專(zhuān)利名稱：人zfx基因的用途及其相關(guān)藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及人ZFX基因的用途及其相關(guān)藥物。
背景技術(shù)：
核糖核酸干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象是指當(dāng)與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)某段序列同源的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后，該mRNA發(fā)生特異性降解，而導(dǎo)致該基因表達(dá)的沉默。研究表明，長(zhǎng)度為21-23nt的雙鏈RNA能夠在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平特異性的引起 RNAi(Tuschl T, Zamore PD, Sharp PA, Bartel DP. RNAi :double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 2000 ； 101:25-33.)。腫瘤是威脅人類(lèi)健康的主要疾病。腫瘤患者雖經(jīng)化療、放療和綜合治療， 但五年生存率仍很低，如能對(duì)腫瘤發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)的基因進(jìn)行干預(yù)，將能為腫瘤的治療開(kāi)辟新途徑。近年來(lái)，RNAi已成為腫瘤的基因治療的有效策略。利用RNAi技術(shù)可以抑制原癌基因、突變的抑癌基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、抗凋亡相關(guān)基因等的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生禾口發(fā)展(Uprichard, Susan L. The therapeutic potential of RNA interference. FEBS Letters2005 ；579 :5996-6007.)。鋅指蛋白是人體中最大的蛋白家族，是識(shí)別核酸最常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)元件。研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)基因的屬于鋅指蛋白基因家族。鋅指蛋白能夠通過(guò)靶定在基因啟動(dòng)子區(qū)域而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在組織細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化中均起重要作用，其異常表達(dá)可能導(dǎo)致許多疾病包括惡性腫瘤的發(fā)生(Yajima I，Kumasaka M, Thang ND, Yanagishita T, Ohgami N, Kallenberg D, Naito Y, Yoshikawa T, Sakashita N, Kato M. Zinc finger protein 28 as a novel melanoma—related molecule. J Dermatol Sci. 2009 ；55 :68-70. Oyanagi H, Takenaka K, Ishikawa S, Kawano Y, Adachi Y, Ueda K, Wada H, Tanaka F. Expression of LUN gene that encodes a novel RING finger protein is correlated with development and progression of non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 2004；46 :21-28. Witkiewicz-Kucharczyk A, Bal W. Damage of zinc fingers in DNA repair proteins, a novel molecular mechanism in carcinogenesis. Toxicol Lett. 2006 ； 162 :29-42. Vendrell JA, Ghayad S, Ben-Larbi S, Dumontet C, Mechti N, Cohen PA. A20/TNFAIP3, a new estrogen-regulated gene that confers tamoxifen resistance in breast cancer cells. Oncogene. 2007 ；26 :4656-4667.)。ZFY(zinc finger-Y)基因家族在脊椎動(dòng)物中是一個(gè)高度保守的基因家族，在分子結(jié)構(gòu)上都具有一個(gè)酸性氨基末端和羧基末端，含有鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合區(qū)。目前已發(fā)現(xiàn)ZFY 基因家族共包括三個(gè)成員ZFX、ZFY和ZFA基因，他們?cè)诜肿咏Y(jié)構(gòu)上非常相似(North Μ, Sargent C,O'Brien J,Taylor K,Wolfe J,Affara NA,Ferguson-Smith MA. Comparison of ZFY and ZFX gene structure and analysis of alternative 3' untranslated regions of ZFY. Nucleic Acids Res. 1991 ；19 :2579-2586.)。一般哺乳動(dòng)物均含有ZFX和ZFY基因， 其中，ZFX基因位于X染色體上，而ZFY基因位于Y染色體上(Palmer MS,Berta P, SinclairAH, Pym B, Goodfellow PN. Comparison of human ZFY and ZFX transcripts. Proc Natl Acad Sci USA. 1990 ；87 :1681-1685.)。已有大量研究證實(shí)ZFY基因家族與動(dòng)物的性別有關(guān)，因此鑒定ZFX和ZFY也成為甄別動(dòng)物性別的可靠指標(biāo)。深入研究表明，ZFY基因家族可能與睪丸發(fā)育有關(guān)，決定了動(dòng)物性別的發(fā)展Gchneider-Kidicke A,Beer-Romero P,Brown LG, Nussbaum R, Page DC. ZFX has a gene structure similar to ZFY, the putative human sex determinant, and escapes X inactivation. Cell. 1989 ;57 :1247-1258.)。ZFX基因編碼的全長(zhǎng)蛋白中包含一個(gè)酸性轉(zhuǎn)錄激活域(AD)，一個(gè)核定位序列 (NLS)和一個(gè)具有 13 個(gè) C2H2 [Cys His (2)]型鋅指結(jié)構(gòu)的 DNA 結(jié)合域(DBD) (Poloumienko A.Cloning and comparative analysis of the bovine, porcine, and equine sex chromosome genes ZFX and ZFY. Genome. 2004 ;47 :74-83.)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，C2H2 鋅指結(jié)構(gòu)是最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之一，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的潛在功能。目前已發(fā)現(xiàn)800多種具有這種鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，大部分已被證實(shí)存在重要的生理功能。近年來(lái)，科學(xué)家們?cè)谘芯坎煌杉?xì)胞的基因表達(dá)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在幾種不同的干細(xì)胞中ZFX基因均存在明顯高表達(dá)(Ramalho-Santos M，Yoon S，Matsuzaki Y，Mulligan RC, Melton DA. Sternness" transcriptional profiling of embryonic and adult stem cells. Science. 2002 ；298 597-600.) ο另有報(bào)道，ZFX基因具有調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新的功能(Cellot S，Sauvageau G. Zfx :at the crossroads of survival and self-renewal. Cell. 2007 ; 129 :239-241.)。 然而，迄今為止，ZFX基因在腫瘤相關(guān)領(lǐng)域的報(bào)道還是一片空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開(kāi)與人ZFX(zinc finger-X)基因相關(guān)的治療方法及藥物。本發(fā)明第一方面，公開(kāi)了一種腫瘤治療方法，為通過(guò)降低人ZFX基因的表達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。所述的腫瘤可以為其腫瘤細(xì)胞的增殖與人ZFX基因的表達(dá)相關(guān)的任一種腫瘤，更進(jìn)一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤。所述腫瘤治療方法，為將能有效降低人ZFX基因表達(dá)水平的物質(zhì)給藥于患者。進(jìn)一步的，所述的能有效降低人ZFX基因表達(dá)水平的物質(zhì)，包括能夠特異性沉默人ZFX基因表達(dá)的小分子干擾RNA(siRNA)。該小分子干擾RNA(siRNA)可以起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源ZFX基因的表達(dá)的作用。進(jìn)一步的，所述小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO :1_42之任一的序列作為特異性沉默人ZFX基因表達(dá)的靶點(diǎn)序列。所述小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO :1_42之任一的序列作為特異性沉默人ZFX 基因表達(dá)的靶點(diǎn)序列是指該小分子干擾RNA能與SEQ ID NO 1_42中的任一種序列所編碼的mRNA片段特異性結(jié)合，并特異性沉默人ZFX基因的表達(dá)。進(jìn)一步的，所述能夠特異性沉默人ZFX基因表達(dá)的小分子干擾RNA(siRNA)經(jīng)由慢病毒載體表達(dá)。具體而言，這個(gè)過(guò)程包括將編碼所述人ZFX基因小分子干擾RNA的DNA片段克隆入慢病毒載體獲得人ZFX基因干擾慢病毒載體，進(jìn)而利用該人ZFX基因干擾慢病毒載體經(jīng)過(guò)病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細(xì)胞并最終表達(dá)所述siRNA。人ZFX基因干擾慢病毒載體為將后獲得，能產(chǎn)生人ZFX基因小分子干擾RNA。
進(jìn)一步的，所述的慢病毒載體可選自:pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一種慢病毒載體，本發(fā)明實(shí)施例具體列舉了以PGCSIL-GFP為載體。慢病毒載體可在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒。本發(fā)明第二方面，公開(kāi)了將人ZFX基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物，或者將人 ZFX基因用于制備腫瘤診斷藥物。人ZFX基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內(nèi)容其一，將人ZFX基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制劑；其二，將人 ZFX基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。所述將人ZFX基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)具體是指將人ZFX 基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生RNA干擾作用的靶標(biāo)，從而能降低腫瘤細(xì)胞人ZFX 基因的表達(dá)水平。所述將人ZFX基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑具體是指將人ZFX基因作為作用對(duì)象對(duì)藥物或制劑進(jìn)行篩選，以找到可以抑制或促進(jìn)人ZFX基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如之前所述的人ZFX基因小分子干擾RNA即是以人ZFX基因?yàn)樽饔脤?duì)象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的藥物。諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將ZFX基因作為作用對(duì)象。所述將人ZFX基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將人ZFX基因表達(dá)產(chǎn)物作為一項(xiàng)腫瘤診斷指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤診斷藥物的制備。所述的腫瘤可以為其腫瘤細(xì)胞的增殖與人ZFX基因的表達(dá)相關(guān)的任一種腫瘤，例如選自喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤。所述腫瘤治療藥物可以為小分子化學(xué)藥，抗體藥，也可以為核酸類(lèi)藥物。進(jìn)一步的，所述腫瘤治療藥物能降低人ZFX基因的表達(dá)水平從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明第三方面，公開(kāi)了一種分離的人ZFX基因小分子干擾RNA(SiRNA)靶標(biāo)片段，其序列為SEQ ID NO 1-42中任意一條序列。所述分離的人ZFX基因小分子干擾RNA(SiRNA)靶標(biāo)片段可應(yīng)用于人ZFX基因小分子干擾RNA的篩選與制備。本發(fā)明第四方面，公開(kāi)了一種人ZFX基因小分子干擾RNA(SiRNA)，能夠特異性沉默人ZFX基因的表達(dá)。所述人ZFX基因小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO 1-42之任一的序列作為特異性沉默人ZFX基因表達(dá)的靶點(diǎn)序列。進(jìn)一步的，所述人ZFX基因小分子干擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補(bǔ)，所述正義RNA片段含有SEQ ID N0:l_42中之任一序列編碼的RNA。所述正義RNA片段和反義RNA片段存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于同一條 RNA鏈上。所述正義RNA片段和反義RNA片段的長(zhǎng)度均為15_27個(gè)核苷酸；較佳的，長(zhǎng)度均為 19-23個(gè)核苷酸；最佳的，長(zhǎng)度均為19、20或者21個(gè)核苷酸。進(jìn)一步的，所述人ZFX基因小分子干擾RNA為發(fā)夾型單鏈RNA，包括正義RNA片段、 莖環(huán)片段和反義RNA片段，正義RNA片段和反義RNA片段中間由莖環(huán)片段分隔；其中，正義 RNA片段和反義RNA片段互補(bǔ)，正義RNA片段的序列選自SEQ ID NO 1~42之任一。所述莖環(huán)片段結(jié)構(gòu)包括6個(gè)或9個(gè)堿基。進(jìn)一步的所述莖環(huán)片段的序列選自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU、CCACACC。本發(fā)明具體列舉了以 UUCAAGAGA 為莖環(huán)。如實(shí)施例列舉的，所述人ZFX基因小分子干擾RNA的序列為SEQ ID NO 43 ⑶CGG AAAUUGAUCCUUGUAAUUCAAGAGAUUACAAGGAUCAAUUUCCGAC。本發(fā)明第五方面，公開(kāi)了一種人ZFX基因干擾核酸構(gòu)建體，包含編碼前述人ZFX基因小分子干擾RNA的基因片段，能表達(dá)前述人ZFX基因小分子干擾RNA。所述的人ZFX基因干擾核酸構(gòu)建體可以是將編碼前述人ZFX基因小分子干擾RNA 的基因片段克隆入已知載體獲得。進(jìn)一步的，所述人ZFX基因干擾核酸構(gòu)建體為人ZFX基因干擾慢病毒載體，為將編碼所述人ZFX基因小分子干擾RNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，能產(chǎn)生人ZFX基因小分子干擾RNA。所述慢病毒載體可以選自pLK0.1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。本發(fā)明實(shí)施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構(gòu)建的人ZFX基因干擾核酸構(gòu)建體,命名為 pGCSIL-GFP-ZFX-siRNA-1。進(jìn)一步的，編碼所述人ZFX基因小分子干擾RNA的基因片段的序列含有SEQ ID NO 1-42中之任一序列及其互補(bǔ)序列。本發(fā)明的人ZFX基因小分子干擾RNA可用于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步地可以用作治療或診斷腫瘤的藥物或制劑。人ZFX基因干擾核酸構(gòu)建體則可用于制備所述人ZFX 基因小分子干擾RNA。當(dāng)用作治療腫瘤的藥物或制劑時(shí)，是將安全有效量的人ZFX基因小分子干擾RNA 施用于哺乳動(dòng)物。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明第六方面，公開(kāi)了一種人ZFX基因干擾慢病毒，由前述人ZFX基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生人ZFX基因小分子干擾RNA，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明第七方面，還公開(kāi)了一種藥物組合物，含有治療有效量的人ZFX基因小分子干擾RNA或人ZFX基因干擾慢病毒。進(jìn)一步的，所述藥物組合物含有1 99wt%如前所述的人ZFX基因小分子干擾 RNA或人ZFX基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在制備這些組合物時(shí)，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋?zhuān)虬诳梢阅z囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時(shí)，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括濕潤(rùn)劑、乳化劑、防腐劑 (如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。綜上所述，本發(fā)明設(shè)計(jì)了針對(duì)人ZFX基因的42個(gè)RNAi靶點(diǎn)序列，構(gòu)建相應(yīng)的ZFX RNAi載體，其中編碼序列SEQ ID NO. 19的RNAi載體pGCSIL-GFP-ZFX-siRNA能夠顯著下調(diào)ZFX基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。使用慢病毒(lentivirus，簡(jiǎn)寫(xiě)為L(zhǎng)v)作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCS I L-GFP-ZFX-si RNA能夠靶向地將針對(duì)ZFX基因的RNAi序列高效導(dǎo)入人喉癌H印2細(xì)胞、肺癌95D細(xì)胞、胃癌AGS細(xì)胞、肝癌SMMC-7721細(xì)胞、乳腺癌 MCF-7細(xì)胞和膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，降低ZFX基因的表達(dá)水平，顯著抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖能力。因此慢病毒介導(dǎo)的ZFX基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術(shù)治療方式。本發(fā)明提供的SiRNA或者包含該SiRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人ZFX基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中ZFX基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。


圖1表示pGCSIL-GFP質(zhì)粒DNA圖譜圖2表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人喉癌H印2細(xì)胞、肺癌95D細(xì)胞、胃癌AGS細(xì)胞、 肝癌SMMC-7721細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞5天后，ZFX mRNA的表達(dá)水平顯著降低圖3表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人喉癌H印2細(xì)胞5天后，引起細(xì)胞增殖抑制圖4表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人肺癌95D細(xì)胞5天后，引起細(xì)胞增殖抑制圖5表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人胃癌AGS細(xì)胞5天后，引起細(xì)胞增殖抑制圖6表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人肝癌SMMC-7721細(xì)胞5天后，引起細(xì)胞增殖抑制圖7表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞5天后，引起細(xì)胞增殖抑制圖8表示ZFX-RNAi慢病毒侵染人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞5天后，引起細(xì)胞增殖抑制圖9使用ZFX抗體在腫瘤組織樣本上的免疫組化檢測(cè)結(jié)果a.人胰腺癌，b.乳腺癌，C.結(jié)直腸癌，d，e 肺癌，f，g, h, i 胃癌圖10使用ZFX抗體在癌旁組織中的免疫組化檢測(cè)結(jié)果a.人胰腺癌癌旁組織，b.乳腺癌癌旁組織，C.結(jié)直腸癌癌旁組織，d，e 肺癌癌旁組織，f，g，h，i:胃癌癌旁組織
圖11浸染ZFX-siRNA慢病毒的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤能力檢測(cè)結(jié)果a腫瘤生長(zhǎng)曲線，b裸鼠體內(nèi)腫瘤熒光檢測(cè)
具體實(shí)施例方式本發(fā)明基于鋅指蛋白可能與腫瘤細(xì)胞的增殖、耐藥和血管形成等相關(guān)的研究，認(rèn)為ZFX作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的鋅指蛋白可能參與了惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本發(fā)明涉及了一組針對(duì)人ZFX基因的小分子干擾RNA(SiRNA)序列、RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人ZFX mRNA編碼區(qū)序列作為siRNA的靶位點(diǎn)，根據(jù)靶位點(diǎn)中連續(xù)的10-30 (優(yōu)選15-27，更優(yōu)選19-2 個(gè)堿基序列設(shè)計(jì)siRNA靶點(diǎn)序列。通過(guò)基因克隆，構(gòu)建表達(dá)上述siRNA的核酸構(gòu)建體，包裝表達(dá)上述siRNA的慢病毒。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，上述siRNA 序列能夠特異性沉默人腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源ZFX基因的表達(dá)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用RNAi方法下調(diào)人ZFX基因的表達(dá)后可有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這一研究成果表明ZFX基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。發(fā)明人進(jìn)一步合成和測(cè)試了多種針對(duì)ZFX基因的siRNA，篩選出了可有效抑制ZFX的表達(dá)進(jìn)而抑制人喉癌H印2 細(xì)胞、肺癌95D細(xì)胞、胃癌AGS細(xì)胞、肝癌SMMC-7721細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)的siRNA，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了一系列干擾人ZFX基因的小干擾RNA(siRNA)序列，構(gòu)建了可特異性沉默ZFX基因表達(dá)的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)人ZFX基因設(shè)計(jì)的小干擾RNA及RNAi 慢病毒，穩(wěn)定并特異地下調(diào)ZFX基因的表達(dá)，并有效地抑制人腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明表明 ZFX基因可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點(diǎn)。而且，通過(guò)RNAi方式沉默ZFX基因的表達(dá)，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段。本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路為本發(fā)明通過(guò)如下方法來(lái)篩選獲得一種人ZFX基因RNAi慢病毒從Genbank中調(diào)取人ZFX基因序列；預(yù)測(cè)siRNA位點(diǎn)；合成針對(duì)ZFX基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNA Oligo ；慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNA Oligo連接，構(gòu)建表達(dá)ZFX 基因siRNA序列的RNAi質(zhì)粒；將RNAi質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(Packing Mix, Sigma-aldrich公司)共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞^3T，產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，即可制得高效沉默 ZFX基因的慢病毒?；谏鲜龇椒?，本發(fā)明提供了 42個(gè)干擾ZFX基因的有效靶點(diǎn)(具體如SEQ ID NO 1-42所示)，構(gòu)建了特異干擾人ZFX基因的慢病毒。同時(shí)本發(fā)明還公開(kāi)一種人ZFX基因RNAi慢病毒(ZFX-RNAi)及其制備與應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi方法，在降低ZFX基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)后，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究表明，ZFX基因是一個(gè)原癌基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學(xué)功能，ZFX基因可以為腫瘤治療的靶標(biāo)，慢病毒介導(dǎo)的ZFX基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條件，如[美]Sambrook. J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗(yàn)指南，第三版。北京科學(xué)出版社 2002中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。
實(shí)施例1 針對(duì)人ZFX基因RNAi慢病毒的制備1.篩選針對(duì)人ZFX基因的有效的SiRNA靶點(diǎn)從(ienbank調(diào)取ZFX(NM_003410. 2)基因信息；利用上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司的設(shè)計(jì)軟件Genechem設(shè)計(jì)針對(duì)ZFX基因的有效的siRNA靶點(diǎn)。在ZFX基因的編碼序列 (CDS)區(qū)域內(nèi)，每隔一個(gè)堿基起始獲得21個(gè)堿基的序列，表1列出了其中42條針對(duì)ZFX基因的有效siRNA靶點(diǎn)序列。表1靶向于人ZFX基因的siRNA靶點(diǎn)序列
權(quán)利要求
1.人ZFX基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤為其腫瘤細(xì)胞的增殖與人ZFX基因的表達(dá)相關(guān)的任一種腫瘤。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤選自喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤。
4.一種分離的人ZFX基因小分子干擾RNA靶標(biāo)片段，其序列為SEQ ID NO 1_42中任意一條序列。
5.一種人ZFX基因小分子干擾RNA，能夠特異性沉默人ZFX基因的表達(dá)。
6.如權(quán)利要求5所述人ZFX基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人ZFX基因小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO :1_42之任一的序列作為特異性沉默人ZFX基因表達(dá)的靶點(diǎn)序列。
7.如權(quán)利要求5所述人ZFX基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人ZFX基因小分子干擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補(bǔ)， 所述正義RNA片段含有SEQ ID NO :1_42中之任一序列編碼的RNA。
8.如權(quán)利要求7所述人ZFX基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述正義RNA片段和反義RNA片段的長(zhǎng)度均為15-27個(gè)核苷酸。
9.如權(quán)利要求7所述人ZFX基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人ZFX基因小分子干擾RNA為發(fā)夾型單鏈RNA，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段中間由莖環(huán)片段分隔。
10.如權(quán)利要求9所述人ZFX基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述莖環(huán)片段的序列選自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。
11.如權(quán)利要求5所述人ZFX基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人ZFX基因小分子干擾RNA的序列為SEQ ID NO :43。
12.—種人ZFX基因干擾核酸構(gòu)建體，包含編碼權(quán)利要求5-11任一權(quán)利要求所述人 ZFX基因小分子干擾RNA的基因片段，能表達(dá)人ZFX基因小分子干擾RNA。
13.如權(quán)利要求12所述人ZFX基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述人ZFX基因干擾核酸構(gòu)建體為人ZFX基因干擾慢病毒載體。
14.如權(quán)利要求13所述人ZFX基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述慢病毒載體選自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-tGFP、pLKO. I-CMV-Neo, pLKO. l-Neo、pLK0. l-Neo-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP, pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC-TagFP635> pLK0-puro_IPTG-lxLac0、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、pLPl、 pLP2, pLP/VSV-G, pENTR/U6, pLenti6/BL0CK-iT-DEST, pLenti6-Gff/U6-laminshrna, pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP 或pLenti6. 2/N-Lumio/ V5-Gff/lacZ 中的任一。
15.一種人ZFX基因干擾慢病毒，由權(quán)利要求12-14任一權(quán)利要求所述人ZFX基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝而成。
16.一種藥物組合物，含有治療有效量的權(quán)利要求5-11任一權(quán)利要求所述人ZFX基因小分子干擾RNA或權(quán)利要求15所述人ZFX基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
17.如權(quán)利要求16所述藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物用于治療腫瘤，所述的腫瘤為其腫瘤細(xì)胞的增殖與人ZFX基因的表達(dá)相關(guān)的任一種腫瘤。
18.如權(quán)利要求17所述藥物組合物，其特征在于，所述腫瘤為惡性腫瘤，選自喉癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌和膠質(zhì)瘤之任一。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了人ZFX基因的用途及其相關(guān)藥物。本發(fā)明公開(kāi)了人ZFX基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途。本發(fā)明還進(jìn)一步構(gòu)建了人ZFX基因小分子干擾RNA、人ZFX基因干擾核酸構(gòu)建體、人ZFX基因干擾慢病毒并公開(kāi)了他們的用途。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人ZFX基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中ZFX基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102277434SQ20111022479
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者呂大龍, 曹躍瓊, 朱向瑩, 瞿紅花, 金楊晟, 韓海雄 申請(qǐng)人:呂大龍, 曹躍瓊, 朱向瑩, 瞿紅花, 金楊晟, 韓海雄