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一種紅色糖多孢菌及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:397579閱讀:1213來源:國知局
專利名稱:一種紅色糖多孢菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵領(lǐng)域,具體地,涉及一種紅色糖多孢菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
紅霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,具有與青霉素類似的抗菌譜,特別對革蘭氏陽性細(xì)菌、抗酸桿菌、立克次氏體及大病毒有抗菌活性,是治療耐藥性金黃色葡萄球菌感染和溶血性鏈球菌感染所引起疾病的首選藥物。其作用機(jī)制主要是與核糖核蛋白體的50S亞單位相結(jié)合,抑制肽?;D(zhuǎn)移酶,影響核糖核蛋白體的移位過程,妨礙肽鏈增長,抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成,從而起到抑菌作用。紅色糖多孢菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生A,B,C三個組分,其中A組·分活性最強(qiáng),所占比例也最大,根據(jù)菌種特性的不同比例約在60 % 80%。B和C兩個組分活性較差,且具有一定毒性,所占比例因菌種不同而已,比例在10%以內(nèi),一般為3% 5%。目前國內(nèi)擁有紅霉素原料藥批文的企業(yè)近40家,其主要下游產(chǎn)品硫氰酸紅霉素的生產(chǎn)廠家已近30家,2007年國內(nèi)年產(chǎn)硫氰酸紅霉素可達(dá)8000噸以上。紅霉素衍生物阿奇霉素、琥乙紅霉素、羅紅霉素、克拉霉素等產(chǎn)量逐年增加,銷售額不斷上升,預(yù)計(jì)今后仍有廣闊的發(fā)展空間。隨著市場對紅霉素衍生品的大量需求,紅霉素原藥需求量也將逐年增大。在激烈的市場競爭中,生產(chǎn)菌種本身質(zhì)量是占據(jù)行業(yè)優(yōu)勢的決定性因素,因?yàn)楦弋a(chǎn)菌種在不增加任何生產(chǎn)成本(原料、動能、人員等)的情況下即可大幅度提高產(chǎn)量。目前國外紅霉素發(fā)酵水平明顯高于國內(nèi),我國于1958年開始試制紅霉素,1965年開始在上海第三制藥廠正式投產(chǎn),當(dāng)時發(fā)酵單位不足3000 μ g/mL。后來經(jīng)過多年的菌種選育及工藝優(yōu)化,發(fā)酵單位逐漸提高,目前國內(nèi)平均發(fā)酵單位可達(dá)8000 μ g/mL,但與目前國際上的18000 μ g/mL仍然有較大的差距,較低的發(fā)酵單位仍是限制我國紅霉素發(fā)酵工業(yè)發(fā)展的重要因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種紅色糖多孢菌及其發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的應(yīng)用,以提高我國紅霉素發(fā)酵行業(yè)的紅霉素發(fā)酵效率。本發(fā)明提供的菌株BJX001,該菌株于2011年4月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號,中國科學(xué)院微生物研究所,郵編100101),保藏編號為CGMCC No. 4767,分類命名為紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)。紅色糖多孢菌菌株BJX001形成緊密螺旋形的孢子鏈,孢子呈球形或卵圓形,表面光滑。在蔗糖硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基中,氣絲厚,白色至淡粉色,基絲微黃色,后變紅色,無可溶色素;在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,基絲乳脂色,無可溶色素。本發(fā)明提供了一種通過發(fā)酵紅色糖多孢菌BJX001制備紅霉素的方法,包含培養(yǎng)和發(fā)酵兩個階段
(I)將紅色糖多孢菌BJXOOl接種于斜面菌種培養(yǎng)基中,置于35 37°C,55% 65%濕度的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)144 192小時;(2)從培養(yǎng)成熟的斜面菌種培養(yǎng)基中挖取面積約Icm2大小的菌苔接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,在溫度為30 34°C的條件下,振蕩培養(yǎng),相對濕度為50 % 60%,培養(yǎng)46 50小時后,向發(fā)酵培養(yǎng)基中一次性補(bǔ)加過濾除菌的正丙醇,使其質(zhì)量百分比終濃度為1.0%,控制發(fā)酵時間在168 216小時內(nèi),得到紅霉素。為了防止發(fā)酵液因過多蒸發(fā)而濃縮,造成發(fā)酵單位虛高,保持發(fā)酵過程中所述環(huán)境相對濕度為50 % 60%。上述振蕩轉(zhuǎn)速優(yōu)選220r/min,發(fā)酵時間優(yōu)選192小時。
本發(fā)明菌種培養(yǎng)基組份為玉米淀粉10 14g/L,玉米漿5 7g/L,七水硫酸鎂
O.8 I. 2g/L,碳酸鈣2. 5 3. 5g/L,瓊脂粉20 24g/L,余量為水,滅菌前以氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. O 7. 4。本發(fā)明菌種培養(yǎng)基組分優(yōu)選為玉米淀粉12g/L,玉米漿6g/L,七水硫酸鎂O. I %lg/L,碳酸鈣3g/L,瓊脂22g/L,余量為水,滅菌前以氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 2。本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基組份為玉米淀粉40_60g/L,黃豆餅粉16_24g/L,玉米漿(其中干物質(zhì)含量為30% -60% ) 8-12g/L,酵母粉4-6g/L,磷酸二氫鉀O. 4-0. 6g/L,氯化鈉4_6g/L,豆油4-6g/L,碳酸鈣4-6g/L,余量為水,滅菌前以氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6. 5-7. 5。所述濃度均為在發(fā)酵培養(yǎng)基中的終濃度。本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基組份優(yōu)選為玉米淀粉50g/L,黃豆餅粉20g/L,玉米漿10g/L,酵母粉5g/L,磷酸二氫鉀O. 5g/L,氯化鈉5g/L,豆油5g/L,碳酸鈣5g/L,余量為水,滅菌前pH調(diào)節(jié)為7. O。本發(fā)明添加正丙醇的終濃度為10mL/L。本發(fā)明發(fā)酵液化學(xué)效價的測定方法是預(yù)估發(fā)酵液產(chǎn)量之后將其稀釋至300-500 μ g/mL范圍,加入碳酸鉀與醋酸丁酯進(jìn)行萃取,取有機(jī)相調(diào)酸,取水相進(jìn)行溫水浴,將水浴的后的溶液進(jìn)行紫外分光光度計(jì)比色,得到的吸光度帶入線性公式計(jì)算發(fā)酵效價。實(shí)驗(yàn)證明,本發(fā)明的菌株生產(chǎn)紅霉素的能力強(qiáng),其發(fā)酵液的化學(xué)效價可達(dá)10000 μ g/mL,而且本發(fā)明菌株連續(xù)傳5代后其生產(chǎn)紅霉素的能力仍保持原來水平,表明其遺傳穩(wěn)定性好。用本發(fā)明菌株來制備紅霉素的方法,能夠提高生產(chǎn)紅霉素的效率,而且方法簡單、成本低廉。因此,本發(fā)明菌株及制備紅霉素的方法適合于在紅霉素的生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。


圖I是紅色糖多孢菌菌落形態(tài)圖;圖2是紅色糖多孢菌種子成熟時顯菌絲體形態(tài)圖;圖3是紅色糖多孢菌發(fā)酵60小時菌絲形態(tài)圖;圖4是紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖,其中組分A保留時間為5. 257min,面積為3428639 ;B組分保留時間為3. 147min ;C組分保留時間為7. 889 ;圖5是紅霉素樣品高效液相色譜圖,其中組分A保留時間為5. 260min,面積為3380373. 2出組分保留時間為3. 115min,峰面積為311 ;(組分保留時間為7. 808,峰面積為83715. 8。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下,對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換,均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明,實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例I菌株的分離及鑒定I、菌株的分離從黑龍江省寧安市隨機(jī)采集泥土樣品。將冷凍保藏的泥土樣品梯度稀釋,每個稀釋度涂布2-3塊雙碟培養(yǎng)基,34°C培養(yǎng)2-6周,培養(yǎng)時將雙碟放置在濕潤的紗布上面,保持一定的濕度,防止雙碟干燥;之后,每2-3天用相差顯微鏡觀察一次雙碟生長情況,將長出·的微生物菌落轉(zhuǎn)接至新雙碟(如發(fā)現(xiàn)微小菌落不再生長及時將菌落挑入液體10% LB培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)2周左右時間,待液體內(nèi)長出菌絲后,該菌已經(jīng)復(fù)蘇再進(jìn)行雙碟劃線),劃線,進(jìn)行形態(tài)觀察。2、菌株的鑒定紅色糖多孢菌是好氧型革蘭氏陽性放線菌,氣生菌絲為粉黃色,營養(yǎng)菌絲為黃色到黃褐色,產(chǎn)灰色或灰白色孢子。孢子呈球形或卵圓形,表面光滑。在蔗糖硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基中,氣絲厚,白色至淡粉色,基絲微黃色,后變紅色,無可溶色素;在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,基絲乳脂色,無可溶色素。菌體生長溫度為25-38°C。本發(fā)明分離的菌株其生長特性和形態(tài)均符合紅色糖多孢菌。菌落的形態(tài)如圖I所示,種子菌絲形態(tài)如圖2所示。通過PCR擴(kuò)增該菌的16SrDNA,PCR所用的引物序列為正向引物CGACAGTCATTGTTGGAGAG反向引物TGCTCCTTAGAAAGGAGGTG。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳,發(fā)現(xiàn)與目的條帶大小相同,為1542bp。測序后發(fā)現(xiàn),該菌與紅色糖多孢菌的16S序列相同,鑒定為紅色糖多孢菌。綜上鑒定結(jié)果,本發(fā)明菌株為紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea),將該菌株命名為BJX001。菌純化后進(jìn)行保藏入新菌種庫。從菌種庫中進(jìn)行活性篩選,得到本發(fā)明具有活性的紅色糖多孢菌菌株。該菌株于2011年4月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號,中國科學(xué)院微生物研究所,郵編100101),保藏編號為CGMCCNo. 4767,分類命名為紅色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)。實(shí)施例2發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素菌種培養(yǎng)基的配備I、培養(yǎng)基配方玉米淀粉12g/L,玉米漿6g/L,七水硫酸鎂lg/L,碳酸鈣3g/L,瓊脂22g/L,余量為水,滅菌前以氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 2。2、配制方法先向IL燒杯中加入蒸餾水700mL,置于帶有石棉網(wǎng)的電熱板上加熱,稱取玉米淀粉12g以IOOmL水溶解,待蒸餾水加熱至70-80°C左右時,將溶解的淀粉溶液緩緩注入蒸餾水中,并以玻璃棒勻速攪拌,以免淀粉因迅速受熱而板結(jié),待淀粉溶液澄清后,將燒杯浸入冷水中冷卻。分別稱取相應(yīng)量玉米漿、七水硫酸鎂加入50mL燒杯中,以30mL蒸餾水溶解后加入冷卻的玉米淀粉液中,攪拌均勻。冷卻至室溫后定容至1L,以10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7. 2。向調(diào)解pH值后的培養(yǎng)基中加入相應(yīng)量的碳酸鈣及瓊脂。充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠓謩e裝入IOOOmL的三角燒瓶中,每瓶500mL,依次用2層棉墊,牛皮紙,線繩包扎好后放入滅菌鍋內(nèi),以O(shè). IMPa, 121 °C的高壓蒸汽滅菌鍋滅菌30分鐘,待培養(yǎng)基溫度降到45°C 50°C時進(jìn)入無菌室內(nèi)的超凈工作臺上,按無菌操作向無菌雙碟中倒入25 30mL的培養(yǎng)基,凝固后可做分離菌種使用。另外,還可以將上述培養(yǎng)基制成茄瓶固體斜面在每個茄瓶(250mL)內(nèi)分裝入 80mL培養(yǎng)基,再依次用棉塞、2層紗布、牛皮紙、線繩包扎好后放入滅菌鍋內(nèi),以O(shè). IMPa,121°C的高壓蒸汽滅菌30min,待培養(yǎng)基溫度降到45°C 50°C時,取出茄瓶,在操作臺上擺成斜面,凝固后備用。發(fā)酵培養(yǎng)基的配備培養(yǎng)基配方玉米淀粉50g/L,黃豆餅粉20g/L,玉米漿10g/L,酵母粉5g/L,磷酸二氫鉀O. 5g/L,氯化鈉5g/L,豆油5g/L,碳酸鈣5g/L,余量為水,滅菌前pH調(diào)節(jié)為7. O。配制方法將稱好的玉米淀粉,按照配制固體培養(yǎng)基的方法液化到透明后,置于冷水中冷卻至室溫,分別將黃豆餅粉,酵母粉,玉米漿,磷酸二氫鉀,氯化鈉,豆油按相應(yīng)量稱取,加入小燒杯中,以少量水充分溶解后加入液化好的玉米淀粉中,攪拌均勻后調(diào)PH至
7.0,加入相應(yīng)量的碳酸鈣攪勻后,分裝入250mL三角燒瓶中,每瓶裝入量為35mL,然后依次用8層紗布墊,牛皮紙,線繩包扎好后放入滅菌鍋內(nèi),以O(shè). lMPa,121°C的高壓蒸汽滅菌30min。取出放入無菌緩沖間中自然冷卻,備用。發(fā)酵生產(chǎn)I)菌種活化將紅色糖多孢菌BJX001菌種凍存管自_80°C菌庫中取出后,自然解凍至室溫。以無菌移液器吸取O. 5mL菌懸液加入準(zhǔn)備好的斜面培養(yǎng)基中,以接種環(huán)涂布均勻,置于溫度36°C,濕度50 %的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)168小時左右。2)菌種分離。從成熟的活化菌種斜面中挖取Icm2左右的菌苔,放于帶有玻璃珠的無菌水三角瓶中,220r/min,震蕩lOmin。將震蕩后的孢子懸浮液進(jìn)行10倍梯度稀釋,之后將各稀釋梯度的懸浮液進(jìn)行涂布平板涂布,150 μ L/平板。將平板倒置于36°C,濕度50%的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。3)斜面培養(yǎng)。選擇合適濃度的涂布平板(每平板20-30個菌落),以無菌環(huán)挑取單菌落,接種于事先準(zhǔn)備的茄瓶培養(yǎng)基中,以“之”字形線路涂布均勻,置于36°C,50%濕度的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)168小時左右。4)搖瓶培養(yǎng)。從培養(yǎng)成熟的斜面菌種中挖取面積約Icm2大小的菌苔接種于事先準(zhǔn)備好的發(fā)酵培養(yǎng)基中,置于220rpm的搖床上培養(yǎng),培養(yǎng)溫度32°C,濕度60%。培養(yǎng)至48小時,向搖瓶中一次性補(bǔ)加過濾除菌的正丙醇(純度為50% )使終濃度達(dá)到10mL/L,之后繼續(xù)培養(yǎng)192小時,放瓶檢測產(chǎn)量。實(shí)施例3紅霉素的提取及產(chǎn)量檢測。I、化學(xué)法檢測。I)試液及配制A. O. 35%碳酸鉀稱取35g碳酸鉀溶于IOOOOmL水中,搖勻。B.醋酸丁酯透明清亮的工業(yè)丁酯。C. O. lmol/L鹽酸90mL鹽酸用水稀釋至IOOOOmL,搖勻。D. 8mol/L硫酸450mL硫酸緩緩倒入550mL水中,攪勻,冷卻后,標(biāo)定。
2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制A.精密稱取紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量,加少量乙醇溶解,用蒸餾水稀釋至100mg/mL。B.準(zhǔn)確量取lmL、2mL、3mL、4mL、5mL于試管中,分別用水稀釋至5mL,再加8mol/L的硫酸5mL,搖勻,于50°C水浴中保溫30分鐘。C.冷卻后,用721型分光光度計(jì)483nm處比色。D.以同樣溶劑作空白,以吸收度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出線性方程,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線表,見表I。表I標(biāo)準(zhǔn)曲線表
權(quán)利要求
1.紅色糖多抱菌(Saccharopolysporaerythraea) BJXOOI,其保藏號為 CGMCCNo.4767。
2.權(quán)利要求I所述的菌株在制備紅霉素中的應(yīng)用。
3.一種制備紅霉素的方法,該方法用權(quán)利要求I所述菌株發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素。
4.如權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,該方法包括如下步驟 (1)將紅色糖多孢菌BJXOOl接種于斜面菌種培養(yǎng)基中,置于35 371,55% 65%濕度的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)144 192小時; (2)從培養(yǎng)成熟的斜面菌種培養(yǎng)基中挖取面積約Icm2大小的菌苔接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,在溫度為30 34°C的條件下,振蕩培養(yǎng),相對濕度為50 % 60%,培養(yǎng)46 50小時后,向發(fā)酵培養(yǎng)基中一次性補(bǔ)加過濾除菌的正丙醇,使其質(zhì)量百分比終濃度為1.0%,控制發(fā)酵時間在168 216小時內(nèi),得到紅霉素。
5.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,所述的菌種培養(yǎng)基組份為玉米淀粉10 14g/L,玉米漿5 7g/L,七水硫酸鎂O. 8 I. 2g/L,碳酸鈣2. 5 3. 5g/L,瓊脂粉20 24g/L,余量為水,pH 7. O 7. 4。
6.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,所述的菌種培養(yǎng)基組份為玉米淀粉12g/L,玉米漿6g/L,七水硫酸鎂O. lg/L,碳酸鈣3g/L,瓊脂粉22g/L,余量為水,pH 7. 2。
7.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組份為玉米淀粉40 60g/L,黃豆餅粉16 24g/L,玉米衆(zhòng)8 12g/L,酵母粉4 6g/L,磷酸二氫鉀O. 4 O. 6g/L,氯化鈉4 6g/L,豆油4 6g/L,碳酸I丐4 6g/L,余量為水,pH 6. 5 7. 5。
8.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組份為玉米淀粉50g/L,黃豆餅粉20g/L,玉米漿10g/L,酵母粉5g/L,磷酸二氫鉀O. 5g/L,氯化鈉5g/L,豆油5g/L,碳酸鈣5g/L,余量為水,pH 7. O0
9.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,添加正丙醇的終濃度為10mL/L。
10.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,其中步驟2)所述溫度為32°C,所述振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為200 250r/min,旋轉(zhuǎn)半徑為50mm,發(fā)酵周期為192小時。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)新菌株BJX001,其保藏編號為CGMCC No.4767。本發(fā)明還提供了通過發(fā)酵紅色糖多孢菌BJX001可以得到紅霉素的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明,本發(fā)明的菌株其發(fā)酵方法生產(chǎn)紅霉素A組分的能力強(qiáng),生產(chǎn)紅霉素的化學(xué)效價可達(dá)10000μg/mL發(fā)酵液,且本發(fā)明菌株連續(xù)傳5代后其生產(chǎn)紅霉素有效組分A的能力保持原水平,表明其遺傳穩(wěn)定性好,能夠提高生產(chǎn)紅霉素的效率,而且方法簡單、成本低廉,適合于在紅霉素的生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
文檔編號C12R1/645GK102911874SQ20111022433
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者徐兵, 周賢龍, 王偉, 汪愛群 申請人:牡丹江佰佳信生物科技有限公司
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