一種高效快速構(gòu)建沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物育種領(lǐng)域，涉及一種高效快速構(gòu)建植物突變體庫的方法，尤其涉 及一種通過理化誘變劑復(fù)合誘變（r射線和甲基磺酸乙酯（EMS))高效快速創(chuàng)制沿階草飽和 高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 沿階草又名麥冬（Ophiopogon japonicus)，有三個種，沿階草（Ophiopogon bodinieri.);矮生沿階草（Ophiopogon japonicus f. nanus)和黑沿階草 (0· japonicus (L. f. )Ker-Gawl·)，均屬于百合科沿階草屬。沿階草是我國特有的觀葉多年 生常綠草本地被植物，因其植株低矮，具強(qiáng)喜蔭性，抗病抗蟲性好，終生免修剪等特性，而作 為許多地方理想的觀葉地被植物或園林綠化中的構(gòu)景植物；沿階草還具有藥用性，其塊根， 常為滋陰中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，還是"藥食同源"品種，其豐富的多糖和高異黃銅 類化合物在保健食品的開發(fā)方面也有大量的應(yīng)用。沿階草野生種質(zhì)資源在我國非常豐富， 生產(chǎn)上主要以開發(fā)利用為主，研究方面主要集中在組培快繁方面，近年來隨著開發(fā)力度的 增大，其品種改良不斷得到重視，其特有的一些生物學(xué)性狀如矮生性、強(qiáng)耐蔭性、藥理活性 和化學(xué)成分的分析研究等也不斷得到加強(qiáng)，使得它成為尋找某些有重要利用價值的基因如 矮生基因、耐蔭基因和控制多糖和高異黃銅類化合物等基因資源發(fā)掘利用的典型材料。所 以創(chuàng)建沿階草突變體庫，不但對于進(jìn)行大規(guī)模、高通量的沿階草功能基因組研究意義重大， 還對加速獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的重要基因（外可用于鑒定和分離基因，內(nèi)可用于篩查特 殊基因）和培育優(yōu)質(zhì)、耐逆性強(qiáng)、生態(tài)安全性高的沿階草新品種具有重要的戰(zhàn)略意義；同 時，也為沿階草正向遺傳學(xué)和功能基因組學(xué)分析提供豐富的研究材料，具有重要的現(xiàn)實(shí)意 義。
[0003] 目前模式植物擬南芥、水稻等作物均已構(gòu)建了飽和突變體庫并進(jìn)行了相關(guān)功能基 因組學(xué)的研究，獲得了一批有重要價值的創(chuàng)新種質(zhì)資源。隨著新技術(shù)和新方法在植物功能 基因組研究中的發(fā)展完善，高效快速大規(guī)模地創(chuàng)制與品質(zhì)、抗逆性等密切相關(guān)的同質(zhì)突變 體庫已成為很多植物某類特定功能基因組學(xué)研究或如抗寒遺傳學(xué)、分子生物學(xué)機(jī)理等非常 重要的材料，目前有關(guān)沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的創(chuàng)建國內(nèi)外均未見報道。
[0004] 利用化學(xué)或物理誘導(dǎo)劑獲得突變體是目前許多植物構(gòu)建突變體庫的主要方法。因 其操作簡便，產(chǎn)生的突變可隨機(jī)分布于整個基因組、密度高，成本低，特別適宜于飽和突變 體庫的創(chuàng)制，而且所獲得的突變體不涉及轉(zhuǎn)基因事件，所以安全性高、便于應(yīng)用。
[0005] 在眾多理化誘變劑中，甲基橫酸乙酯（Ethyl methane sulphonate，EMS)和6°C〇-y射線是應(yīng)用最廣泛，即高效又穩(wěn)定的理化誘變劑。其中EMS可在一個基因組上產(chǎn)生 多個點(diǎn)突變，且分布均勻，有利于等位基因突變體的獲得，特別是其較小的突變?nèi)后w便可獲 得飽和的突變體庫；而r射線主要引起DNA片段的缺失和染色體重排，特別適用于多個家族 基因功能缺失的突變體庫的創(chuàng)建。所以如果這兩種方法結(jié)合在一起使用，即通過一種復(fù)合 誘變方法，不但通過優(yōu)勢互補(bǔ)，增加突變體庫的容量，還能滿足對飽和突變體庫的要求。目 前兩種方法相結(jié)合一起使用構(gòu)建植物突變體庫還未見報道，尤其是利用兩種方法相結(jié)合構(gòu) 建沿階草飽和突變體庫國內(nèi)外未見報道。
[0006] 在理化誘變后及時使用選擇壓力對基因突變的細(xì)胞進(jìn)行篩選可在一定程度上實(shí) 現(xiàn)定向誘變，也可以發(fā)展為定向誘導(dǎo)基因組某一類型突變或者以其高通量篩選技術(shù)高效快 速大量獲得定向細(xì)胞突變體，由此產(chǎn)生定向同質(zhì)突變體庫。
[0007] 長期以來大部分植株再生都不是依賴于細(xì)胞水平上的再生，而是局限于個體或 器官組織水平的再生，由多細(xì)胞組織器官誘變產(chǎn)生的再生植株后代，因其個體眾多細(xì)胞基 因突變的差異性往往導(dǎo)致突變體嵌合現(xiàn)象很嚴(yán)重，性狀不穩(wěn)定、重復(fù)性差、再生篩選時間延 長，同質(zhì)突變體頻率很低、由于很難獲得同質(zhì)突變體，從而導(dǎo)致育種效率下降等一系列弊 端。
[0008] 如何使一個單細(xì)胞發(fā)育成一棵完整植株，一直是許多植物組培再生的難題。目前 的研究表明絕大多數(shù)植物體細(xì)胞胚起源于單細(xì)胞，體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑重演了合子胚形態(tài) 發(fā)生的過程，所以體細(xì)胞胚是高效再生種子來源、種苗脫毒快繁、誘導(dǎo)體細(xì)胞變異或基因轉(zhuǎn) 化的理想的受體系統(tǒng)。
[0009] 研究表明：體細(xì)胞誘變、體細(xì)胞定向篩選及體細(xì)胞胚再生是高效快速定向獲得同 質(zhì)突變體、避免嵌合體形成的理想方法，很容易在短時間內(nèi)獲得大量的某一類型多性狀的 同質(zhì)突變體，產(chǎn)生表型可見并且遺傳穩(wěn)定的突變體庫。所以體細(xì)胞理化誘變技術(shù)結(jié)合體細(xì) 胞突變篩選技術(shù)及體細(xì)胞胚再生技術(shù)，不但是保證高效快速獲得飽和同質(zhì)突變體庫的關(guān)鍵 技術(shù)，還是保證高效快速定向獲得同質(zhì)突變體庫的關(guān)鍵技術(shù)。
[0010]目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)利用沿階草體細(xì)胞通過r射線和EMS復(fù)合誘變再通過體細(xì)胞 胚直接再生植株或通過沿階草體細(xì)胞r射線和EMS復(fù)合誘變后再緊接著進(jìn)行體細(xì)胞定向篩 選，之后再通過體細(xì)胞胚直接再生植株，以其構(gòu)建具有豐富變異材料的飽和高抗同質(zhì)突變 體庫的方法報道。因此本發(fā)明突破了以往：1)只以物理或化學(xué)等一種誘變方法創(chuàng)建突變體 庫；2)以器官發(fā)生再生植株而導(dǎo)致突變體嵌合現(xiàn)象非常嚴(yán)重；對嵌合突變體進(jìn)行篩選，不 僅延長篩選時間有時甚至是無意義的篩選，很難通過定向篩選快速獲得同質(zhì)突變體；3)由 于突變體嵌合現(xiàn)象很嚴(yán)重，導(dǎo)致后代性狀不穩(wěn)定、重復(fù)性差、突變體篩選鑒定時間延長，同 質(zhì)突變體頻率很低。所以以往方法很難快速獲得遺傳穩(wěn)定的變異豐富的及定向突變的同質(zhì) 突變體，也就難以高效快速地構(gòu)建起遺傳穩(wěn)定的飽和定向同質(zhì)突變體庫。此項(xiàng)發(fā)明不但有 利于沿階草功能基因組學(xué)、分子生物學(xué)機(jī)理、遺傳育種與藥理機(jī)制等方面的研究，還是沿階 草抗逆遺傳學(xué)、抗逆基因克隆非常重要的材料，具有重要的理論意義與使用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種沿階草 體細(xì)胞r射線和EMS復(fù)合誘變后直接通過體細(xì)胞胚再生植株，及體細(xì)胞經(jīng)r射線和EMS復(fù) 合誘變后再通過體細(xì)胞耐冷性定向篩選，之后通過體細(xì)胞胚再生植株的一種復(fù)合技術(shù)的優(yōu) 化組合，通過其高效快速構(gòu)建沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的一種優(yōu)化方法。
[0012] 技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種高效快速構(gòu)建沿階草飽和 高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化方法，該方法包括如下步驟：
[0013] 1)高頻體細(xì)胞胚外植體材料準(zhǔn)備：選取室外健康無病蟲害的沿階草植株，取其幼 嫩莖葉，無菌消毒后在無菌培養(yǎng)基中組培成無菌試管苗，取其莖葉基部〇. 5-1. Ocm大小外 植體，通過高頻體胚再生系統(tǒng)的培養(yǎng)，就會持續(xù)不斷地產(chǎn)生體細(xì)胞胚和胚狀體及完整地再 生植株，以再生植株作為高頻體細(xì)胞胚外植體材料來源；
[0014] 2)早期體細(xì)胞胚外植體的培養(yǎng)：切取上述具高頻體細(xì)胞胚再生能力的外植體的 葉、莖基部0. 5cm大小組織塊，放在體胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-10d，此時大部分體細(xì)胞 為單細(xì)胞時期，稱作早期體細(xì)胞胚，以此作為誘變劑處理材料；
[0015] 3) γ射線和EMS理化誘變劑準(zhǔn)備：包括6°C〇- γ射線源準(zhǔn)備及輻射劑量的設(shè)置和 不同濃度甲基磺酸乙酯（EMS)溶液準(zhǔn)備；6°C〇-y射線源：由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研 究所提供；EMS溶液準(zhǔn)備：配制0.0 lmol/L、pH5. 8的磷酸緩沖液并將誘導(dǎo)劑甲基磺酸乙酯 (EMS)溶于該磷酸緩沖液中，制得EMS溶液。其中所述0.0 lmol/L、pH5. 8的磷酸緩沖液和 EMS溶液的配制方法是：將lmol/L的Na2HP04溶液定為A液，將lmol/L的NaH2P04溶液定 為B液，分別取A液9. 21mL和B液0. 79mL，加入到量筒中，定容至1L，高壓滅菌后冷卻至室 溫。在無菌條件下用一次性注射器吸取EMS經(jīng)0. 22um的微孔過濾器注射到磷酸緩沖液中， 制成從0.0、0.3%、0.6%3個不同濃度的EMS溶液；
[0016] 4)早期體細(xì)胞胚外植體的γ射線和HMS復(fù)合處理：將早期體細(xì)胞胚外植體先分 成6個大組用于6個不同劑量γ射線處理，每個大組待γ射線處理結(jié)束后，再分成3份用 于3個不同濃度EMS誘變劑的處理；其中6°C〇-y射線處理：將已準(zhǔn)備好的用于6°C〇-y射 線處理的6個大組的外植體直接放在不同輻射劑量6°C〇- γ射線下照射，處理結(jié)束后，拿回 無菌室再進(jìn)行EMS溶液處理：在無菌環(huán)境下將經(jīng)γ射線處理的外植體再分成3份用于3個 不同濃度EMS誘變劑的處理。每份外植體浸泡于上述各濃度的EMS溶液中處理1. 5小時， 處理期間將含外植體的容器置于搖床上以60 ± 5rpm的轉(zhuǎn)速輕搖，EMS溶液處理畢，倒掉EMS 溶液，用無菌水浸沒外植體，輕搖沖洗5-6次直至去除外植體中殘留的EMS，處理結(jié)束后