新鐵炮百合遠(yuǎn)緣雜交早期不同發(fā)育階段胚拯救方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種新鐵炮百合遠(yuǎn)緣雜交早期不同發(fā) 育階段胚拯救方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 百合雜交育種技術(shù)包括種系內(nèi)雜交和種系間雜交，種系間雜交即遠(yuǎn)緣雜交，不 僅存在受精前障礙，如花粉管在花柱內(nèi)不能正常萌發(fā)，還存在很嚴(yán)重的受精后障礙，難 以獲得雜種苗。受精后障礙主要由于胚或胚乳和母體生理機(jī)能的不協(xié)調(diào)，受精后胚不 能正常生長發(fā)育所致，通常在發(fā)育40d左右開始敗育，導(dǎo)致雜交失敗。幼胚的胚拯救技 術(shù)是克服受精后障礙的主要方法，而胚拯救開始的時(shí)間和相應(yīng)的拯救措施與方式是影響 百合胚拯救的關(guān)鍵技術(shù)。（Van Tuyl, J.M·，Van Die 魚Ii,. M.P·，Van Creij, M.G.M·，Van Kleinwee, T. C. M., Franken, J. , Bino, R. J. . Application of in vitro pollination, ovary culture, ovule culture, and embryo rescue for overcoming incongruity barriers in interspecific Lilium crosses[J]· Plant Sci.l991，74 :115-126.)雖然胚極救技術(shù)如子 房切片培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、胚培養(yǎng)等可克服受精后幼胚發(fā)育障礙，但不同的遠(yuǎn)緣雜交組合，不 同胚齡的幼胚所需的技術(shù)手段和培養(yǎng)基配方不同。矮牽牛早期胚拯救研究中顯示，Nitsch 培養(yǎng)基中較低濃度的氮鹽（500mg/LKN0jP80mg/LNH4N03)比其它高濃度氮鹽的培養(yǎng)基更有 利于促進(jìn)授粉后3d幼胚的發(fā)育，并且硝態(tài)氮（NO3)和銨態(tài)氮（NH4+)的質(zhì)量比為11 :1時(shí)適 合胚的發(fā)育（Nitsch，J. P. &Nitsch，C. Auxin-dependent growth of exeised Helianthus tuberosus tissue I[J]. Amer. J. Bot. . 1956, 43:831.)〇
[0003] 國內(nèi)在百合胚拯救方面，主要是針對(duì)種系內(nèi)雜交，種間雜交的胚拯救研究較少， 進(jìn)行胚拯救的時(shí)間又較晚，一般在授粉后40-60天后才對(duì)子房進(jìn)行剝胚離體培養(yǎng)（雷家 軍，阮冰潔.大花卷丹與亞洲百合、東方百合種間雜交及胚培養(yǎng)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué) 報(bào)· 2011，42 (4) :66-67.)。
[0004] 在百合胚拯救技術(shù)方面，國外文獻(xiàn)有報(bào)道顯示，BA抑制胚發(fā)生，為使胚培養(yǎng) 得到長度Imm以上的胚，子房培養(yǎng)以不添加生長調(diào)節(jié)劑為宜（李思義譯.百合子房 培養(yǎng)胚培養(yǎng)及雜種鑒定[J].譯自農(nóng)業(yè)技術(shù)，1990,45(8) :361-366. )。Yumi Obata等 (Yumi Obata，Yoshiji Niimi, Masaru Nakano，Keiichi Okazaki, Ichiro Miyajima. Interspecific hybrids between Lilium nobilissimum and L. regale produced via ovuIes-with-placental-tissue culture[J] · Scientia Horticulturae. 2000,84 ： 191-204.)用仏基本培養(yǎng)基附加質(zhì)量百分含量5%的蔗糖，對(duì)種間遠(yuǎn)緣雜交組合Lilium nobilissimum和Lilium regale授粉后30d和40d的子房進(jìn)行子房切段培養(yǎng)，授粉后30d 的子房切段有3%的胚珠成苗，授粉后40d的子房切段有9%的胚珠成苗。
[0005] 淺野義人（淺野義人.百合種間遠(yuǎn)緣雜交之研究[J].園藝學(xué)會(huì)雜志.1977， 46(2) :267-273.)認(rèn)為在MS培養(yǎng)基中加入1.0 X KT4~L 0X10 _2mg/LNAA對(duì)幼胚直接發(fā) 芽有效，而高濃度的生長調(diào)節(jié)劑則有抑制有胚發(fā)育的作用，并且可誘導(dǎo)幼胚產(chǎn)生愈傷組織。 不同發(fā)育時(shí)期的幼胚對(duì)酸堿度的要求不同，隨著幼胚體積的變大，pH值由高逐漸變低，即由 中性變?yōu)槠嵝裕话闱闆r下，pH值5. 0-6. O適于大多數(shù)胚的生長（周傳恩，夏光敏.小麥 遠(yuǎn)緣雜交胚拯救技術(shù)[J].麥類作物學(xué)報(bào).2005, 25(3) :88~92)。
[0006] 新鐵炮百合是1928年日本育種學(xué)家Mr. Nishimura用麝香百合和臺(tái)灣百合反復(fù)雜 交而來的新品種，具有播種繁殖一年開花的特性（Okazaki K. Lilium species native to Japan, and breeding and production of Lilium in Japan[C]. International Symposium on the Genus Lilium 414. 1994,81-92.)。這一特性在百合中罕見，能解決種球繁殖中種 球退化和病毒感染的問題；而且新鐵炮百合耐熱性強(qiáng)，花期在7月至10月，正是百合鮮切花 供應(yīng)困難的時(shí)候。但新鐵炮百合花色和花型單一，分別為白色和喇叭型，為培育生育期短、 花色和花型豐富的百合新品種，需要將其和其他百合雜種系的品種進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，但這一 遠(yuǎn)緣雜交存在嚴(yán)重的受精后障礙，在授粉后40d胚敗育之前采取有效的早期胚拯救措施可 大幅度提尚雜交的成功率。目如國內(nèi)外還未有相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了建立一套完整的新鐵炮百合遠(yuǎn)緣雜交受精后障礙的早期胚拯救技術(shù)，本發(fā)明 的目的在于提供一種新鐵炮百合遠(yuǎn)緣雜交早期不同發(fā)育階段胚拯救方法，具體步驟如下：
[0008] 1)新鐵炮百合遠(yuǎn)緣雜交后，取子房進(jìn)行滅菌消毒；
[0009] 2)按授粉后5d-25d、授粉后35d-40d兩個(gè)不同發(fā)育階段進(jìn)行胚拯救得到雜交組培 苗：
[0010] A授粉后5d-25d發(fā)育階段胚拯救
[0011] 子房切片培養(yǎng)得到胚珠后，胚珠組織培養(yǎng)，得到雜交組培苗；
[0012] B授粉后35d-40d發(fā)育階段胚拯救
[0013] 胚珠離體培養(yǎng)或胚離體培養(yǎng)，得到雜交組培苗。
[0014] 其中，步驟1)所述新鐵炮百合遠(yuǎn)緣雜交，為以新鐵炮百合為母本，與東方百合進(jìn) 行遠(yuǎn)緣雜交。
[0015] 所述東方百合優(yōu)選為百合品種'索邦'。
[0016] 其中，步驟1)所述滅菌消毒的具體方法為：將摘取的子房用體積百分含量75%的 酒精擦拭表面消毒，再以有效氯1 %的次氯酸鈉浸泡后無菌水沖洗。
[0017] 其中，A所述子房切片培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為：以仏或1/285培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基， 含有蔗糖的質(zhì)量百分含量為6%、瓊脂的質(zhì)量百分含量為0. 8%、pH值為5. 8的培養(yǎng)基。
[0018] 其中，A所述胚珠組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為：以仏或1/2B 5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基， 含有蔗糖的質(zhì)量百分含量為6-9%、瓊脂的質(zhì)量百分含量為0. 8%、pH值為5. 8的培養(yǎng)基。
[0019] 其中，A所述授粉后5d-25d發(fā)育階段胚拯救，最優(yōu)選為以授粉后IOd的子房進(jìn)行 子房切片培養(yǎng)，得到胚珠后進(jìn)行胚珠組織培養(yǎng)，子房切片培養(yǎng)和胚珠培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基均 為：以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有蔗糖的質(zhì)量百分含量為6%、瓊脂的質(zhì)量百分含量為 0. 8 %、pH值為5. 8的培養(yǎng)基。
[0020] 其中，B所述胚珠離體培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有 NAA(萘乙酸）的濃度為0. 01mg/L、蔗糖的質(zhì)量百分含量為3%、瓊脂的質(zhì)量百分含量為 0. 8 %、pH值為5. 8的培養(yǎng)基。
[0021] 其中，B所述胚離體培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有NAA的 濃度為〇. 〇〇lmg/L、6-BA(6-芐氨基嘌呤）的濃度為0. lmg/L、蔗糖的質(zhì)量百分含量為3%、 瓊脂的質(zhì)量百分含量為〇. 8%、pH值為5. 8的培養(yǎng)基。
[0022] 其中，所述培養(yǎng)的條件為溫度25 土 1°C，暗培養(yǎng)。
[0023] 其中，所述新鐵炮百合，優(yōu)選為新鐵炮百合品種'Augusta'或'雷山3號(hào)'。
[0024] 本發(fā)明還提供所述的新鐵炮百合遠(yuǎn)緣雜交早期不同發(fā)育階段胚拯救方法在百合 育種中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0026] 本發(fā)明的新鐵炮百合遠(yuǎn)緣雜交早期不同發(fā)育階段胚拯救方法，可克服新鐵炮百合 與東方百合雜種系間遠(yuǎn)緣雜交受精后不親和的障礙，獲得有胚胚珠和雜種苗，為培育花色 和花型多樣、且同時(shí)具有一年開花等優(yōu)良特性的百合新品種提供可能。
【附圖說明】
[0027] 圖1是實(shí)施例1中授粉早期5-25d子房切片培養(yǎng)的組培照片；
[0028] 圖2是實(shí)施例2中授粉早期5-25d子房切片培養(yǎng)后胚珠離體培養(yǎng)的組培照片；
[0029] 圖3是實(shí)施例3中授粉后35d-40d胚珠直接離體培養(yǎng)的組培照片；
[0030] 圖4是實(shí)施例4中授粉后35d-40d胚直接離體培養(yǎng)的組培照片。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0032] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0033] 實(shí)施例1授粉早期5d-25d不同時(shí)期子房切片培養(yǎng)條件篩選
[0034] 1.材料與方法
[0035] (1)分別摘取新鐵炮百合'Augusta'為母本，東方百合'索邦'為父本，授粉后5d、 10d、15d、20d、25d的子房；（2)將摘取的子房用綿球蘸取體積百分含量75%的酒精擦拭表 面消毒，有效氯1 %的次氯酸鈉浸泡20min，邊浸泡邊搖動(dòng)容器，使其充分接觸；再用無菌水 沖洗3次，每次2min ; (3)用鋒利的手術(shù)刀將子房切成2-3mm的薄片水平放置在培養(yǎng)基上； (4)篩選的培養(yǎng)基配方為基本培養(yǎng)基85、1/285、15、1/21^(?!1 = 5.8，瓊脂質(zhì)量百分濃度 〇. 8% )分別附加3%、6%、9%或12%不同質(zhì)量百分濃度的蔗糖，形成共12種處理組合， 每處理重復(fù)3次；（5)培養(yǎng)條件為溫度25 ± I °C，暗培養(yǎng)，40d后統(tǒng)計(jì)子房段上胚珠的發(fā)育情 況。
[0036] 2.結(jié)果與分析
[0037] 授粉早期5d-25d不同發(fā)育時(shí)期子房切片培養(yǎng)條件的篩選結(jié)果如表1所示：
[0038] 表1基本培養(yǎng)基和蔗糖濃度對(duì)不同發(fā)育時(shí)期子房切片培養(yǎng)的影響
[0039] CN 105123528 A 說明書 4/8 頁
[0040] 結(jié)果表明，采用以上方法對(duì)新鐵炮百合'Augusta'為母本，東方百合'索邦'為父本 的授粉早期5-25d不同時(shí)期的子房進(jìn)行切片培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)授粉后5d-25d的子房切片培養(yǎng)，以 B5S 1/2B 5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，含有蔗糖的質(zhì)量百分含量為6 %、瓊脂的質(zhì)量百分含量為 0. 8%、pH值為5. 8的培養(yǎng)基均能較好地培養(yǎng)得到胚珠。其中，授粉后5(1、10(1、15(1、20(1子 房切片培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為4培養(yǎng)基、6%蔗糖、pH = 5. 8、瓊脂0. 8%，含成活胚珠的 子房片數(shù)分別為50%、75%、66. 7%、43. 3%。授粉后25d子房切片培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方 為1/285培養(yǎng)基、6%蔗糖、pH = 5. 8、瓊脂0. 8%，含成活胚珠的子房片數(shù)為34. 3%。授粉后 的IOd是百合子房切片培養(yǎng)的最佳時(shí)期，含成活胚珠的子房片數(shù)最高，最高百分比達(dá)75%。 圖