專利名稱：：Flip蛋白及其編碼基因的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種FLIP蛋白及其編碼基因的新用途。胃思忟不FLIP(即FLICE-inhibitory-protein,也稱為CASH，Casper,I-FLIP,CLARP,FLAME-1，MRTT)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(deathefectdomains,DED)的凋亡抑制蛋白，在病毒、真核生物、哺乳動(dòng)物等許多物種中廣泛存在。FLIP在結(jié)構(gòu)與序列一匕與Caspase-8有很多相似之處，其過(guò)量表達(dá)能抑制胱天蛋白酶-8(caspase-8)的活化，阻止Caspase-8結(jié)合到死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物DISC上，從而阻斷Fas介導(dǎo)的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，有效降低機(jī)體各種疾病中病理狀態(tài)下瞬間增強(qiáng)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。FLIP作為一種重要的凋亡抑制蛋白首先在病毒中被發(fā)現(xiàn)。九十年代初研究者們發(fā)現(xiàn)一些病毒(如Y-皰疹病毒、疣痘病毒等)含有一種可抑制細(xì)胞凋亡的基因，由這種基因表達(dá)的蛋白能保護(hù)受感染細(xì)胞不發(fā)生凋亡，使病毒得以復(fù)制。這種蛋白在結(jié)構(gòu)上與FLICE(FADD-like-IL-lbeta-converting-enzyme/Caspase-8)相似，并能抑制FLICE的作用，故將它命名為FLIP，因它來(lái)源于病毒，所以又稱為v-FLIP。1997年幾個(gè)研究組又分別分離得到了v-FLIP的細(xì)胞類似物-cFLIP。FLIP蛋白在結(jié)構(gòu)與序列上與Caspase-8有很多相似之處，其N-端含有與Caspase-8相似的兩個(gè)相互串聯(lián)的DED。每個(gè)DED含有40個(gè)氨基酸，DED與Fas(又叫AP01或CD95)的死亡結(jié)構(gòu)域(deathdomain,DD)的功能相似，能介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互結(jié)合。c-FLIP由于mRNA的差異拚接，形成cFLIPS和cFLIPL。cFLIPS只有2個(gè)DED，cFLIPL除2個(gè)DED外還含有一個(gè)caspase同源結(jié)構(gòu)域，即caspase蛋白水解酶區(qū)域，但由于起催化作用的兩個(gè)氨基酸殘基Cys、His分別被Tyr、Arg所取代，沒有酶活性。Perlman等發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LIP作為內(nèi)源性凋亡負(fù)性調(diào)節(jié)劑在炎癥時(shí)能表達(dá)增加，保護(hù)單核細(xì)胞不發(fā)生凋亡，并促進(jìn)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，從而允許巨噬細(xì)胞的聚集，保證壞死細(xì)胞及有害物質(zhì)被有效清除，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。另外，機(jī)體組織發(fā)生缺血亦可出現(xiàn)無(wú)菌性炎癥。Jin等發(fā)現(xiàn)，無(wú)血清培養(yǎng)時(shí)人的成纖維細(xì)胞內(nèi)cFLIP/Caspase-8的比值升高，細(xì)胞凋亡水平降低，且Fas介導(dǎo)的NF-kB激活的敏感性增加，從而誘導(dǎo)IL-6，IL-8的轉(zhuǎn)錄及合成。而IL-6，IL-8是重要的炎癥介質(zhì)，據(jù)此推測(cè)缺血時(shí)FLIP參與了炎癥的發(fā)生與調(diào)控。對(duì)FLIP研究的深入已使越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)識(shí)到FLIP水平的變化與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種FLIP蛋白及其編碼基因的新用途。本發(fā)明提供的新用途是FLIP蛋白、FLIP蛋白的編碼基因和/或含有FLIP蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在阻斷FADD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了FLIP蛋白、FLIP蛋白的編碼基因和/或含有FLIP蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在制備阻斷FADD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種阻斷FADD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的藥物，它的活性成分是FLIP蛋白、FLIP蛋白的編碼基因和/或含有FLIP蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明提供的另一種新用途是FLIP蛋白、FLIP蛋白的編碼基因和/或含有FLIP蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了FLIP蛋白、FLIP蛋白的編碼基因和/或含有FLIP蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在制備抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的藥物，它的活性成分是FLIP蛋白、FLIP蛋白的編碼基因和/或含有FLIP蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明提供的另一種新用途是FLIP蛋白、FLIP蛋白的編碼基因和/或含有FLIP蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在促進(jìn)動(dòng)物繁殖性能中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了FLIP蛋白、FLIP蛋白的編碼基因和/或含有FLIP蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在制備促進(jìn)動(dòng)物繁殖性能的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種促進(jìn)動(dòng)物繁殖性能的藥物，它的活性成分是FLIP蛋白、FLIP蛋白的編碼基因和/或含有FLIP蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體。所述動(dòng)物繁殖性能具體可為卵泡發(fā)育、卵泡數(shù)量、發(fā)情率、配種后胚胎個(gè)數(shù)和產(chǎn)仔率中的至少一種。所述FLIP蛋白可為牛FLIP蛋白。所述FLIP蛋白具體可為如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。所述FLIP蛋白的編碼基因具體可為如下1)或2)或3)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與l)或2)限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2XSSC,0.1。/。SDS和1XSSC,0.1%SDS各洗膜一次。所述FADD可為牛FADD蛋白。所述FADD蛋白具體可為如下(c)或(d)的蛋白質(zhì)(c)由序列表中序列5所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列5的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的由序列5衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還保護(hù)一種重組表達(dá)載體，它包括敲除終止子的FLIP蛋白的編碼基因。所述重組表達(dá)載體自上游至下游可依次包括閱讀框相同的如下元件CMV啟動(dòng)子、敲除終止子的FLIP蛋白的編碼基因、枯草芽孢桿菌復(fù)制子、大腸桿菌復(fù)制子和抗生素基因。所述重組表達(dá)載體具體可如序列表的序列3所示。將含有FLIP基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛卵巢顆粒細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染后12h即可在熒光顯微鏡下觀察到水母綠色熒光蛋白在細(xì)胞中表達(dá)。將重組質(zhì)粒與pAcGFPbFADD共轉(zhuǎn)染牛卵巢顆粒細(xì)胞，結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染組卵巢顆粒細(xì)胞的體外增殖能力明顯高于pAcGFP-bFADD轉(zhuǎn)染組細(xì)胞；同時(shí)FCM檢測(cè)顯示共轉(zhuǎn)染組巢顆粒細(xì)胞的凋亡率百分率顯著低于pAcGFP-bFADD轉(zhuǎn)染組。在卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)as/FasL途徑通過(guò)凋亡信號(hào)誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，失去對(duì)卵母細(xì)胞的支持、調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而使卵泡閉鎖。FLIP的兩個(gè)DED能與FADD結(jié)合，抑制其結(jié)合到DISC上,從而阻斷了Fas介導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞增殖，促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育，維持卵泡發(fā)育的平衡狀態(tài)，從而提高動(dòng)物的繁殖性能。FLIP基因可通過(guò)阻斷Fas/FasL途徑中FADD誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。FLIP能夠明顯抑制FADD誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育，減少卵泡閉鎖，可作為有潛力的提高母牛繁殖性能的藥物。本發(fā)明為增加母畜排卵率、提高母畜繁殖性能提供了較為可靠、具體的試驗(yàn)依據(jù)。抑制卵泡顆粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)動(dòng)物卵泡發(fā)育，在提高雌性動(dòng)物繁殖性能方面具有廣泛的應(yīng)用前景。圖l為帶有BglII，EcoRI克隆位點(diǎn)的牛FLIP基因電泳圖。圖2為pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒的鑒定。圖3為pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒部分序列測(cè)定圖。圖4為融合蛋白在牛卵巢顆粒細(xì)胞中的熒光表達(dá)。圖5為pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的牛卵巢顆粒細(xì)胞中FLIPmRNA的表達(dá)鑒定圖。圖6為pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的牛卵巢顆粒細(xì)胞中FLIP蛋白的電泳鑒定圖。圖7為pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的牛卵巢顆粒細(xì)胞中FLIP蛋白的Western鑒定圖。圖8為實(shí)施例4中不同處理的0D值。圖9為實(shí)施例4中不同處理的細(xì)胞周期變化及凋亡峰。圖10為不同處理的小鼠的卵巢中FLIPrnRNA的表達(dá)量。圖11為不同處理的小鼠的血清中FSH的濃度。圖12為實(shí)施例2的步驟二中降落PCR的反應(yīng)程序示意圖。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。實(shí)施例l、牛FLIP基因的克隆一、牛卵巢總RNA提取及cDNA合成無(wú)菌摘取健康母牛的卵巢，迅速置于液氮中，用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其^f直，將巡6。/巡w,〉1.8的RNA置于-7(TC備用。采用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。二、PC財(cái)廣增目的基因根據(jù)牛FLIP基因全長(zhǎng)cDNA序列(GenBankAccessionNumber:NM—001012281)，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)甲如下上游引物5'-TTCCTTGGAATGACACTGTA-3';下游引物5'-CTTTTTATTTGTGAGAGAGG-3'。引物由北京賽百盛生物工程公司合成。采用該特異性引物對(duì)，以步驟一合成的cDNA為模板進(jìn)行PC財(cái)廣增。PCR反應(yīng)體系(20ul):10Xbuffer(含20(amol/LMg2—)2.0u1，10mol/LdNTPs0.4ul，10mol/L的上、下游引物各0.6y1，模板DNA1yl，2U/p17邵DNA聚合酶O.3u1，超純水15.1u1。反應(yīng)程序94°C90s;94°C30s、52°C30s、72°Clmin，35個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。0.8、/。的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，用DNA回收試劑盒純化回收。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明1483bp的PCR產(chǎn)物含有FLIP基因的CDS區(qū)編碼序列(GenBankAccessionNumber:NM—001012281自5'末端第38至1492位核苷酸)。FLIP基因的CDS區(qū)編碼序列全長(zhǎng)1455bp(見序列表的序列l(wèi))，編碼具有484個(gè)氨基酸殘基氨基酸序列(見序列表的序列2)。FLIP蛋白分子量為55.6KDa，等電點(diǎn)為7.19。三、目的基因的克隆1、將l.OPL純化后的PCR產(chǎn)物與O.5yLpMD19-T質(zhì)粒(TaKaRa公司，產(chǎn)品貨號(hào)D102C)于16。C連接6h。2、將5uL連接產(chǎn)物加入200yLDH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min,42。C熱激90s，冰浴5min使DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。3、向DH5a感受態(tài)細(xì)胞中加入800wL液體LB培養(yǎng)基于37°C、200r/min、搖菌60min,使菌體分裂增殖。4、3600r/min，離心2min，棄800uL上清液，混勻，取菌液涂布于含氨芐青霉素(sigma公司，貨號(hào)A6140)的LB培養(yǎng)板。37°C、培養(yǎng)10h。5、挑取陽(yáng)性菌落于含氨卞青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37°C、200r/min、搖菌2h。6、以菌液作為模板，采用特異性引物對(duì)甲進(jìn)行PCR擴(kuò)增。并挑取條帶好的菌液送北京諾賽基因組研究中心進(jìn)行序列測(cè)定分析。結(jié)果表明，獲得了含有將FLIP基因的CDS區(qū)編碼序列的pMD19-T質(zhì)粒，將其命名為pMD19T-FLIP。實(shí)施例2、重組質(zhì)粒(pAcGFP-bFLIP)的構(gòu)建及鑒定一、帶酶切位點(diǎn)特異性引物的設(shè)計(jì)根據(jù)牛FLIP基因的酶切圖譜和pAcGFP-Nl的多克隆位點(diǎn)，選用餘7II和化。RI作為克隆位點(diǎn)。從FLIP基因的完整閱讀框序列的兩端設(shè)計(jì)引物上游引物5'-ACTAGATCTGCCACCATGTCTGCTGAAGTCAT-3，；下游引物5'-ACTGAATTCTTTGTGAGAGAGGAAGA-3，。上游引物在ATG前加入3^/11酶切位點(diǎn)和四個(gè)保護(hù)性堿基，同時(shí)加入Abzi序列7以提高插入的基因在真核細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的效率。下游引物設(shè)計(jì)時(shí)刪除牛FLIP基因的終止密碼子TAA，并在其后加入一個(gè)C堿基和fcoRI酶切位點(diǎn)，使FLIP閱讀框與下游的AcGFP基因序列保持一致，保證FLIP與報(bào)告基因融合后能夠同時(shí)表達(dá)。下劃線分別為酶切位點(diǎn)，波浪線為Abzi序列。二、目的基因的擴(kuò)增、酶切、連接及轉(zhuǎn)化1、以pMD19T-FLIP質(zhì)粒為模板，采用步驟一的引物進(jìn)行降落PCR。PCR反應(yīng)體系(20uL):10Xbuffer(含20mol/LMg2+)2.0uL，10mol/LdNTPs0.4uL，10mol/L上、下游引物各O.6nL，質(zhì)粒DNA1uL，2U/uLTag腿聚合酶0.3yL，超純水15.1uL。反應(yīng)程序見圖12。PCR產(chǎn)物的電泳圖見圖1。圖l中，M:marker;1-5:PCR產(chǎn)物。獲得PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1477bp，與預(yù)期結(jié)果相符。利用凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，將其克隆到pMD19-TSimple載體(TaKaRa公司，產(chǎn)品貨號(hào):D104C)，轉(zhuǎn)化DH5a宿主菌，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶和I雙酶切，0.8%瓊脂糖凝膠純化回收到1496bp的FLIP片段。2、用限制性內(nèi)切酶5^II和fcoRI雙酶切pAcGFP-Nl質(zhì)粒(Clontech公司，貨號(hào)632469)，純化回收約4726bp的pAcGFP-Nl片段。3、將步驟1回收的約1496bp的FLIP片段和步驟2回收的約4726bp的pAcGFP-Nl片段用T4DNA連接酶于16'C連接7h，然后將連接產(chǎn)物接種于含有30ng/mL卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基平板，37。C培養(yǎng)過(guò)夜，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行步驟三的鑒定。三、重組質(zhì)粒的鑒定1、酶切鑒定用小量質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行酵切鑒定。結(jié)果見圖2。圖2中，M:markerDL5000;14:pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒5g7n/5boRI雙酶切;5:未酶切pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒。質(zhì)粒進(jìn)行i^ill和AcdI雙酶切后，顯示4.7kb的線性載體片段和1477bp的FLIP基因片段。鑒定結(jié)果表明表明目的基因己正確插入pAcGFP-Nl載體中，獲得了目的質(zhì)粒。2、測(cè)序鑒定選取酶切鑒定正確的質(zhì)粒送北京諾賽測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果見序列表的序列3。該質(zhì)粒中，自上游至下游依次為如下元件1589位為CMV啟動(dòng)子、第621位至2837位為融合蛋白基因(缺失終止密碼子的牛FLIP基因位于綠色熒光蛋白報(bào)告基因AcGFP的上游，兩個(gè)基因具有相同閱讀框，組成融合蛋白基因，融合基因的示意圖見圖3，該基因編碼序列表的序列4所示的融合蛋白，融合蛋白中第1484個(gè)氨基酸為FLIP多肽，第499739個(gè)氨基酸為AcGFP多肽)、第3219位至3525位為枯草芽孢桿菌復(fù)制子、自3883位至3960位為大腸桿菌復(fù)制子、自4070至4858位為原核生物遺傳選擇標(biāo)記卡那霉素抗性Knf和真核生物篩選標(biāo)記新霉素(G418)基因。將該質(zhì)粒命名為pAcGFP-bFLIP。實(shí)施例3、重組質(zhì)粒(pAcGFP-bFLIP)在牛卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)1、pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒的提取將pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒在DH5a中擴(kuò)增，以無(wú)內(nèi)毒素超純質(zhì)粒抽提試劑盒(北京天根生化公司，貨號(hào)DP117)制備不含內(nèi)毒素的pAcGFP-bFLIP,-2(TC保存。2、牛卵泡顆粒細(xì)胞的分離、純化及培養(yǎng)①將從屠宰場(chǎng)獲得牛卵巢用PBS反復(fù)沖洗后，用2ml注射器吸取卵泡中的細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，除去卵母細(xì)胞。②用巴斯德管收集顆粒細(xì)胞團(tuán)，用新鮮DMEM/I^清洗三次以除去紅細(xì)胞(200g/min,離心5min)。③顆粒細(xì)胞重懸于DMEM/FJ咅養(yǎng)基中，37°C、5%0)2孵箱中孵育15min。④然后用DMEM/Ft2培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次(250g/min，離心5min)。⑤用0.2%臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定細(xì)胞活力。用含10%體積百分含量的FBS(invitrogen公司，貨號(hào)16000-044)、15mmol/LHEPES(invitrogen公司，貨號(hào)15630-106)、100U/mL青霉素、100ug/mL鏈霉素(invitrogen公司，貨號(hào)15140-148)的DMEM/Fj咅養(yǎng)基(invitrogen公司，貨號(hào)11039-047)稀釋并計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，以4X106cells/ml接種于培養(yǎng)皿，37°C、5%C02，完全濕度條件下培養(yǎng)。3、用pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染牛卵巢顆粒細(xì)胞①轉(zhuǎn)染前一天，將牛卵巢顆粒細(xì)胞以5X107ml的密度加入無(wú)抗體的DMEM/Fj咅養(yǎng)基中，接種于12孔板中。②待細(xì)胞達(dá)到90。/。融合時(shí)，將DMEM培養(yǎng)基換為Opti-MEMIReducedSerumMedium(invitrogen公司，貨號(hào)31985-070)培養(yǎng)基，準(zhǔn)備進(jìn)行轉(zhuǎn)染。③將4u1Lipofectami2000加入100ix1Opti—MEMIReducedSerumMedium培養(yǎng)基中，室溫孵育5rain;接著將3.2ul濃度為800ng/mL的pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒加入IOOu1Opti-MEMIReducedSerumMedium培養(yǎng)基中輕輕混勻;將兩種溶液溫和混合并于室溫孵育20min。將200yl步驟③得到的混合液加入含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中，于37。C、5%C02、培養(yǎng)46h后，更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。并于轉(zhuǎn)染24h后加入G418，以600ug/ml的濃度進(jìn)行篩選。試驗(yàn)中，設(shè)置兩個(gè)對(duì)照。對(duì)照一用DMEM培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒；對(duì)照二轉(zhuǎn)染pAcGFP-Nl空載體。每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后從12h開始，每隔24h在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞中水母綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染24h后即可觀察到牛卵巢顆粒細(xì)胞有綠色熒光表達(dá)，綠色熒光大多數(shù)分布于細(xì)胞核及其周圍，陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例可達(dá)65%，轉(zhuǎn)染效率較高。轉(zhuǎn)染后72h時(shí)，融合蛋白在牛卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)情況見圖4，圖4中，A、B、C為熒光顯微鏡下觀察的轉(zhuǎn)染牛卵巢顆粒細(xì)胞的照片；D、E、F為光鏡下觀察的轉(zhuǎn)染牛卵巢顆粒細(xì)胞的照片。其中A、D為DMEM培養(yǎng)基空白對(duì)照組(對(duì)照一)；B、E為pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；C、F為pAcGFP-Nl空載體轉(zhuǎn)染組(對(duì)照二)。對(duì)照一中轉(zhuǎn)染細(xì)胞在熒光顯微鏡下不能觀察到任何綠色熒光；對(duì)照二中轉(zhuǎn)染后的牛卵巢顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)很強(qiáng)的綠色熒光，并且均勻的分布于整個(gè)細(xì)胞內(nèi)。卵巢顆粒細(xì)胞經(jīng)G418篩選10d后，收集細(xì)胞。用TrizolReagent提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果見圖5。圖5中，M:marker;1:對(duì)照一；2:轉(zhuǎn)染pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒的細(xì)胞；3:對(duì)照二。轉(zhuǎn)染pACcGFP-Nl-bFLIP質(zhì)粒的細(xì)胞電泳后出現(xiàn)1477bp的高亮度目的條帶，而對(duì)照一和對(duì)照二在1477bp處的條帶則相對(duì)較弱，表明轉(zhuǎn)染pACcGFP-bFLIP的牛卵巢顆粒細(xì)胞中的FLIP基因進(jìn)行了高效轉(zhuǎn)錄。卵巢顆粒細(xì)胞經(jīng)G418篩選10d后，收集細(xì)胞。加入lmlRIPAbuffer和10n1PMSF(IOmg/ml)裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用Bradford比色法測(cè)定蛋白濃度。提取得到的總蛋白SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉，與兔抗牛FLIP多克隆抗體(santacruz公司，貨號(hào)sc-5276)和HRP酶標(biāo)二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司bse-0326R)反應(yīng)后，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)?？偟鞍譙DS-PAGE電泳結(jié)果見圖6。圖6中，M:marker;1:對(duì)照一；2:對(duì)照二；3、4:pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pAcGFP-bFLIP的細(xì)胞總蛋白在PAGE膠上電泳產(chǎn)生大小約為83kD的融合蛋白條帶，初步證實(shí)FLIP融合蛋白基因已在卵巢顆粒細(xì)胞中得到表達(dá)。Westernblot檢測(cè)結(jié)果見圖7。圖7中，1:轉(zhuǎn)染pAcGFP-Nl空載體對(duì)照組；.2:轉(zhuǎn)染pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒的細(xì)胞。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒的細(xì)胞中，表達(dá)產(chǎn)物能與FLIP抗體結(jié)合并在NC膜上產(chǎn)生特異性反應(yīng)條帶，表達(dá)產(chǎn)物為具有免疫活性的FLIP蛋白。pAcGFP-Nl質(zhì)粒對(duì)照組為陰性結(jié)果。實(shí)施例4、FLIP對(duì)FADD的抑制作用一、pAcGFP-bFADD的獲得1、牛FADD基因的擴(kuò)增設(shè)計(jì)如下引物，擴(kuò)增兩端帶有BglII和EcoRI酶切位點(diǎn)的牛FADD基因上游引物5'-ACTAAGATCTGCCACCATGGACCCGTTCCTGGT-3';下游引物5'-ACTAGAATTCCGGAGGCTCCCGGGGCAGCG-3'。以?；蚪MDNA為模板，采用降落PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20uL):10Xbuffer(含20mol/LMg2+)2.0uL，10mol/LdNTPs0.4nL，10mol/L上、下游引物各0.6uL，質(zhì)粒DNA1nL，2U/uLTaqDNA聚合酶0.3uL，超純水15.1uL。反應(yīng)程序94°C90s;94°C30s，退火溫度分別為70°C、68°C、66。C各30s，72。C1min，最后28個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。獲得654bp的FADD基因，純化、回收。2、pAcGFP-bFADD的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶^ill和^boRI雙酶切pAcGFP-Nl質(zhì)粒(Clontech公司，貨號(hào)632469)，純化回收約4726bp的pAcGFP-Nl片段。將步驟1回收的654bp的FLIP片段和約4726bp的pAcGFP-Nl片段用T4DNA連接酶于16。C連接7h，然后將連接產(chǎn)物接種于含有30ng/mL卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基平板，37。C培養(yǎng)過(guò)夜，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。結(jié)果表明，質(zhì)粒的序列見序列表的序列6，將含有FADD基因的pAcGFP-Nl質(zhì)粒命名為pAcGFP-bFADD。二、FLIP對(duì)FADD的抑制作用1、MTT法測(cè)定FLIP與FADD基因共轉(zhuǎn)染卵巢顆粒細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞體外增殖能力的影響試驗(yàn)分為五組包括空白對(duì)照組、pAcGFP-Nl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pAcGFP-bFADD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pAcGFP-bFADD/pAcGF-bFLIP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組、pAcGFP-bFADD/pAcGFP-Nl質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組。牛卵泡顆粒細(xì)胞的分離、純化及培養(yǎng)同實(shí)施例3。1)收集指數(shù)生長(zhǎng)期的卵泡顆粒細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為lX107ml，于96孔培養(yǎng)板每孔加IOOul，37°C、5%C02條件下孵育12h后，棄上清。2)在加入細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，分別進(jìn)行如下處理，每個(gè)處理設(shè)置18個(gè)復(fù)孔處理一(空白對(duì)照組)力口50ul無(wú)血清DMEM;處理二(FADD組)加50ulpAcGFP-bFADD質(zhì)粒/LipofectaraiTM2000復(fù)合物，其中含有2.4ug的pAcGFP-bFADD質(zhì)粒和3.0nLLipofectami2000;處理三(pAcGFP-Nl組):加50ulpAcGFP-Nl質(zhì)粒/LipofectamiTM2000復(fù)合物，其中含有2.4ug的pAcGFP-Nl質(zhì)粒和3.0uLLipofectami2000;處理四(FADD/FLIP組)力口50ylpAcGFP-bFADD/pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒/Lipofectami2000復(fù)合物，其中含有L2ug的pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒、1.2ug的pAcGFP-bFADD質(zhì)粒和3.0uLLipofectami2000;處理五(FADD/pAcGFP-Nl組)加50u1pAcGFP-bFADD/pAcGFP-Nl質(zhì)粒/Lipofectami2000復(fù)合物，其中含有l(wèi).2ug的pAcGFP-bFADD質(zhì)粒、1.2ug的pAcGFP-Nl質(zhì)粒和3.0uLLipofectami2000;3)37°C、5%C02條件下孵育4h后，吸棄上清，補(bǔ)加200n1含10%胎牛血清的DMEM，隨后分別于0、24、48、72、96、120h每孔加MTT(5mg/ml)10y1，繼續(xù)孵育4h后，小心吸棄上清，加入DMSO200lU/孔，低速振蕩IOmin，充分溶解甲臜結(jié)晶后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)漢U值。以6^。值為縱坐標(biāo)，時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。抑制率=(對(duì)照組^1-實(shí)驗(yàn)組0"直)/對(duì)照組6^直，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。通過(guò)對(duì)各組細(xì)胞活率分析，pAcGFP-bFADD/pAcGF-bFLIP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的體外增殖能力明顯高于FADD/pAcGFP-Nl質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，見圖8。2、FCM分析FLIP與FADD基因共轉(zhuǎn)染卵巢顆粒細(xì)胞后細(xì)胞的周期分布及凋亡情況三組牛卵巢顆粒細(xì)胞，每組5X10e細(xì)胞。第一組細(xì)胞用pAcGFP-bFADD進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染量為2.4ug;第二組細(xì)胞用pAcGFP-bFADD/pAcGFP-bFLIP進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，12pAcGFP-bFADD的轉(zhuǎn)染量為1.2ug，pAcGFP-bFLIP的轉(zhuǎn)染量為L(zhǎng)2ug;第三組細(xì)胞用pAcGFP-Nl進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染量為2.4ixg。每組設(shè)三個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染后的牛卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)5(1，0.05%胰蛋白酶消化，冷PBS洗2次，4'C、200g/min離心5min，棄上清液，細(xì)胞沉淀用O.3mL含8。/a胎牛血清的PBS混勻，緩慢加入-2(TC預(yù)冷的無(wú)水乙醇，使其終濃度為70%，于4。C固定12h。離心洗滌細(xì)胞，用0.5ml濃度為lmg/ml的RNaseA懸浮細(xì)胞，37°C、孵育30min，再加入O.5ml濃度為50ng/mlPI染液，4"C避光染色10min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化及凋亡峰。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染組巢顆粒細(xì)胞的凋亡率百分率顯著低于pAcGFP-bFADD轉(zhuǎn)染組，見圖9。圖9中，A:pAcGFP-Nl轉(zhuǎn)染組;B:FADD轉(zhuǎn)染組;C:FADD/FLIP轉(zhuǎn)染組。實(shí)施例5、FLIP對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的抑制作用和對(duì)卵泡發(fā)育和產(chǎn)仔率的促進(jìn)作用pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒的提取將pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒在DH5a中擴(kuò)增，以無(wú)內(nèi)毒素超純質(zhì)粒抽提試劑盒(北京天根生化公司，貨號(hào)DP117)制備不含內(nèi)毒素的pAcGFP-bFLIP表達(dá)載體，于-2(TC保存?zhèn)溆?。將提取的質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測(cè)定0D260和OD280的值，質(zhì)粒的濃度為1.135mg/mL，0D260/0D280為1.89，表明提取的質(zhì)粒DNA純度較好，沒有蛋白污染，也沒有發(fā)生降解。將提取的pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒用AcoRlA^2II進(jìn)行酶切分析。經(jīng)酶切和電泳分析，質(zhì)粒中包含約1477bp的FLIP基因。試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境150只35日齡ICR雌性小鼠、50只45日齡ICR雄性小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)轉(zhuǎn)基因小鼠試驗(yàn)動(dòng)物房。飼養(yǎng)條件溫度22-28°C，相對(duì)濕度40%-60%，噪音〈60dB，晝夜明暗交替時(shí)間為12h/12h，飼養(yǎng)室內(nèi)每天經(jīng)紫外燈照射2h殺菌，飼料飲水均滅菌處理，鼠籠和墊料每周更換兩次。小鼠于試驗(yàn)前預(yù)飼養(yǎng)l周，將150只雌性小鼠分為3組(空白對(duì)照組、pAcGFP-Nl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pAcGFP-bFLIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)。先于每只雌性小鼠的左右兩側(cè)腓腸肌各注射50uL0.25%鹽酸布比卡因，然后于24h后分別肌肉注射100ugpAcGFP-FLIP、lOOixgpAcGFP-Nl,100uL生理鹽水。2周后再加強(qiáng)注射一次。于第2次質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的第10天開始進(jìn)行如下試驗(yàn)一、FLIP對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的抑制作用每組隨機(jī)取10只小鼠，脫頸法處死小鼠，取出兩側(cè)卵巢，將一側(cè)卵巢用液氮凍存，進(jìn)行熒光定量PCR分析FLIPmRNA的表達(dá)情況。結(jié)果表明，pAcGFP-FLIP轉(zhuǎn)染組13小鼠卵巢中FLIPmRNA的表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組和pAcGFP-Nl空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，見圖10;另一側(cè)的卵巢用胰蛋白酶和膠原酶V消化分離卵泡顆粒細(xì)胞，用Hoechest33342熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，pAcGFP-FLIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠卵巢顆粒細(xì)胞平均凋亡率為(3.19±0.48)%，顯著低于pAcGFP-Nl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組卵巢顆粒細(xì)胞平均凋亡率(11.53士0.76)%和空白對(duì)照組卵巢顆粒細(xì)胞平均凋亡率(13.41±1.27)%(P<0.01)。二、FLIP對(duì)動(dòng)物卵泡發(fā)育和產(chǎn)仔率的促進(jìn)作用第2次質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的第10天開始進(jìn)行如下指標(biāo)檢測(cè)①觀察一周內(nèi)各組小鼠發(fā)情的情況(陰道涂片法)；②每組隨機(jī)取10只發(fā)情周期的小鼠，在動(dòng)情期脫頸法處死小鼠，取出兩側(cè)卵巢，放大鏡下統(tǒng)計(jì)卵巢上成熟卵泡(MF)的個(gè)數(shù)；③將每組10只雌性小鼠與雄性小鼠于每日下午4-5點(diǎn)合籠，次日上午8-9點(diǎn)鐘檢查陰道栓，每組抽取10只小鼠，脫頸法處死小鼠，取出小鼠的輸卵管壺腹部，置于PBS中，在解剖鏡下分離出胚胎細(xì)胞團(tuán)，加入少許透明質(zhì)酸酶分離胚胎，統(tǒng)計(jì)每只小鼠兩側(cè)輸卵管中的胚胎；④各組小鼠注射質(zhì)粒后10天采血，離心取血清，測(cè)定促卵泡激素(FSH)的濃度；⑤其余的小鼠配種后，待分娩后統(tǒng)計(jì)窩產(chǎn)仔數(shù)及初生重。結(jié)果顯示，小鼠連續(xù)兩次轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，各組小鼠血清中FSH的濃度出現(xiàn)不同的變化空白轉(zhuǎn)染組FSH的濃度平均為1L91IU/L，pAcGFP-N1空質(zhì)粒組FSH的濃度平均為13.12IU/L，均低于pAcGFP-FLIP質(zhì)粒組的FSH濃度(27.03IU/L)，見圖ll。同時(shí)對(duì)各組小鼠發(fā)情率、成熟卵泡數(shù)、配種后胚胎數(shù)、平均窩產(chǎn)仔數(shù)和平均初生重等指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明，pAcGFP-FLIP質(zhì)粒組在發(fā)情率、胚胎數(shù)、窩產(chǎn)仔數(shù)方面均高于陰性對(duì)照組和pAcGFP-Nl空質(zhì)粒組。在初生重方面三個(gè)實(shí)驗(yàn)組差異不顯著，如表1所示。以上試驗(yàn)結(jié)果表明FLIP對(duì)促進(jìn)動(dòng)物卵泡發(fā)育，提高產(chǎn)仔率具有重要作用。表l各組小鼠繁殖性能相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所<120>FLIP蛋白及其編碼基因的新用途<130>CGGNARY92052〈160〉6<210〉1〈211〉1455〈212〉DNA<213〉牛科牛(Aosz^〃r〃s)atgtctgctga^gtcgLtccatc3ggta^gaagaagcacttgga3gg3taca60ctcctttttttgtgccg卿tgttgctgcagatgtggttccactgaatgtcagggatctt120ctggatatttagga^gctgtcttctgtgagcttggctgagctgctctac180卿gtgglggCggtt"tgacttgctca卿gggtcttg犯tatggataccccgacagtggag240gccctcctgcgcaagcacccacatctgatttca^ctstagggtgctgatgatggeigatt300ggtgaggatttggataa^tctgacgtgtcctcattaatgttcctcatgag3g3ttatacg360ggtcgaagcaggataagagtttcttggatcttgtggttga3ttgg卿ag420ctaaatctggttgctccagatc肌ctgaattta"ttag犯gaaagcctaaggaacatcaac480aggatagacctgaagacaaaa^tcca^gaaatacaagcagtcagctcaagg3gcgg犯3ca540aatt^tgtaaatgctcgccaggcatctctgCC￡L￡L￡LCt1:g3gtgtta肌gatccttcatat600^cctaaggctccsgaatggga3caaaggcttatgatgggaccacctgac660attca^aga^g犯ccagtgd3gagacccattcaggaatcaggagcatttttgcctcagcac720atagi:3g^gagagatataagatgcagagcaagcccctgggaatctgcctgataattgac780tgcattggcaatg3cac3g3cattcttcgggacaccttcacttccctgggctatgaagtc840aagcatttcttatatctcac"tgtga^gatataaccaacattxtacgccaagttgcccag900atgccccagcaccaagactxtgacagctttgcgtgtatcctggtgagccgagggggctcc恥Oc卿gcgtgtttggcgtggatcagactcactctggggtccctttggatcatatcagaaga1020atgttcatggcccctctctctcsgggaagccaaagctcttttttattcag1080agctatgtgaaatcagagggccagctggaggacagcagcttcctggaggtggacgggccg1140tcagtgaaaagtgcagactccaaggccagacagcctgggccctaccaagatttgattcac1200cgagaagctgacttcttctggagcctgtgcaaagcagatgtgtccctgctggaggggccc1260tccagctcaccctcattgtacctgaagtgcctctcccagaaactgtggaaagaaagaaag1320■cactcgctcctggaactccacactgaactcaaccgcctggtgtatgsttggaacagcaaa1380gtgtctgctaaggagcgatactatgtctggctgcagcacactttgagaaagaatctcttc1440ctctctcacaaataa1455<210〉2〈211〉484〈212〉TOT〈213〉?？婆?5osfa〃/7AS)<400>2MetSerAlaGluVallieHisGinValGluGluAlaLeuAspGluGlu151015GluLysAspThrLeuLeuPheLeuCysArgAspValAlaAlaAspVal202530ValProLeuAsnValArgAspLeuLeuAsplieLeuArgGluArgGly354045LysLeuSerSerValSerLeuAlaGluLeuLeuTyrArgValArgArg505560PheAspLeuLeuLysArgValLeuAsnMetAspThrProThrValGlu65707580AlaLeuLeuArgLysHisProHisLeulieSerAspTyrArgValLeu859095MetMetGlulieGlyGluAspLeuAspLysSerAspValSerSerLeu100105110MetPheLeuMetArgAspTyrThrGlyArgSerLyslieAlaLysAsp115120125LysSerPheLeuAspLeuValValGluLeuGluLysLeuAsnLeuVal13013514016Ala145ArgGlyLeu'SerPro225lieLeuPheLysGin305GinHisLysLeuAla385ArgProlieAlaSerLys210ValVallieThrAsp290AspSerlieProGlu370AspGluAspAspGluVal195GluLysGlulieSer275lieSerValArgLys355AspSerAlaGinLeuThr180LysGinArgGluAsp260LeuThrAspPheArg340LeuSerLysAspLeuLys165AsnAspArgProArg245CysGlyAsnSerGly325MetPheSerAlaPheAsn150ThrTyrProLeulie230Tyr"MoJL丄LTyrliePhe310ValPhePhePheArg390PheLeuLysValSerMet215GinLysm，rvj丄)GluLeu295AlaAspMetlieLeu375GinTrpLeulieAsnTyr200MetGluMetAsnVal280ArgCysGinAlaGin360GluProSerGluGinGluLys170ArgSer155TyrGinLeuLysAlaAla185AsnLeuArgLeuGlyProProSerGlyGinAsp265LysGinlieThrAsp345SerValGlyLeuSer250ThrHisValLeuHis330ThrTyrAspProCysAlaVal315SerCysValGlyTyr395LysAsp220PheArgGinSerGin205lieAsplieLeuPheLeuGin300SerGlyProLysPro380GinAlaAsnSerLeu190AsnGinlieAsn160AlaGin175ProAsnGlyArgArgGluAla235LysProLeuGlyLeuProGinHis240lieCys255AspThrTyr285MetArgValSerSer365SerAspAspArg270LeuProGlyProLeu350GluValLeuValThrValGinHisGlySer320LeuAsp335SerGlyGlyGinLysSerlieHis400SerLeu17405410415LeuGluGlyProSerSerSerProSerLeuTyrLeuLysCysLeuSer420425430GinLysLeuTrpLysGluArgLysHisSerLeuLeuGluLeuHisThr435440445GluLeuAsnArgLeuValTyrAspTrpAsnSerLysValSerAlaLys450455460GluArgTyrTyrValTrpLeuGinHisThrLeuArgLysAsnLeuPhe465470475480LeuSerHisLys〈210>3<211〉6171〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉<223><400〉3tagttattaatagtaatcaattacggggtccgttacataacttacggtaaatggcccgccgacgtc肪taatgacgtatgttcccatagt3tggg"tggsgtstttscggt肌3ctgcccaaagtacgccccctattgacgtcaatgacggcatgaccttatgggactttcctacttggcacatggtgatgcggttttggcagtacatcaaatttccaagtctccaccccattgacgtcaaggactttccaaaatgtcgtaacaactccgcacggtgggaggtctatataagcagagctggccggactcagatctgccaccatgtctgctgatg肌geigg3ga^agg3t3cactccttttttattagttcatagcccatatatggagttccg60tggctgaccgCCCa3Cg3CCcccgcccatt120a^cgcc犯tagggactttccattgacgtca180cttggcagtacatcaagtgtatcatatgcc240taaMggcccgcctggcattatgcccagta300gtacatctacgtattagtcatcgctattac360tgggcg"tggatagcggtttgactcacgggg420tgggagtttgttttggcaccaSLgLatC3LaCg480cccattgacgC^dtgggCggtaggcgtgt540"tttagtgeiaccgtcagatccgctagcgcta600aagtcatccatcaggtagaagaagcacttg660tgtgccg卿tgttgctgcag3tgtggttC720cactgaatgtcagggatcttctggatattttcttctgtga780gcttggctgagctgctctac卿gtgaggcggtt"tgacttgctca卿gggtcttgaata840tggataccccgacagtggaggccctcctgcgcaagcacccacatctgatttcagactata■gggtgctgatgatggagattggtgaggatttggata^atctgacgtgtcctcattaatgt960tcctcatgagagattatacgggtcg卿caaga^gcc^Lggataagagtttcttggatc1020ttgtggttgactaaatctggttgctccagatcaactgaatttattsgsag1080aaagcctaaggaacatcaacaggstsgacctac肌gcagt1140cagctcaaggaattatgtaaatgctcgccaggcatctctgccaaacttga1200gtgttaaaigatccttcatat犯CCt^LggCtccagaatgggaacaaaggc1260ttatgatgggaccacctgacattc犯agaggagacccattcaggaatcag1320gagcatttttgcctcagcacatagta^agagaga"t3t3agatgcagagca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