一種高產(chǎn)松茸誘變菌株及培育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到一種高產(chǎn)松茸誘變菌株，為一種新的菌株品種，本發(fā)明還提供了該 菌株的培育方法，屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 松鸞（TricholomamatsutakeSing.)屬擔(dān)子菌、擔(dān)子菌綱、傘菌目、口蘑科、口蘑 屬，又名杉蕈、松菇、合菌、臺菌、松菌。松茸使用歷史悠久，全球分布廣泛，肉白嫩肥厚，質(zhì)地 細(xì)密，有濃郁的特殊香氣，其營養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、氨基酸、多種維生素、碳水化合物和礦 物質(zhì)等有效成分，是名貴的野生菌類。松茸的主要生物活性物質(zhì)是多糖、多肽和留醇等，藥 理作用方面研究表明松茸具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗輻射和治療糖尿病等功能，具 有良好的藥用前景和開發(fā)價值。
[0003]目前松茸主要來源于野生采摘，人工栽培十分困難，大量的市場需求造成松茸資 源枯竭、生態(tài)環(huán)境遭到破壞同時導(dǎo)致價格高昂，這就給松茸產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來很大的障礙。采用 現(xiàn)代生物工程技術(shù)，通過發(fā)酵菌株的人工改良和發(fā)酵工藝過程的優(yōu)化兩種途徑，快速、有 效的獲得松茸有效產(chǎn)物以打破目前發(fā)展屏障，為松茸產(chǎn)業(yè)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種松茸誘變菌株，為一種新的菌株，其菌絲體干重、多 糖、腺苷、甘露醇含量和野生菌相比有顯著提高。
[0005] 本發(fā)明還提供了該菌株的培育方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] 本發(fā)明所提供的松茸誘變菌株：在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址：武 漢大學(xué)，保藏日期：2014年12月25日，分類名稱：松茸T35TricholomamatsutakeT35 ; 保藏登記號為CCTCCNO:M2014671。
[0007] 本發(fā)明所述的松茸菌株培育方法，包括以下步驟： (1) 將保藏號為CGMCC5. 793松茸菌株，活化后接種于PDA斜面，在23-27〇C恒溫箱中 培養(yǎng)4-8天，向斜面培養(yǎng)基中注入pH6. 0磷酸緩沖液，然后用4層紗布過濾，稀釋孢子濃度 至106-107個/mL，用于誘變育種； (2) 稱取10mg亞硝基胍于直徑7cm的培養(yǎng)皿中，加助溶劑丙酮少許后，加入無菌磷酸 緩沖液9mL(pH=6. 0)，開啟磁力攪拌器慢慢攪拌，待NTG充分溶解后吸取lmL菌懸液放入平 皿開始誘變（亞硝基胍終濃度為lmg/mL)。分別誘變2min、5min、10min、15min和20min之 后，取0. 3mL菌懸液于2. 7mL無菌蒸餾水并逐級稀釋； (3 )對誘變后的孢子懸液，進行梯度稀釋，PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)3-7天后，將長出的單菌 落用滅過菌的牙簽點對點植入裝有PDA固體培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的突變株 用接種針逐個接種于250mL錐形瓶中進行培養(yǎng)，26oC150rpm培養(yǎng)4-6天獲得松茸菌絲體， 測定菌絲體干重、多糖、甘露醇以及腺苷含量，篩選高產(chǎn)的松茸菌株； (4)獲得的高產(chǎn)松茸誘變菌株經(jīng)過連續(xù)傳代，培養(yǎng)條件為26〇C，150rpm恒溫?fù)u床中培 養(yǎng)90-120h，測定菌絲體干重、多糖、甘露醇以及腺苷含量，考察誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性，從 而最終確定目的菌株。
[0008] 該松茸誘變菌株T35菌絲生長快速，菌絲體為白色，可進行快速液體深層培養(yǎng)，該 菌株的液體深層發(fā)酵特征如下： (1) 一級斜面菌種 斜面培養(yǎng)基：葡萄糖15_25g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母浸粉5-lg/L，KH2P04 0.1- 0.7g/L，MgS07.H20 0? 1-0. 6g/L，維生素B1 0? 05-0. 5g/L，瓊脂 25g/L; 斜面菌種培養(yǎng)溫度26±l〇C，4-7天菌絲長滿斜面，放冰箱（2-4〇C)保存?zhèn)溆茫?(2) 二級搖瓶菌種 種子培養(yǎng)基：葡萄糖15_25g/L，蛋白胨5-15g/L，酵母浸粉5-158/1，狃2卩04 0.1-0? 7g/L，MgS07. H20 0? 1-0. 6g/L，維生素B1 0? 05-0. 5g/L ; 種子培養(yǎng)方法：將斜面母種接入液體種子培養(yǎng)基，在26± 10C，120-160r/min的搖床， 培養(yǎng)5d; (3 )搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液按5%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖18-25g/L，酵母浸粉15-25g/L，KH2P04 0.3- 0.6g/L，MgS07.H20 0.3-0. 6g/L，維生素B1 0.05-0. 3g/L)中進行液體發(fā)酵， 發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為250mL的搖瓶裝100mL，培養(yǎng)溫度260C搖床轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)5d后 收獲菌絲體； (4) 100L發(fā)酵罐放大培養(yǎng) 將種子液按7%接種量接入60L液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于100L發(fā)酵罐中進行液體深層發(fā) 酵培養(yǎng)，26oC，150r/min，通氣量 3-5L/min，初始pH為 5. 0,培養(yǎng) 48h。
[0009] 本發(fā)明所述的松茸誘變株的特征為： (1)松茸誘變菌株菌絲體干重、腺苷、粗多糖和甘露醇四種有效成分的含量與原始菌 株相比均有明顯提高，其中菌體體干重達(dá)15. 178/L，較原出發(fā)菌提高了 69. 68% ;腺苷含量 可達(dá)0. 0359g/L，較原出發(fā)菌提高了 33. 96% ;多糖含量可達(dá)1. 780g/L，較原出發(fā)菌提高了 75. 72% ;甘露醇含量可達(dá)0. 327g/L，較原出發(fā)菌提高52. 8%。
[0010] (2)松茸誘變菌株經(jīng)過20次以上的連續(xù)傳代培養(yǎng)不退化，具有遺傳穩(wěn)定性。
[0011] 本發(fā)明的積極效果在于：誘變的松茸新菌株經(jīng)1〇次以上傳代培養(yǎng)不退化，具有遺 傳穩(wěn)定性，并且胞內(nèi)多糖、腺苷和甘露醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)比原始菌高出許多倍。
【附圖說明】
[0012] 圖1、碳源對期望值的影響； 圖2、氮源對期望值的影響； 圖3、無機鹽對期望值的影響； 圖4、圖5、圖6各因素間的響應(yīng)面及等_線圖。
【具體實施方式】
[0013] 為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發(fā)明的闡釋而 非對本發(fā)明的任何形式的限制。
[0014] 實施例1: 松茸突變株的誘變和選育方法 (1)松茸誘變 將保藏號為CGMCC5. 793松茸菌株的出發(fā)菌種，活化后接種于PDA斜面，在26〇C恒溫 箱中培養(yǎng)6天，向斜面培養(yǎng)基中注入pH6. 0磷酸緩沖液，然后用4層紗布過濾，稀釋孢子濃 度至107個/mL，用于誘變育種。稱取10mg亞硝基胍于直徑7cm的培養(yǎng)皿中，加助溶劑丙 酮少許后，加入無菌磷酸緩沖液9mL(pH=6. 0)，開啟磁力攪拌器慢慢攪拌，待NTG充分溶解 后吸取lmL菌懸液放入平皿開始誘變（亞硝基胍終濃度為lmg/mL)。分別誘變2min、5min、 lOmin、15min和20min之后，取0. 3mL菌懸液于2. 7mL無菌蒸饋水并逐級稀釋。對誘變后的 孢子懸液，進行梯度稀釋，PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)5天后，將長出的單菌落用滅過菌的牙簽點 對點植入裝有PDA固體培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的突變株用接種針逐個接種于 250mL錐形瓶中進行培養(yǎng)，26oC150rpm培養(yǎng)5天獲得松茸菌絲體，測定菌絲體干重、多糖、 甘露醇以及腺苷含量，篩選高產(chǎn)的松茸菌株。獲得的高產(chǎn)松茸誘變菌株經(jīng)過連續(xù)傳代，培養(yǎng) 條件為26 〇C，150rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)120h，測定菌絲體干重、多糖、甘露醇以及腺苷含量， 考察誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性，從而最終確定目的菌株。
[0015] (2)四種有效成分的提取及含量的測定 將誘變得到的突變菌株保存于48孔板中，離心菌絲體，5000rpm，離心lOmin，水洗一 次，菌絲體鋪于平板凍干，凍干粉末稱重，粉碎，過60目篩。稱取松茸菌絲體干粉0.lg， 加入5mL蒸饋水，80〇C水浴浸提3h, 8000g/min離心lOmin,取上清測定菌絲體多糖含量。 稱取松鸞菌絲體干粉0.lg,加入5mL蒸饋水，45oC水浴浸提3h, 8000g/min離心lOmin,取 上清測定菌絲體腺苷和甘露醇含量。采用蔥銅-硫酸法測定總糖含量；DNS方法測定還原 糖含量，多糖含量二總糖含量一還原糖含量。
[0016] (3)高產(chǎn)誘變株的篩選 從誘變的松茸突變體中，篩選出菌絲體干重和四種有效成分含量明顯提高的優(yōu)良菌 株（見表1)，然后進行傳代培養(yǎng)，每隔一代測定菌株干重及三種有效成分含量，測量方法 同步驟（2)，共培養(yǎng)10代，考察篩選得到高產(chǎn)誘變株的穩(wěn)定遺傳特征。
[0017]表1誘變菌株四項指標(biāo)提_值
表2誘變菌株T35遺傳穩(wěn)定性考察_

實施例2: