求1所述編碼具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述表達(dá)具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的方法， 其特征在于用于構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述編碼具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因的重組大腸桿菌表達(dá)載體的出發(fā)載體為pGEX-PA3-SSDB、pGEX_PA4_PSPA、 PGEX-PA6-GAPDH、pGEX_PA7_PK、pGEX-PA8_SHMT 和 pGEX_PA9_AST。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述表達(dá)具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的方法，其特征在于以PGEX-4T-1為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有編碼具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因的大腸桿菌表達(dá)載體為pGEXPA3-SSDB-DE3、pGEXPA4_PSPA_DE3、 PGEXPA6-GAPDH-DE3、pGEXPA7_PK_DE3、pGEXPA8-SHMT_DE3 和 pGEXPA9_AST_DE3。
9.權(quán)利要求2所述的具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白在制備胸膜肺炎放線桿菌疫苗以及其它生物制品中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述編碼具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因在制備胸膜肺炎放線桿菌核酸疫苗及其它生物制品中的應(yīng)用。
全文摘要
一種具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白及編碼基因的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是提供在胸膜肺炎放線桿菌感染和免疫過(guò)程中能夠刺激特異性免疫應(yīng)答，并且能夠產(chǎn)生免疫保護(hù)功能的異源蛋白的具有免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白及編碼基因的應(yīng)用。本發(fā)明具有異源免疫保護(hù)功能的痤瘡丙酸桿菌蛋白的基因的核苷酸序列是SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6。本發(fā)明的蛋白在胸膜肺炎放線桿菌的感染和免疫過(guò)程中能夠刺激特異性體液免疫反應(yīng)，并且能夠產(chǎn)生免疫保護(hù)作用?？梢员景l(fā)明的蛋白或基因?yàn)榛钚猿煞种苽湫啬し窝追啪€桿菌疫苗。本發(fā)明為尋找胸膜肺炎放線桿菌具有免疫保護(hù)功能的蛋白提供了一種新手段，將在豬傳染性胸膜肺炎的防治中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102337277SQ20111022508
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者馮新, 孫長(zhǎng)江, 李林溪, 杜崇濤, 雷連成, 韓文瑜 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)