一種千層塔內(nèi)生被孢霉菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種千層塔內(nèi)生被孢霉菌及其應用。
【背景技術】
[0002]千層塔(Huperziaserrata(Thunb.)Trev.)為石松目(Lycopodiales)石杉科(Lycopodiaceae)石杉屬(Lycopodium L.)多年生草本蕨類植物。千層塔始載于《植物名實圖考》，性味辛苦、平。具有散瘀消腫、解毒和止痛的功效。1927年我國科技工作者報道了從該植物中分離的石杉堿甲具有橫紋肌松弛作用，之后的大量研究發(fā)現(xiàn)石杉堿甲是一種高效、低毒、可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑。現(xiàn)在，被石杉堿甲及經(jīng)作為治療阿爾茨海默病(AD，Alzheimer disease)的藥物，同時在美國被用做益智的營養(yǎng)保健品。
[0003]千層塔是重要的藥用低等蕨類植物，現(xiàn)存的該類植物大多生長緩慢，野生狀態(tài)下千層塔的繁殖主要以孢子繁殖為主，孢子萌發(fā)周期長，萌發(fā)后屬地下生配子體，需6-15年才能成熟。因此極大地限制了千層塔野生資源的再生。千層塔中的石杉堿甲含量又很低(0.007%)，再加上其全合成石杉堿甲步驟繁瑣、價格昂貴且有副作用。目前，石杉堿甲的提取主要依賴于野生資源，提取率僅為0.006% -0.1%，因而大量的市場需求、受限的自然資源和自身生長繁殖的限制。因此，不論是石杉堿甲直接或者間接獲得都是以千層塔的原植物為原料，這種自然界有限的資源將處于滅絕的邊緣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于，提供一種千層塔內(nèi)生被孢霉菌及其應用，該被孢霉菌的分類命名為被孢霉(Mortierella sp.)，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期:2015年6月10日，保藏編號:CGMCC10769，CGMCC10769可使千層塔中石杉堿甲的量提高到對照的1.3倍，為獲得高含量石杉堿甲的千層塔資源提供新途徑。
[0005]為了實現(xiàn)上述任務，本發(fā)明采取如下的技術解決方案:
[0006]—種千層塔內(nèi)生被孢霉菌，該被孢霉菌的名稱為被孢霉，Mortierella sp.，該被孢霉菌的保藏編號為CGMCC10769。
[0007]所述的千層塔內(nèi)生被孢霉菌促進千層塔中石杉堿甲生成的應用。
[0008]具體的，該應用包括在千層塔植株移栽培養(yǎng)過程中將千層塔內(nèi)生被孢霉菌菌絲放置在千層塔植株的根部用于促進千層塔中石杉堿甲生成。
[0009]更具體的，將質(zhì)量為20?SOmg千層塔內(nèi)生被孢霉菌菌絲放置在單株千層塔的根部用于促進千層塔中石杉堿甲生成。
[0010]再具體的，將千層塔植株在溫度為25°C ±2°C、光照強度為2000LUX和光周期16小時的條件下進行移栽培養(yǎng)。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0012](I)本發(fā)明從千層塔根部分離出高山被孢霉(Mortierella alpina)，該被孢霉菌的分類命名為被孢霉(Mortierella sp.)，保藏編號:CGMCC10769，通過在千層塔植株栽培過程中加入該菌的菌絲體溶液，可明顯提高千層塔中石杉堿甲的含量，從而為獲得高含量石杉堿甲的千層塔資源提供新途徑；
[0013](2)本發(fā)明通過在千層塔植株栽培過程中添加從其根部分離出的高山被孢霉活菌絲，可使千層塔中石杉堿甲的含量提高到0.052%，每株千層塔植株根部周圍澆灌的內(nèi)生真菌懸浮液中內(nèi)生真菌菌絲的劑量為60mg。
【具體實施方式】
[0014]根際內(nèi)生真菌侵染宿主后，與宿主穩(wěn)定的長期相互作用即形成內(nèi)生菌根。內(nèi)生菌根能與80 %的陸生植物形成共生關系，這種共生關系有利于提尚植物抗御不良環(huán)境的能力，促進植物生長。目前大量研究表明內(nèi)生菌根能促進植物吸收土壤中的無機鹽等養(yǎng)分，誘導產(chǎn)生植物激素，例如細胞分裂素和赤霉酸，促進植物生長，分泌生物堿、萜類、類黃酮和類固醇等抗菌活性物質(zhì)，幫助植物防御病原體，提高植物的抗病性等。
[0015]本發(fā)明從千層塔根部分離出高山被孢霉(Mortierella alpina)，該被孢霉菌的分類命名為被孢霉(Mortierella sp.)，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期:2015年6月10日，保藏編號:CGMCC10769，通過在千層塔植株栽培過程中加入該菌的菌絲體溶液，可明顯提高千層塔中石杉堿甲的含量，從而為獲得高含量石杉堿甲的千層塔資源提供新途徑。
[0016]采用該方法能夠使千層塔中石杉堿甲的含量提高30 %從而為獲得高含量石杉堿甲的千層塔資源提供新途徑。
[0017]本發(fā)明的千層塔野生植株采自湖北省恩施市盛家壩鄉(xiāng)。
[0018]CGMCC10769 的分離:
[0019]取野生千層塔新鮮的根，用0.1%氯化汞溶液進行表面滅菌，取其根毛區(qū)，用5%次氯酸鈉溶液進行表面滅菌；然后放置到PDA固體培養(yǎng)基(馬鈴薯200g、葡萄糖20g)上培養(yǎng)；培養(yǎng)30天后，獲得內(nèi)生菌菌絲體。
[0020]再通過PDA固體培養(yǎng)基，采用平板劃線法獲得內(nèi)生菌的純培養(yǎng)物；
[0021]CGMCC10769 的鑒定:
[0022]將CGMCC10769通過分子生物學方法進行鑒別，rDNA的ITS片段的擴增產(chǎn)物與GENBANK中的高山被孢霉(Mortierella alpina)序列比對，近緣性多99%。該菌的ITS序列如下(從5’ 一3’端):
[0023]TTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGCCCTACCTGATTTCAGATCAAAATTTGAATGAGTTTTCTGTATTATCAAGACTGACTCCTGGAGCAAATGTTAGCCAAAGATTTGACAATGAATGCCAAAACTATTAGGCCAAACTGCTGTATTAGGTGACAGCCAAGAACTACATTTTAAAAGGGCCAACCATGACAGTCGGCGCATTCCAATTCCACGCCATAAACCCAAAGGTTAGGTGTGAGAGTGCTCATGATACTGAAACAGGCATACTCCTCGGAATACCAAGGAGTGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTTTTAAACAGATTATTAAAATCATTTGTTTAATTGTTCAGAAAAAATTTCATAAGGATGATATATTGTTTTTGGGACCGGCCCTTGCGAACCATTTTAAAGTCCCAAAATTACATACGGTCAAAGCCAGCACAAAGGAAAAGATCTTTCAGTGTTGAAAGATTTCTCTTGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAG。
[0024]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0025]實施例1:
[0026]將千層塔株高大于5cm的野生植株移栽到水苔基質(zhì)中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25°C ±2°C，光照強度為2000Lux、光周期16小時。2個月后千層塔中石杉堿甲的含量為0.019%。
[0027]實施例2:
[0028](I)千層塔根被孢霉屬真菌的分離
[0029]取野生千層塔新鮮的根，用0.1%氯化汞溶液進行表面滅菌，取其根毛區(qū)，用5%次氯酸鈉溶液進行表面滅菌；然后放置到PDA固體培養(yǎng)基(馬鈴薯200g、葡萄糖20g)上培養(yǎng)；培養(yǎng)30天后，獲得內(nèi)生菌菌絲體；
[0030]再通過PDA固體培養(yǎng)基，采用平板劃線法獲得內(nèi)生菌的純培養(yǎng)物；
[0031](2)內(nèi)生菌滅活菌絲的制備
[0032]將內(nèi)生菌純培養(yǎng)物接種于PDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件在28°C、搖床轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘的培養(yǎng)條件下獲得菌絲體，將菌絲冷藏于4°C下過夜。次日取出，在室溫下用攪拌機將菌絲打斷，然后用自來水稀釋備用。
[0033](3)千層塔中石杉堿甲的誘導
[0034]將千層塔高于5cm的野生植株移栽到水苔基質(zhì)中，培養(yǎng)2周后，將滅活的菌絲懸浮液澆灌到千層塔小苗根部周圍，每株千層塔植株根部周圍澆灌的內(nèi)生真菌懸浮液中內(nèi)生真菌菌絲的質(zhì)量為20mg。培養(yǎng)溫度25°C ±2°C，光照強度為2000Lux、光周期16小時。
[0035]2個月后測定千層塔中石杉堿甲的含量為0.022%。
[0036]實施例3:
[0037]本實施例與實施例2不同的是，將千層塔移栽到水苔基質(zhì)中，培養(yǎng)2周后，將滅活的菌絲懸浮液澆灌到千層塔小苗根部周圍，每株千層塔植株根部周圍澆灌的內(nèi)生真菌懸浮液中內(nèi)生真菌菌絲的劑量為40mg。培養(yǎng)溫度25°C ±2°C，光照強度為2000LUX、光周期16小時。2個月后測定千層塔中石杉堿甲的含量為0.036%。
[0038]實施例4:
[0039]本實施例與實施例2不同的是，將千層塔移栽到水苔基質(zhì)中，培養(yǎng)2周后，將滅活的菌絲懸浮液澆灌到千層塔小苗根部周圍，每株千層塔植株根部周圍澆灌的內(nèi)生真菌懸浮液中內(nèi)生真菌菌絲的劑量為60mg。培養(yǎng)溫度25°C ±2°C，光照強度為2000LUX、光周期16小時。2個月后測定千層塔中石杉堿甲的含量為0.052%。
[0040]實施例5:
[0041]本實施例與實施例2不同的是，將千層塔移栽到水苔基質(zhì)中，培養(yǎng)2周后，將滅活的菌絲懸浮液澆灌到千層塔小苗根部周圍，每株千層塔植株根部周圍澆灌的內(nèi)生真菌懸浮液中內(nèi)生真菌菌絲的劑量為80mg。培養(yǎng)溫度25°C ±2°C，光照強度為2000LUX、光周期16小時。2個月后測定千層塔中石杉堿甲的含量為0.050%。
【主權(quán)項】
1.一種千層塔內(nèi)生被孢霉菌，其特征在于，該被孢霉菌的名稱為被孢霉，Mortierellasp.，該被孢霉菌的保藏編號為CGMCC10769。2.權(quán)利要求1所述的千層塔內(nèi)生被孢霉菌促進千層塔中石杉堿甲生成的應用。3.如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，該應用包括在千層塔植株移栽培養(yǎng)過程中將千層塔內(nèi)生被孢霉菌菌絲放置在千層塔植株的根部用于促進千層塔中石杉堿甲生成。4.如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，將質(zhì)量為20?80mg千層塔內(nèi)生被孢霉菌菌絲放置在單株千層塔植株的根部用于促進千層塔中石杉堿甲生成。5.如權(quán)利要求2、3或4所述的應用，其特征在于，將千層塔植株在溫度為25°C±2°C、光照強度為2000LUX和光周期16小時的條件下進行移栽培養(yǎng)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種千層塔內(nèi)生被孢霉菌及其應用，該被孢霉菌的分類命名為被孢霉(Mortierella？sp.)，保藏編號：CGMCC？10769，CGMCC？10769可使千層塔中石杉堿甲的量提高到對照的1.3倍，為獲得高含量石杉堿甲的千層塔資源提供新途徑。該霉菌發(fā)酵獲得菌絲，將菌絲稀釋后施加到千層塔培養(yǎng)基質(zhì)中，從而提高千層塔中石杉堿甲的含量，達到對照的130％。該方法將千層塔的內(nèi)生真菌作為生物誘導劑添加到栽培基質(zhì)中，可顯著提高千層塔中石杉堿甲的含量，從而為獲得高含量石杉堿甲的千層塔資源提供新途徑。CGMCC 1076920150610
【IPC分類】C12N1/14, C12R1/645, A01N63/04, A01P21/00
【公開號】CN105039173
【申請?zhí)枴緾N201510398129
【發(fā)明人】郭斌, 馮世蘭, 陳習, 何美娜, 何瑋, 尉亞輝
【申請人】西北大學
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年7月8日