專(zhuān)利名稱(chēng)：短枝束孢霉菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種其發(fā)酵物具有藥用、保健功能的微生物。
背景技術(shù)：
神經(jīng)酰胺(Ceramide)類(lèi)化合物，是一類(lèi)具有藥用、保健功能的化合物，其中部分化合物能夠保濕和抑制黑色素生成、防止皮膚粗糙，用于化妝或皮膚學(xué)方面對(duì)皮膚、毛發(fā)、指甲和睫毛進(jìn)行處理或治療和保護(hù)。此類(lèi)化合物用微生物發(fā)酵方式獲得尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種其發(fā)酵物具有藥用、保健功能的微生物—短枝束孢霉菌。
本發(fā)明所述的短枝束孢霉菌命名為短枝束孢霉Ym 35852 Calcarisporiumsp.Ym 35852，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號(hào)為CCTCC NOM203064。
本發(fā)明所述的短枝束孢霉菌系從夾竹桃科植物云南蘿芙木Rauwolfiayunnanaensis Tsiang植物活體中分離獲得的?，F(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專(zhuān)利局保藏單位保藏，保藏單位名稱(chēng)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2003年8月6日，保藏編號(hào)為M203064。
本發(fā)明所述的YM35852菌株的顯微形態(tài)特征1、無(wú)性世代菌絲無(wú)色有隔膜。分生孢子梗粗糙、無(wú)色或有色素。較大的梗輪枝狀分枝，初生的分枝通常變成細(xì)長(zhǎng)的造孢細(xì)胞；分生孢子(合軸孢子)無(wú)色光滑，單孢，長(zhǎng)圓形，單個(gè)著生分生孢子梗分枝頂部的瘤狀齒上，形成疏散的簇。5.0～6.25×2.5～3.75微米。
2、有性世代未發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明所述的短枝束孢霉菌的固體培養(yǎng)特征1、PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑47mm，7天蔓延。菌落圓形，灰褐色，中央稍帶黃色，絨絮狀，后期有粉狀，致密較厚，邊緣整齊，有隆起。背面黑褐色。
2、麥芽汁培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑38mm，7天49mm，11天蔓延。菌落圓形，灰白色，帶少量黑色顆粒，絨粉狀，邊緣不整齊，扁平較緊密。背面黑色。
3、察貝克培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑38mm，7天54mm，11天蔓延。菌落近圓形，邊緣不整齊，灰褐色，絨絮狀，緊密。背面褐色。
本發(fā)明所述的短枝束孢霉菌YM35852菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)1、培養(yǎng)基PDA搖瓶培養(yǎng)時(shí)間5～7天。培養(yǎng)溫度28℃±2℃。
2、發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第1天，菌種有零星的白色菌絲點(diǎn)；培養(yǎng)第2天，長(zhǎng)滿(mǎn)白色菌絲；培養(yǎng)第3天，發(fā)酵液菌絲體密集，菌絲體呈淡褐色；培養(yǎng)第4天，長(zhǎng)滿(mǎn)深黑褐色菌絲體，發(fā)酵液粘稠，培養(yǎng)第5～7天，發(fā)酵液菌絲體密集成塊狀，黑褐色菌絲體。
3、YM35852菌株液體發(fā)酵5～7天后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行化學(xué)提取、柱層析分離純化，得到1個(gè)抗皮膚致病菌及人骨髓白細(xì)胞腫瘤細(xì)胞活性化合物。所得化合物目前結(jié)構(gòu)尚不明確。
本發(fā)明所述的短枝束孢霉菌YM35852菌株液體發(fā)酵提取工藝為菌種→試管斜面→種子培養(yǎng)→發(fā)酵培養(yǎng)→發(fā)酵物提取→柱層析→混合化合物→純化→單體化合物。
上述步驟中，發(fā)酵原料為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)。本工藝適合于半知菌類(lèi)叢梗孢科絲狀真菌類(lèi)微生物。
上述的YM35852液態(tài)發(fā)酵工藝中，發(fā)酵條件參數(shù)如下(1)發(fā)酵方式液態(tài)發(fā)酵。
(2)菌種斜面試管斜面菌種培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(固體PDA)。
(3)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(液體PDA)。
馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)制備取新鮮馬鈴薯200克，去皮切成小塊，加水1升煮沸30分鐘，過(guò)濾棄馬鈴薯，濾夜加水補(bǔ)足至1升，加入葡萄糖20克，PH自然。
上述馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中加入瓊脂15克，即為固體PDA培養(yǎng)基。
(4)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(液體PDA)，PH自然。
(5)培養(yǎng)時(shí)間試管斜面菌種活化培養(yǎng)5天，種子搖床培養(yǎng)時(shí)間72～96小時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間5～7天。
(6)培養(yǎng)溫度試管斜面菌種培養(yǎng)溫度28℃±1℃，種子搖床培養(yǎng)溫度28℃±2℃，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28℃±2℃。
(7)發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢，分別收集發(fā)酵液和菌體。按常規(guī)化學(xué)提取方法，用工業(yè)己酸己酯分別提取3次合并抽干，得膏狀粗提化合物。
(8)分離化合物采用硅膠(Silica G)柱層析方法分離純化獲得神經(jīng)酰胺(Ceramide)化合物。
本發(fā)明是采用蘿芙木植物體中的內(nèi)生真菌作為發(fā)酵獲取神經(jīng)酰胺化合物的出發(fā)菌株。它是以馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)為原料，通過(guò)液態(tài)發(fā)酵方式，采用組合化學(xué)手段，分離提取神經(jīng)酰胺(Ceramide)有效成分的優(yōu)良菌株YM35852短枝束孢霉屬(Calcarisporium sp.)。該菌株是尋找人類(lèi)抗腫瘤及皮膚疾病藥用成分生物資源的重要微生物。用本菌株發(fā)酵液分離提取的神經(jīng)酰胺是新開(kāi)發(fā)出來(lái)的高效持久的補(bǔ)水保濕成分，與現(xiàn)在通用的保濕成分原理完全不同，它能與皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)相近，能很快滲入皮膚，和角質(zhì)層中的水分結(jié)合，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在皮膚表面形成一層保水膜，在為細(xì)胞體供水份和養(yǎng)份的同時(shí)鎖住水份，特別適合干性、成熟或被陽(yáng)光損傷的皮膚?？梢酝ㄟ^(guò)使用含神經(jīng)酰胺的外用膏類(lèi)產(chǎn)品，達(dá)到防止過(guò)敏性皮膚病的目的和抑制黑色素褐斑的效果。能誘導(dǎo)肝腫瘤Bel7402細(xì)胞凋亡采用MTT法、熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳、Western blot.方法，結(jié)果表明所提取的神經(jīng)酰胺對(duì)Bel7402細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的IC50值為14.28μmol-L-1。細(xì)胞核濃縮，熒光明顯增強(qiáng)；DNA呈現(xiàn)典型″梯型″變化；p53蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)；Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低；Bax蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。


圖1為YM35852真菌菌絲體及分生孢子梗(200X)。
圖2為YM35852真菌分生孢子形態(tài)(400X)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明實(shí)施例取編號(hào)YM35852菌種，在無(wú)菌條件下(無(wú)菌室或超凈工作臺(tái))，用接種針挑取少許菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管(18×180mm)中，置培養(yǎng)箱內(nèi)28℃±1℃活化培養(yǎng)5天。
取出活化5天的菌種，在無(wú)菌條件下，以同樣方式接入活化好的菌種到已滅菌的種子液體PDA培養(yǎng)基中，在28℃±2℃下?lián)u床培養(yǎng)72～96小時(shí)，即為YM35852種子。
發(fā)酵采用500毫升玻璃三角瓶，裝入配制好的液體PDA培養(yǎng)基100毫升，15磅滅菌30分鐘后，取出待冷卻至30℃。在無(wú)菌條件下，取YM35852種子，接種于裝有100毫升液體PDA培養(yǎng)基的500毫升玻璃三角瓶中，種子接種量為5～10％(v/w)，置28℃±2℃通氣培養(yǎng)5～7天。在發(fā)酵期間，注意發(fā)酵室溫度變化，檢查有無(wú)染菌現(xiàn)象。
發(fā)酵完畢，分別收集發(fā)酵液和菌體。用工業(yè)己酸己酯萃取發(fā)酵液3次，合并抽干；菌體用工業(yè)己酸己酯浸泡過(guò)夜3次，合并抽干。得膏狀粗提化合物。
分離化合物粗提化合物采用硅膠(Silica G)柱層析，分別用三氯甲烷甲醇和石油醚∶己酸己酯＝95∶5洗脫，分離純化獲得神經(jīng)酰胺(Ceramide)化合物。該化合物按0.2mg/ml劑量，對(duì)人骨髓白血病細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到73.33％。
本發(fā)明所述菌株的18SRNA部分序列分析如下(700bp)TGTTACGAACACCGCAACAGCTTTCGCTGGCGGACGGACTATATCTTAGGCCTGCGTGCGCAAGCCCACCCCTATCTAGTCTCTGAACCTTCCCCCTATAACGAGGGGGCTTGGCTGCGAGTGGCCCAACCCTCCAGCAGTGTTACCGTACCCGGAGCAGTTACGCCCGGCCGCCGCGCCTATTTCTAGGGCGGTTTGGTCGCTGGAGGTTTAAGGGTTTTCCCGCACTTTAGGGATGTCGCCGCTCCGTCTAGGGGAGCGACTAGCGGTCTTAGGTACACCACCTTCCTGTAGACACAGGCCGCTTTCGGGGGCAGAGACGCTGCGGAATCTTGTTTACCCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAACGAGTCAAAAAATAACATCGTCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGCAGGTACCCCGCGGCTTTTCAGCGGCGGCTCGACTATATTTTAAGGGCGCTACAGCGGAGCGCTCCCACCGACATTTAGTCTGTGAACTGCATCCTGGCGCCCCGAGGCGCCGTACGGACTTGGCTGCGGATTGTCCAATCCCTCACACTATTACGACTCGCCGCTATTTCTAGCCGCGAGGTGTGGTGAGGGC。
權(quán)利要求
1.一種短枝束孢霉菌，其特征是命名為短枝束孢霉Ym 35852Calcarisporium sp.Ym 35852，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號(hào)為CCTCC NOM203064。
2.按照權(quán)利要求1所述的短枝束孢霉菌，其特征是所述菌株的18SRNA部分序列分析如下TGTTACGAACACCGCAACAGCTTTCGCTGGCGGACGGACTATATCTTAGGCCTGCGTGCGCAAGCCCACCCCTATCTAGTCTCTGAACCTTCCCCCTATAACGAGGGGGCTTGGCTGCGAGTGGCCCAACCCTCCAGCAGTGTTACCGTACCCGGAGCAGTTACGCCCGGCCGCCGCGCCTATTTCTAGGGCGGTTTGGTCGCTGGAGGTTTAAGGGTTTTCCCGCACTTTAGGGATGTCGCCGCTCCGTCTAGGGGAGCGACTAGCGGTCTTAGGTACACCACCTTCCTGTAGACACAGGCCGCTTTCGGGGGCAGAGACGCTGCGGAATCTTGTTTACCCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAACGAGTCAAAAAATAACATCGTCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGCAGGTACCCCGCGGCTTTTCAGCGGCGGCTCGACTATATTTTAAGGGCGCTACAGCGGAGCGCTCCCACCGACATTTAGTCTGTGAACTGCATCCTGGCGCCCCGAGGCGCCGTACGGACTTGGCTGCGGATTGTCCAATCCCTCACACTATTACGACTCGCCGCTATTTCTAGCCGCGAGGTGTGGTGAGGGC。
3.按照權(quán)利要求1所述的短枝束孢霉菌，其特征是所述菌株的固體培養(yǎng)特征為一、PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑47mm，7天蔓延，菌落圓形，灰褐色，中央稍帶黃色，絨絮狀，后期有粉狀，致密較厚，邊緣整齊，有隆起，背面黑褐色；二、麥芽汁培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑38mm，7天49mm，11天蔓延，菌落圓形，灰白色，帶少量黑色顆粒，絨粉狀，邊緣不整齊，扁平較緊密，背面黑色；三、察貝克培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑38mm，7天54mm，11天蔓延，菌落近圓形，邊緣不整齊，灰褐色，絨絮狀，緊密，背面褐色。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種其發(fā)酵物具有藥用、保健功能的微生物。本發(fā)明所述的短枝束孢霉菌命名為短枝束孢霉Ym 35852 Calcarisporium sp.Ym 35852，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號(hào)為CCTCC NOM203064。本發(fā)明是采用蘿芙木植物體中的內(nèi)生真菌作為發(fā)酵獲取神經(jīng)酰胺化合物的出發(fā)菌株。該菌株是尋找人類(lèi)抗腫瘤及皮膚疾病藥用成分生物資源的重要微生物。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1618951SQ20031011678
公開(kāi)日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者楊麗源, 陳有為, 夏國(guó)興, 余斌, 李紹蘭, 周斌, 李治瀅, 張琦 申請(qǐng)人:金華夏洋生物技術(shù)有限公司