供；輻射劑量設(shè)置為0. 0、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、 25Gy 6個不同處理；EMS溶液準備：配制0· 01mol/L、ρΗ5· 8的磷酸緩沖液：將lmol/L的 Na2HP04溶液定為A液，將lmol/L的NaH2P04溶液定為B液，分別取A液9. 21mL和B液 0. 79mL，加入到量筒中，定容至1L，高壓滅菌后冷卻至室溫；[0044]不同濃度EMS溶液配制： EMS濃度以重量百分比計，配制成0. 0、0. 3%、0. 6% 3個不同濃度，要求在無菌條件下用一 次性注射器吸取相應(yīng)濃度的EMS經(jīng)0. 22um的微孔過濾器注射到上述磷酸緩沖液中；
[0045] 3)早期體細胞胚外植體的γ射線處理和EMS處理：γ射線處理：將在體胚發(fā)生 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的早期體細胞胚外植體分成6個大組用于不同6°C〇-y射線的處理，6組 外植體直接放在6個不同輻射劑量γ射線下照射，處理結(jié)束后，拿回?zé)o菌室每組再分成3 份用于3個不同EMS溶液處理；EMS處理：將經(jīng)6°C〇- γ射線處理的外植體每個處理分成3 份用于3個不同EMS溶液處理：在無菌環(huán)境下取出已準備好的外植體浸泡于上述各濃度的 EMS溶液中處理1. 5小時，處理期間將含外植體的容器置于搖床上以60 ± 5rpm的轉(zhuǎn)速輕搖， EMS溶液處理畢，倒掉EMS溶液，用無菌水浸沒外植體，輕搖沖洗5-6次直至去除外植體中殘 留的EMS，處理結(jié)束后，重新接種于體胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行下一步培養(yǎng)；
[0046] 4)細胞突變體篩選處理：是將上述經(jīng)γ射線和EMS復(fù)合誘變處理過的早期體細 胞胚外植體分成2大類分別編號，取其中1大類進行低溫篩選處理，即放入5-8°C低溫?zé)o菌 培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7-10d。通過低溫逆境篩選，可以保證高效定向篩選到抗逆（冷）性較強的 突變體細胞。
[0047] 5)體細胞胚分化培養(yǎng)：將上述2大類早期體細胞胚外植體即經(jīng)低溫篩選處理和未 經(jīng)低溫篩選處理的均轉(zhuǎn)移到溫度為25-28°C無菌室暗培養(yǎng)50-60d，中間繼代一次，有利于 體細胞胚分化，可見外植體上大大小小生長發(fā)育出幾十個早期同質(zhì)突變胚狀體。常溫暗培 養(yǎng)可保證快速獲得同質(zhì)飽和突變體庫。
[0048] 6)突變胚狀體快繁増殖培養(yǎng)：將上述早期同質(zhì)突變胚狀體切成0. 5cm大小塊，分 別編號轉(zhuǎn)接于體細胞胚快繁增殖培養(yǎng)基（MS+BA 2mg/L+NAA 0. 2mg/L+蔗糖40g/L+3. 5g/L phytagel)，放在25-28°C光下培養(yǎng)50-60d，中間繼代一次，可獲得大量成熟的同質(zhì)突變胚 狀體（圖3 :魚雷胚、子葉胚和同質(zhì)突變體（左：細葉沿階草）。
[0049] 7)同質(zhì)突變胚狀體的耐冷性篩選及快繁増殖培養(yǎng)：是取上述經(jīng)低溫篩選并經(jīng)快 繁増殖的那1類成熟同質(zhì)突變胚狀體，切成〇. 5cm大小塊，分別編號繼續(xù)轉(zhuǎn)接于體細胞胚 快繁增殖培養(yǎng)基（MS+BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L+鹿糖 40g/L+3.5g/L phytagel)，放入 5-8°C 低溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中弱光下（500-8001x)培養(yǎng)25-30d，之后再繼代轉(zhuǎn)入25-28°C光下培養(yǎng) 25-30d，可獲得抗冷性較強的成熟同質(zhì)突變胚狀體。
[0050] 8)成熟同質(zhì)突變胚狀體再生植株：將上述快繁増殖的具豐富變異的成熟突變胚 狀體及抗逆（冷）性強的成熟突變胚狀體均分別編號轉(zhuǎn)接于植株再生培養(yǎng)基中（1/2MS+白 糖20g/L+0. 7%瓊脂），在無菌室溫度25-28°C光下培養(yǎng)20-25d，獲得具根、莖、葉完整的同 質(zhì)突變體再生植株（圖5 :高抗同質(zhì)突變體（左：細葉沿階草）。
[0051] 9)突變體再生植株煉苗移栽：當(dāng)根生長到1-1. 5cm時，將各突變體株系分別編 號移栽到花盆，選擇輕型基質(zhì)，放置在溫室大棚內(nèi)，自動間歇噴霧裝置澆水。成活率可達 100%。揭去培養(yǎng)瓶的封口膜，在室內(nèi)煉苗1~2d，用鑷子小心取出小苗，洗凈根上附著的 培養(yǎng)基，移栽到裝有輕型基質(zhì)（泥炭：蛭石=1:1)的花盆中，放入溫室溫度為24°C~26°C， 適當(dāng)遮蔭，或?qū)⑿∶绶诺矫绱蚕?，自動間歇噴霧裝置澆水。成活率可達100% (圖6:盆栽 矮生沿階草同質(zhì)突變體庫）。
[0052] 10)田間突變體庫建立：60d后選擇溫暖濕潤陰天將各個突變體株系分別編號，移 栽到室外林下或田間區(qū)試圃。由于小苗生長旺盛，對移栽大田的條件要求也不高，極易種 植，小苗的成活率可達100%。后期根據(jù)生育期記載突變體相關(guān)性狀，在同質(zhì)突變體生長發(fā) 育的各階段進行突變體鑒定、篩選、種質(zhì)遺傳多樣性鑒定等。（表1 :30份沿階草種質(zhì)樣品 編號及名稱；圖7 :AAG/C T C引物組合在30份沿階草種質(zhì)中擴增的AFLP指紋；表2 :9個 AFLP引物組合在30份沿階草種質(zhì)中檢測到的遺傳變異信息；圖8 :根據(jù)AFLP遺傳相似系數(shù) 計算的30份沿階草種質(zhì)的聚類圖）。以此高效快速建立起細葉沿階草理化誘變飽和高抗突 變體庫，用于后續(xù)沿階草遺傳育種、生理藥理機制分析和基因功能組學(xué)等方面的研究。
[0053] 表1 :30份沿階草種質(zhì)樣品編號及名稱
[0058] 實施例2以沿階草中的黑沿階草高效快速飽和高抗同質(zhì)突變體庫構(gòu)建的優(yōu)化方 法為例進行說明。步驟是：
[0059] 1)高頻體細胞胚外植體材料準備和早期體細胞胚外植體的培養(yǎng)：選取健康無病 蟲害的黑沿階草植株，剝?nèi)ダ先~，取其幼嫩莖基并帶3-4片幼葉，無菌消毒后放入無菌培養(yǎng) 基培養(yǎng)（1/2MS+2. Omg/L ΒΑ+0. 5mg/L NAA+蔗糖 20g/L+0. 7%瓊脂）50-60d，中間繼代一次， 組培成試管苗，取其試管苗葉、莖基部0. 5-1. Ocm大小外植體，放在體胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (MS+BA(0. 2mg/L)+NAA(0. 5mg/L)+2. 4D(0. 5mg/L) + 鹿糖 30g/L+3. 5g/L phytagel)上培養(yǎng) 50-56d，中間繼代一次，將產(chǎn)生的初生胚狀體轉(zhuǎn)入高頻體細胞胚培養(yǎng)基（MS+BA 2mg/L+NAA 0. 5mg/L+鹿糖40g/L+3. 5g/L phytagel)上光下培養(yǎng)50-60d，中間繼代一次，就會持續(xù)不斷 地大量產(chǎn)生各個發(fā)育時期的體細胞胚（球形胚、魚雷胚）和胚狀體，將胚狀體轉(zhuǎn)入無激素的 成苗培養(yǎng)基（MS+白糖30g/L+0. 7%瓊脂）培養(yǎng)，20-25天后形成完整再生植株，以其作為高 頻體細胞胚材料來源。切取其葉、莖基部〇. 5cm大小組織塊作為高頻體細胞胚外植體材料， 放在體胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-10d，在體胚發(fā)生的早期作為誘變劑處理材料。
[0060] 2) 6°C〇- γ射線誘變劑準備和EMS溶液準備：6°C〇- γ射線誘變劑準備：6°C〇- γ射 線源由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供；輻射劑量設(shè)置為0. 0、5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、 25Gy 6個不同處理；EMS溶液準備：配制0· 01mol/L、ρΗ5· 8的磷酸緩沖液：將lmol/L的 Na2HP04溶液定為A液，將lmol/L的NaH2P04溶液定為B液，分別取A液9. 21mL和B液 0. 79mL，加入到量筒中，定容至1L，高壓滅菌后冷卻至室溫；不同濃度EMS溶液配制：EMS濃 度以重量百分比計，配制成〇. 〇、〇. 3%、0. 6% 3個不同濃度，要求在無菌條件下用一次性 注射器吸取相應(yīng)濃度的EMS經(jīng)0. 22um的微孔過濾器注射到上述磷酸緩沖液中；
[0061] 3)早期體細胞胚外植體的γ射線處理和EMS處理：γ射線處理：將在體胚發(fā)生 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的早期體細胞胚外植體分成6個大組用于不同6°C〇-y射線的處理，6組 外植體直接放在6個不同輻射劑量γ射線下照射，處理結(jié)束后，拿回?zé)o菌室每組再分成3 份用于3個不同EMS溶液處理；EMS處理：將經(jīng)6°C〇- γ射線處理的外植體每個處理分成3 份用于3個不同EMS溶液處理：在無菌環(huán)境下取出已準備好的外植體浸泡于上述各濃度的 EMS溶液中處理1. 5小時，處理期間將含外植體的容器置于搖床上以60 ± 5rpm的轉(zhuǎn)速輕搖， EMS溶液處理畢，倒掉EMS溶液，用無菌水浸沒外植體，輕搖沖洗5-6次直至去除外植體中殘 留的EMS，處理結(jié)束后，重新接種于體胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行下一步培養(yǎng)；
[0062] 4)細胞突變體篩選處理：是將上述經(jīng)γ射線和EMS復(fù)合誘變處理過的早期體細 胞胚外植體分成2大類分別編號，取其中1大類進行低溫篩選處理，即放入5-8°C低溫?zé)o菌 培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7-10d。通過低溫逆境篩選，可以保證高效定向篩選到抗逆（冷）性較強的 突變體細胞。
[0063] 5)體細胞胚分化培養(yǎng)：將上述2大類早期體細胞胚外植體即經(jīng)低溫篩選處理和未 經(jīng)低溫篩選處理的均轉(zhuǎn)移到溫度為25-28°C無菌室暗培養(yǎng)50-60d，中間繼代一次，有利于 體細胞胚分化，可見外植體上大大小小生長發(fā)育出幾十個早期同質(zhì)突變胚狀體。常溫暗培 養(yǎng)可保證快速獲得同質(zhì)飽和突變體庫。
[0064] 6)突變胚狀體快繁増殖培養(yǎng)：將上述