鯉魚與團(tuán)頭魴亞科間遠(yuǎn)緣雜交的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及魚類雜交方法，尤其涉及鯉科魚類中亞科間的遠(yuǎn)緣雜交方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 含量測(cè)定親緣關(guān)系在種間或種間以上的雜交稱為遠(yuǎn)緣雜交，是魚類性狀改良常用 的方法。遠(yuǎn)緣雜交作為一種重要的魚類遺傳育種和性狀改良方法，它可以整合整套外源基 因，從而改變雜交后代基因的表達(dá)調(diào)控，使得雜交后代可能在生長(zhǎng)速度、抗逆性、抗病性以 及肉質(zhì)等方面表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì)。遠(yuǎn)緣雜交根據(jù)不同的親本組合，可以形成在表型和遺傳型 上都不同的不同類型的魚。如紅鯽與湘江野鯉的屬間遠(yuǎn)緣雜交形成的雜交后代中F1-F2S 二倍體雜交魚（2n= 100)，F(xiàn)3-F24S異源四倍體魚（4n= 200);利用異源四倍體魚與有關(guān) 二倍體魚交配，大規(guī)模形成了具有生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)鮮嫩、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的三倍體魚（3n =150)。紅鯽與團(tuán)頭魴的亞科間遠(yuǎn)緣雜交的F1中形成了二倍體天然雌核發(fā)育紅鯽（2n= 100)、異源四倍體鯽魴（4n= 148)和異源三倍體鯽魴（3n= 124);其中異源四倍體鯽魴通 過(guò)自交形成了同源四倍體魚品系（4n= 200)。
[0003] 鯉魚（Cyprinuscarpiocarpio)屬于鯉科、鯉亞科中的二倍體魚（2n= 100)，團(tuán) 頭魴（Megalobramaamblycephala)屬于鯉科、舶亞科中的二倍體魚（2n= 48);在遺傳、分 類和體形等生物學(xué)特征方面，鯉魚和團(tuán)頭魴之間存在較大的差異，尤其是他們之間體細(xì)胞 染色體數(shù)目差異很大，鯉魚的染色體數(shù)目為100,而團(tuán)頭魴的染色體數(shù)目為48,而且不成倍 性關(guān)系。至今國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有鯉魚與團(tuán)頭魴亞科間遠(yuǎn)緣雜交成功的報(bào)道，探索一種使鯉魚與 團(tuán)頭魴之間的雜交方法并對(duì)其后代的生物學(xué)特性進(jìn)行研宄分析具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服以上【背景技術(shù)】中提到的不足和缺陷，提供一 種受精率尚、!桴化率尚、后代性狀優(yōu)良、對(duì)遺傳育種具有重要意義的趣魚與團(tuán)頭妨亞科間遠(yuǎn) 緣雜交的方法。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種鯉魚與團(tuán)頭魴亞科間遠(yuǎn)緣雜 交的方法，包括以下步驟：首先挑選性成熟特征明顯、體征良好的雌性鯉魚和雄性團(tuán)頭魴作 為親魚專池培育，然后在繁殖季節(jié)對(duì)所述親魚進(jìn)行人工催產(chǎn)，挑選催產(chǎn)效果良好的親魚進(jìn) 行人工干法授精，授精完成后的胚胎于凈水孵化裝置中進(jìn)行流水孵化，待魚苗孵化完成后 進(jìn)行飼養(yǎng)，再對(duì)飼養(yǎng)后的魚苗進(jìn)行檢測(cè)、篩分，通過(guò)流式細(xì)胞DNA含量測(cè)定、腎組織染色體 倍性檢測(cè)獲得鯉魚與團(tuán)頭魴雜交后代，雜交后代包括二倍體天然雌核發(fā)育鯉魚、二倍體天 然雌核發(fā)育鏡鯉、類鯽魚的二倍體魚和四倍體雜交魚。采用前述技術(shù)方案獲得的四種類型 的雜交魚均具有體形優(yōu)美、生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在新型優(yōu)良魚類品系培育和遺傳 育種方面具有重要價(jià)值。
[0006] 上述的鯉魚與團(tuán)頭魴亞科間遠(yuǎn)緣雜交的方法，優(yōu)選的，所述方法具體包括以下步 驟：
[0007] (a)親魚的選擇和培育：在繁殖期前3?4個(gè)月，挑選性成熟特征明顯、體征良好 的雌性鯉魚和雄性團(tuán)頭魴分別作為遠(yuǎn)緣雜交的母本親魚和父本親魚進(jìn)行專池培育，保持水 質(zhì)良好；在繁殖期前一個(gè)月左右以精餌飼養(yǎng)，每隔2?3天流水刺激一次，促進(jìn)親魚性腺發(fā) 育成熟；體征良好的親魚一般表現(xiàn)為體型好、體色鮮艷、體質(zhì)健壯、無(wú)病無(wú)傷；
[0008] (b)人工催產(chǎn)：在當(dāng)年的5月中旬至6月上旬，當(dāng)水溫穩(wěn)定在20°C以上時(shí)，為所述 親魚注射黃體素釋放激素類似物（LRH-A)與絨毛膜促性腺激素（HCG)的混合催產(chǎn)劑進(jìn)行催 產(chǎn)，所述黃體素釋放激素類似物的用量為6?10yg/kg(最優(yōu)選10yg/kg)，絨毛膜促性腺 激素的用量為500?800IU/kg(最優(yōu)選600IU/kg);先注射母本親魚，4?5h后再注射父本 親魚，父本親魚的注射劑量減半；注射完畢后按1 : 6?8的數(shù)量比將母本親魚、父本親魚 放入同一產(chǎn)卵池中，然后視水情及時(shí)向池中沖水，尤其在產(chǎn)卵前3?4h，注入一定水量后， 停止注水，讓魚在靜水中催產(chǎn)，直至其開(kāi)始順利產(chǎn)卵和產(chǎn)精；注射時(shí)優(yōu)選采用胸鰭基部無(wú)鱗 處腹腔一針注射法，以提高親魚的存活率；
[0009] (C)授精孵化：挑選產(chǎn)卵順利的母本親魚，用帆布擔(dān)架固定，以便于操作和減少 對(duì)母本親魚的損傷；然后與產(chǎn)精量大的父本親魚進(jìn)行人工干法授精，受精卵置于水溫為 20°C?21°C的凈水孵化裝置中進(jìn)行流水孵化；
[0010] (d)飼養(yǎng)：魚苗全部孵出后，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育2?3天，待魚苗出現(xiàn)腰點(diǎn)后將 魚苗轉(zhuǎn)入預(yù)先培肥的池塘中飼養(yǎng)，1?2天后潑灑豆?jié){，2?3次/天，力求細(xì)、勻；魚苗長(zhǎng)成 后通過(guò)流式細(xì)胞DNA含量測(cè)定、腎組織染色體倍性檢測(cè)獲得雜交后代。四種類型雜交后代 的染色體圖分別如圖4、圖6、圖8和圖10所示。
[0011] 本發(fā)明中流式細(xì)胞DNA含量測(cè)定法步驟為：用經(jīng)肝素潤(rùn)濕的一次性注射器從魚尾 靜脈血管采血約0. 2mL，注入裝有0. 8%生理鹽水的Eppendorf管中，在血液和生理鹽水混 合液中加入ImL細(xì)胞核提取液DAPI-A(nucleiextractionsolution，德國(guó)PartecGmbh提 供），處理時(shí)間10?15min;樣品經(jīng)過(guò)20ym尼龍濾器（德國(guó)PartecGmbH提供）過(guò)濾；DNA 染色液（DAPI-B，德國(guó)PartecGmbH提供）靜置于暗處染色樣品約5?lOmin，然后上機(jī)檢 測(cè)。通過(guò)流式細(xì)胞DNA含量測(cè)定可以明確的知道鯉魚與團(tuán)頭魴雜交后代中二倍體天然雌核 發(fā)育鯉魚、二倍體天然雌核發(fā)育鏡鯉、類鯽魚的二倍體魚和四倍體雜交魚這四種類型雜交 后代的DNA平均含量以及與參照物普通紅鯽的DNA平均含量的比值。
[0012] 本發(fā)明中腎組織染色體倍性的檢測(cè)方法包括：在18°C?22°C水溫下培育實(shí)驗(yàn)魚 1?3天后，對(duì)實(shí)驗(yàn)魚注射PHA1?3次，每次劑量為2?8yg/g體重，間隔時(shí)間為12? 24小時(shí)，在解剖取材前2?6小時(shí)，注射秋水仙素，劑量為2?4yg/g體重。取出腎組織， 在生理鹽水下剪碎腎組織，0. 〇75mol/LKCL低滲處理，在20°C溫度下低滲40?60分鐘；用 冰醋酸：甲醇（1 : 3)固定腎組織1?3次；在冰凍載玻片上滴片；Giemsa染液染色45? 60分鐘，細(xì)水流沖洗載玻片背面去除染液，風(fēng)干后鏡檢、拍照。通過(guò)腎組織染色體倍性檢測(cè) 也可以明確知道鯉魚與團(tuán)頭魴雜交后代中二倍體天然雌核發(fā)育鯉魚、二倍體天然雌核發(fā)育 鏡鯉、類鯽魚的二倍體魚和四倍體雜交魚這四種類型的染色體數(shù)目及其倍性。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明中，鯉魚與團(tuán)頭魴的亞科間遠(yuǎn)緣雜交 形成的F1中形成了二倍體天然雌核發(fā)育鯉魚（2n= 100)、二倍體天然雌核發(fā)育鏡鯉（2n= 100)及類鯽魚的二倍體魚（2n= 100)和四倍體雜交魚（4n= 148)，這些雜交后代具有體 形優(yōu)美、生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)呈現(xiàn)生物多樣性的顯著特點(diǎn)，在新型優(yōu)良魚類 品系培育和遺傳育種方面具有重要價(jià)值。本發(fā)明中的雜交后代顯然與現(xiàn)有遠(yuǎn)緣雜交組合的 親本和雜交產(chǎn)生后代存在著顯著差別，本發(fā)明的方法具有受精率高、孵化率高、后代性狀優(yōu) 良等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明遠(yuǎn)緣雜交組合獲得的二倍體天然雌核發(fā)育鯉魚、二倍體天然雌核發(fā)育鏡 鯉、類鯽魚的二倍體魚和四倍體雜交魚有望在雜交后代中通過(guò)遺傳選育培育出二倍體天然 雌核發(fā)育鯉魚品系、二倍體天然雌核發(fā)育鏡鯉品系、類鯽魚的二倍體魚品系和四倍體雜交 魚品系，其中通過(guò)對(duì)四倍體雜交魚品系繼續(xù)選育，有望研制出新型同源四倍體魚品系。本發(fā) 明在生物進(jìn)化和魚類遺傳育種方面具有重要的生物學(xué)意義。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明 的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù) 這些附圖獲得其他的附圖。
[0015] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中鯉魚（早）X團(tuán)頭魴（S)親本中鯉魚（早）的外形照片。
[0016] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中鯉魚（早）X團(tuán)頭魴（$ )親本中團(tuán)頭魴（$ )的外形照 片。
[0017] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例中鯉魚（早）X團(tuán)頭魴（$ )后代中二倍體天然雌核發(fā)育鯉 魚的外形照片。
[0018] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例中鯉魚（早）X團(tuán)頭魴（S)后代中二倍體天然雌核發(fā)育鯉 魚的染色體圖（2n= 100)。
[0019] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例中鯉魚（早）X團(tuán)頭魴（S)后代中二倍體天然雌核發(fā)育鏡 鯉的外形照片。
[0020] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例中鯉魚（早）X團(tuán)頭魴（$ )后代中二倍體天然雌核發(fā)育鏡 鯉的染色體圖（2n= 100)。
[0021] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例中鯉魚（早）X團(tuán)頭魴（$ )后代中類鯽魚的二倍體魚的外 形照片。
[0022] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例中鯉魚（早）X團(tuán)頭魴（& )后代中類鯽魚的二倍體魚的染 色體圖（2n= 100)。
[0023] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例中鯉魚（早）X團(tuán)頭魴U)后代中四倍體雜交魚的外形照 片。
[0024] 圖10為本發(fā)明實(shí)施例中鯉魚（早）X團(tuán)頭魴（& )后代中四倍體雜交魚的染色 體圖（4n= 148)。