早期同質(zhì)突變胚狀體切成0. 5cm大小塊，分 別編號轉(zhuǎn)接于體細(xì)胞胚快繁增殖培養(yǎng)基（MS+BA 2mg/L+NAA 0. 2mg/L+蔗糖40g/L+3. 5g/L phytagel)，放在25-28°C光下培養(yǎng)50-60d，中間繼代一次，可獲得大量成熟的同質(zhì)突變胚 狀體（圖3 :魚雷胚、子葉胚和同質(zhì)突變體（右：黑沿階草）。
[0065] 7)同質(zhì)突變胚狀體的耐冷性篩選及快繁増殖培養(yǎng)：是取上述經(jīng)低溫篩選并經(jīng)快 繁増殖的那1類成熟同質(zhì)突變胚狀體，切成〇. 5cm大小塊，分別編號繼續(xù)轉(zhuǎn)接于體細(xì)胞胚 快繁增殖培養(yǎng)基（MS+BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L+鹿糖 40g/L+3.5g/L phytagel)，放入 5-8°C 低溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中弱光下（500-8001x)培養(yǎng)25-30d，之后再繼代轉(zhuǎn)入25-28°C光下培養(yǎng) 25-30d，可獲得抗冷性較強(qiáng)的成熟同質(zhì)突變胚狀體（圖4 :高抗同質(zhì)突變體（右：黑沿階 草）。
[0066] 8)成熟同質(zhì)突變胚狀體再生植株：將上述快繁増殖的具豐富變異的成熟突變胚 狀體及抗逆（冷）性強(qiáng)的成熟突變胚狀體均分別編號轉(zhuǎn)接于植株再生培養(yǎng)基中（1/2MS+白 糖20g/L+0. 7%瓊脂），在無菌室溫度25-28°C光下培養(yǎng)20-25d，獲得具根、莖、葉完整的同 質(zhì)突變體再生植株。
[0067] 9)突變體再生植株煉苗移栽：當(dāng)根生長到1-1. 5cm時，將各突變體株系分別編 號移栽到花盆，選擇輕型基質(zhì)，放置在溫室大棚內(nèi)，自動間歇噴霧裝置澆水。成活率可達(dá) 100%。揭去培養(yǎng)瓶的封口膜，在室內(nèi)煉苗1~2d，用鑷子小心取出小苗，洗凈根上附著的 培養(yǎng)基，移栽到裝有輕型基質(zhì)（泥炭：蛭石=1:1)的花盆中，放入溫室溫度為24°C~26°C， 適當(dāng)遮蔭，或?qū)⑿∶绶诺矫绱蚕拢詣娱g歇噴霧裝置澆水。成活率可達(dá)100% (圖6:盆栽 矮生沿階草同質(zhì)突變體庫）。
[0068] 10)田間突變體庫建立：60d后選擇溫暖濕潤陰天將各個突變體株系分別編號，移 栽到室外林下或田間區(qū)試圃。由于小苗生長旺盛，對移栽大田的條件要求也不高，極易種 植，小苗的成活率可達(dá)100%。后期根據(jù)生育期記載突變體相關(guān)性狀，在同質(zhì)突變體生長發(fā) 育的各階段進(jìn)行突變體鑒定、篩選。以此高效快速建立起黑沿階草理化飽和高抗突變體庫， 用于后續(xù)沿階草遺傳育種、生理藥理機(jī)制分析和基因功能組學(xué)等方面的研究。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效快速構(gòu)建沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化方法，其特征在于，該方法 包括如下步驟： 1) 高頻體細(xì)胞胚外植體材料準(zhǔn)備：選取室外健康無病蟲害的沿階草植株，取其幼嫩莖 葉，無菌消毒后在無菌培養(yǎng)基中組培成無菌試管苗，取其莖葉基部0. 5-1. Ocm大小外植體， 通過高頻體胚再生系統(tǒng)的培養(yǎng)，就會持續(xù)不斷地產(chǎn)生體細(xì)胞胚和胚狀體及完整地再生植 株，以再生植株作為高頻體細(xì)胞胚外植體材料來源； 2) 早期體細(xì)胞胚外植體的培養(yǎng)：切取上述具高頻體細(xì)胞胚再生能力的外植體的葉、莖 基部0. 5cm大小組織塊，放在體胚發(fā)生誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-10d，此時大部分體細(xì)胞為單細(xì) 胞時期，稱作早期體細(xì)胞胚，以此作為誘變劑處理材料； 3. y射線和EMS理化誘變劑準(zhǔn)備：包括6°C〇- y射線源準(zhǔn)備及輻射劑量的設(shè)置和不同 濃度甲基磺酸乙酯（EMS)溶液準(zhǔn)備； 4) 早期體細(xì)胞胚外植體的Y射線和EMS復(fù)合處理：將早期體細(xì)胞胚外植體先分成6 個大組用于6個不同劑量y射線處理，每個大組待y射線處理結(jié)束后，再分成3份用于3 個不同濃度EMS誘變劑的處理； 5) 細(xì)胞突變體篩選處理：將上述經(jīng)y射線和EMS復(fù)合處理過的早期體細(xì)胞胚外植體 分成2大類分別編號，取其中1大類進(jìn)行低溫篩選處理，即放入5-8°C低溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中暗 培養(yǎng)7-10d ; 6) 體細(xì)胞胚分化培養(yǎng)：將2大類早期體細(xì)胞胚外植體即經(jīng)低溫篩選處理和未經(jīng)低溫 篩選處理的均轉(zhuǎn)移到溫度為25-28°C無菌室暗培養(yǎng)50-60d，中間繼代一次，有利于體細(xì)胞 胚分化，可見外植體上大大小小生長發(fā)育出幾十個早期同質(zhì)突變胚狀體； 7) 同質(zhì)突變胚狀體快繁増殖培養(yǎng)：將上述早期同質(zhì)突變胚狀體切成0. 5cm大小塊，分 別編號轉(zhuǎn)接于體細(xì)胞胚快繁增殖培養(yǎng)基，放在25-28°C光下培養(yǎng)50-60d，中間繼代一次，可 獲得大量成熟的同質(zhì)突變胚狀體； 8) 成熟同質(zhì)突變胚狀體的耐冷性篩選及快繁増殖培養(yǎng)：取上述經(jīng)低溫篩選并經(jīng)快繁 増殖的那1類成熟同質(zhì)突變胚狀體，切成〇. 5cm大小塊，分別編號接種于體細(xì)胞胚快繁增 殖培養(yǎng)基，放入5-8°C低溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中弱光下（500-8001x)培養(yǎng)25-30d后，再繼代轉(zhuǎn)入 25-28°C光下（1500-20001X)培養(yǎng)25-30d，可獲得抗冷性較強(qiáng)的成熟同質(zhì)突變胚狀體； 9) 成熟同質(zhì)突變胚狀體再生植株：將上述快繁増殖的具豐富變異的成熟突變胚狀體 及抗逆(冷）性強(qiáng)的成熟突變胚狀體均分別編號轉(zhuǎn)接于植株再生培養(yǎng)基中，在無菌室溫度 25-28°C光下培養(yǎng)20-25d，獲得具根、莖、葉完整的同質(zhì)突變體再生植株； 10) 同質(zhì)突變體再生植株煉苗移栽：當(dāng)根長生長到1-1. 5cm時，將各突變體株系分別 編號移栽到花盆，選擇輕型基質(zhì)，放置在溫室大棚內(nèi)，自動間歇噴霧裝置澆水； 11) 田間突變體庫建立：60d后選擇溫暖濕潤陰天將各個突變體株系移栽到室外林下 或田間區(qū)試圃，分別編號，記載相關(guān)性狀，在同質(zhì)突變體生長發(fā)育的過程中進(jìn)行突變體篩 選、種質(zhì)遺傳多樣性鑒定，以此高效快速構(gòu)建起沿階草理化誘變飽和高抗同質(zhì)突變體庫。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效快速構(gòu)建沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化 方法，其特征在于，輻射劑量和EMS溶液濃度：輻射劑量設(shè)置為0.0、5Gy IOGy 15Gy 20Gy 25Gy 6個不同處理；EMS溶液配制成0. 0、0. 3%和0. 6% 3個不同濃度。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效快速構(gòu)建沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化方 法，其特征在于，所述6°C〇- y射線輻射劑量為15Gy ;EMS濃度為0. 3%，EMS溶液浸泡處理時 間1. 5小時。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效快速構(gòu)建沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化方 法，其特征在于，所述無菌培養(yǎng)基培養(yǎng)為1/2MS + 2.0 mg/L BA+ 0.5 mg/L NAA +20g/L蔗 糖+0. 7%瓊脂。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效快速構(gòu)建沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化方 法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0. 2 mg/L BA+ 0.5 mg/L NAA+0. 5 mg /L 2,4-二氯 苯氧乙酸+30g/ L 鹿糖+3.5g/L phytagel。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效快速構(gòu)建沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化方 法，其特征在于，所述步驟1)高頻體胚再生系統(tǒng)的培養(yǎng)：是指將初生胚狀體轉(zhuǎn)入高頻體細(xì) 胞胚培養(yǎng)基上光下培養(yǎng)50-60d，光照強(qiáng)度為1500-20001x，光照時間為每天10-14小時，中 間繼代一次，就會持續(xù)不斷大量地產(chǎn)生次生胚狀體即體細(xì)胞胚。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效快速構(gòu)建沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化方 法，其特征在于，所述高頻體細(xì)胞胚培養(yǎng)基為MS +2mg/L BA + 0. 5mg/L NAA +40g/L蔗糖 +3.5g/Lphytagel〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效快速構(gòu)建沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化方 法，其特征在于，所述步驟7)中體細(xì)胞胚快繁增殖培養(yǎng)基為MS + 2mg/L BA + 0. 2mg/L NAA +40g/L鹿糖+3. 5g/L phytagel，光照強(qiáng)度為1500-20001x，光照時間為每天10-14小時。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效快速構(gòu)建沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化方 法，其特征在于，所述步驟9)中植株再生培養(yǎng)基為1/2 MS+20g/ L白糖+ 0.7%瓊脂。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效快速構(gòu)建沿階草飽和高抗同質(zhì)突變體庫的優(yōu)化方法。甲基磺酸乙酯和60Co-γ射線是應(yīng)用最廣泛，即高效又穩(wěn)定的理化誘變劑。其中EMS可在一個基因組上產(chǎn)生多個點(diǎn)突變，產(chǎn)生的突變可隨機(jī)分布于整個基因組，且分布均勻，密度高，成本低，有利于等位基因突變體的獲得，特別是較小的突變?nèi)后w便可獲得飽和的突變體庫；而r射線誘變主要是引起DNA片段的缺失和染色體重排，特別適用于多個家族基因功能缺失的突變體庫的創(chuàng)建；所以這兩種方法同時使用，通過優(yōu)勢互補(bǔ)，既可以增加突變體庫的容量，又能滿足飽和突變體庫的要求，更加豐富了飽和突變體庫的內(nèi)容，而且所獲得的突變體不涉及轉(zhuǎn)基因事件，所以安全性高、便于應(yīng)用。
【IPC分類】A01H1/06, A01H4/00
【公開號】CN105123530
【申請?zhí)枴緾N201510618725
【發(fā)明人】梁慧敏, 周興元, 劉南清, 鄭凱, 譚曉燕
【申請人】江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月24日