一種通過糖多孢紅霉菌sace_3986基因提高紅霉素產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種通過糖多孢紅霉菌SACE_3986基因提高紅霉素產(chǎn)量的方法，所述的方法為：通過基因工程途徑缺失糖多孢紅霉菌的SACE_3986基因，獲得糖多孢紅霉菌紅霉素高產(chǎn)工程菌株，用所述技術(shù)獲得的菌株發(fā)酵可以提高紅霉素產(chǎn)量，本發(fā)明研究中篩選到了紅霉素生物合成負(fù)向調(diào)控子SACE_3986，通過基因工程途徑缺失糖多孢紅霉菌染色體上SACE_3986基因拷貝，能夠獲得紅霉素高產(chǎn)菌株，為工業(yè)生產(chǎn)提高紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量提供技術(shù)支持。
【專利說明】—種通過糖多孢紅霉菌SACE_3986基因提高紅霉素產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要涉及一種提高發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素產(chǎn)量的方法，尤其涉及一種通過缺失糖多孢紅霉菌染色體上負(fù)向調(diào)控基因SACE_3986提高紅霉素產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]放線菌次級代謝產(chǎn)物具有廣泛的用途，如抗生素、抗癌劑、免疫調(diào)節(jié)劑、驅(qū)蟲劑、昆蟲防治劑[I]。目前發(fā)現(xiàn)的23000種生物活性次級代謝產(chǎn)物中，有10000多種是放線菌產(chǎn)生的[2]。然而，這些次級代謝物原始產(chǎn)量非常低，需要通過篩選才能獲得工業(yè)生產(chǎn)高產(chǎn)菌株。過去工業(yè)生產(chǎn)菌株主要通過隨機(jī)物理或化學(xué)誘變方法獲得。傳統(tǒng)的隨機(jī)誘變技術(shù)不但耗時(shí)，而且無法指導(dǎo)對育種進(jìn)行理性設(shè)計(jì)。本發(fā)明目的就是通過基因工程途徑定向改變基因來獲得紅霉素高產(chǎn)菌株，用于紅霉素或中間產(chǎn)物生產(chǎn)。
[0003]糖多孢紅霉菌是1952年從土壤中分離出的革蘭氏陽性絲狀放線菌，其次級代謝產(chǎn)物紅霉素A是重要的廣譜大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，目前紅霉素系列化學(xué)衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、泰利霉素等)被廣泛用來治療感染性疾病。由于紅霉素及其衍生物每年的世界銷售量達(dá)數(shù)百億美元，吸引了許多科學(xué)家來研究如何提高其產(chǎn)量。2007年，Oliynyk等[3]報(bào)道了糖多孢紅霉菌NRRL23338的基因組序列，但糖多孢紅霉菌調(diào)控基因研究很少，到目前為止只有 bldD(SACE_2077) [4]、SACE_7040[5]、SACE_0012[6]和 SACE_5599m 的調(diào)控基因研究報(bào)道，及我們申報(bào)的SACE_3446 (申請?zhí)?201210099708.8)和SACE_7301 (串請?zhí)?201310082765.X)兩項(xiàng)發(fā)明專利。
[0004]原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子可以分為LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、Lac1、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR> NtrC (EBP)、OmpR> DeoR、Cold shock、GntR 和 Crp 等 16 個(gè)家族[8]，其中TetR家族成員在DNA結(jié)合域方面具有螺旋_轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)的結(jié)構(gòu)特征[9][10]。TetR家族在細(xì)菌中普遍存在，大約有2000多個(gè)成員，但到目前為止人們只發(fā)現(xiàn)100多個(gè)成員的特征。糖多孢紅霉菌染色體上有101個(gè)TetR家族基因M，其中有些基因可能參與紅霉素生物合成。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的就是提供一種通過缺失糖多孢紅霉菌中負(fù)向調(diào)控基因SACE_3986提
高紅霉素產(chǎn)量的方法。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種通過糖多孢紅霉菌SACE_3986基因提高紅霉素產(chǎn)量的方法，其特征在于包括以下步驟:
[0008]通過基因工程途徑使糖多孢紅霉菌SACE_3986基因失活，獲得糖多孢紅霉菌紅霉素高產(chǎn)工程菌株，用所述的菌株發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素。
[0009]一種通過糖多孢紅霉菌SACE_3986基因提高紅霉素產(chǎn)量的方法，所述的SACE_3986基因產(chǎn)物可以負(fù)向調(diào)控紅霉素生物合成。
[0010]一種通過糖多孢紅霉菌SACE_3986基因提高紅霉素產(chǎn)量的方法，所述的方法具體表現(xiàn)為以糖多孢紅霉菌SACE_3986基因或其表達(dá)產(chǎn)物為出發(fā)點(diǎn)，尋找到與紅霉素生物合成相關(guān)的新基因或蛋白，通過對尋找到的所有相關(guān)基因進(jìn)行失活、增加拷貝、提高表達(dá)量等辦法構(gòu)建糖多孢紅霉菌紅霉素高產(chǎn)菌株，用于發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素或中間產(chǎn)物
[0011]本發(fā)明的特點(diǎn)是:
[0012]本發(fā)明研究中篩選到了紅霉素生物合成負(fù)向調(diào)控子SACE_3986，通過基因工程途徑缺失糖多孢紅霉菌染色體上SACE_3986基因拷貝，能夠獲得紅霉素高產(chǎn)菌株，為工業(yè)生產(chǎn)提高紅霉素發(fā)酵產(chǎn)量提供技術(shù)支持。
[0013]糖多孢紅霉菌A226中敲除SACE_3986基因時(shí)紅霉素產(chǎn)量提高了 43%，而在Δ SACE_3986基因突變株中回補(bǔ)SACE_3986基因，紅霉素產(chǎn)量得到恢復(fù)，表明SACE_3986是一個(gè)參與紅霉素生物合成的負(fù)向調(diào)控子。當(dāng)在糖多孢紅霉菌A226中增加SACE_3986基因拷貝時(shí)，紅霉素產(chǎn)量較出發(fā)菌株降低50%，說明在糖多孢紅霉菌中缺失SACE_3986基因，可以構(gòu)建紅霉素高產(chǎn)菌株。
[0014]同時(shí)，紅霉素生物合成基因調(diào)控是一個(gè)網(wǎng)絡(luò)，通過基因工程途徑改變SACE_3986基因或產(chǎn)物的上下游調(diào)控因子，也可構(gòu)建紅霉素高產(chǎn)菌株，用于提高發(fā)酵紅霉素產(chǎn)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明的染色體同源重組技術(shù)示意圖；
[0016]圖2為SACE_3986基因在糖多孢紅霉菌染色體上的位置及所編碼的氨基酸序列；
[0017]圖3為Λ SACE_3·986突變體鑒定及紅霉素產(chǎn)量分析，其中(A) Δ SACE_3986突變體鑒定:SACE_3986基因(672bp)被tsr抗性基因(1360bp)替換后長度增加了 688bp ；M, 5000bp DNA Marker ； (B)糖多孢紅霉菌出發(fā)菌株A226、突變菌株Λ SACE_3986及回復(fù)菌株 Λ SACE_3986/pIB1393986 (對照為 Λ SACE_3986/pIB139)在 R5 培養(yǎng)基中 30°C發(fā)酵 6 天產(chǎn)物HPLC分析；
[0018]圖4為SACE_3986基因過表達(dá)及紅霉素產(chǎn)量分析，其中(A) A226/pIB1393986過表達(dá)菌株P(guān)CR鑒定:PCR產(chǎn)物為pIB139載體上SACE_3986基因(672bp)和apr抗性基因(776bp) ;M, 5000bp DNA Marker ； (B)糖多孢紅霉菌出發(fā)菌株A226、過表達(dá)菌株A226/PIB1393986(對照為A226/pIB139)在R5培養(yǎng)基中30°C發(fā)酵6天產(chǎn)物HPLC分析；
[0019]圖5為ASACE_3986與出發(fā)菌株A226中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄分析；
[0020]圖6為載體pET28a3986的成功構(gòu)建與SACE_3986蛋白的表達(dá)及其純化，其中(A)為pET28a3986質(zhì)粒的鑒定:目的條帶SACE_3986基因(672bp)被PCR擴(kuò)增出；M, 5000bpDNA Marker, (B)為SACE_3986蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化:1M泳道顯示的為純化后的目的蛋白；M.Markerl.pET28a2.pET28a3986 (未誘導(dǎo))3.pET28a3986 (誘導(dǎo)未純化)lM-40mM.不同濃度咪唑洗脫后的蛋白
[0021]圖7為陽性對照BldD蛋白和SACE_3986蛋白與eryAI基因啟動(dòng)子的EMSA實(shí)驗(yàn):其中㈧為BldD蛋白與PeryAI啟動(dòng)子的EMSA實(shí)驗(yàn)，(B)為SACE_3986蛋白與PeryAI啟動(dòng)子的EMSA實(shí)驗(yàn)；
[0022]圖8 為 SACE_3986 蛋白與 SACE_3985—SACE_3986 基因間隔區(qū)的 EMSA 實(shí)驗(yàn)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1
[0024]1.1菌株、質(zhì)粒與生長條件
[0025]試驗(yàn)中使用到的菌株和質(zhì)粒見表1。大腸桿菌在37°C的液體LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基或在添加1.25%瓊脂的LB平板上培養(yǎng)。紅霉素生產(chǎn)菌糖多孢紅霉菌A226及其工程菌株在30°C胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基或在含有2.2%瓊脂的R3M平板上培養(yǎng)。
[0026]1.2材料、DNA操作與測序
[0027]PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫鏈絲菌肽、安普霉素從Sigma公司購買。TSB、酵母提取物、蛋白胨購買于Oxoid公司。甘氨酸、瓊脂粉、氯化鈉和其它生物學(xué)試劑都購于試劑公司。 大腸桿菌和糖多孢紅霉菌的一般操作技術(shù)按照標(biāo)準(zhǔn)操作。引物的合成和DNA測序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。
[0028]表1試驗(yàn)中使用到的菌株和質(zhì)粒
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種通過糖多孢紅霉菌SACE_3986基因提高紅霉素產(chǎn)量的方法，其特征在于包括以下步驟: 通過基因工程途徑使糖多孢紅霉菌SACE_3986基因失活，獲得糖多孢紅霉菌紅霉素高產(chǎn)工程菌株，用所述的菌株發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過糖多孢紅霉菌SACE_3986基因提高紅霉素產(chǎn)量的方法，其特征在于所述的SACE_3986基因產(chǎn)物可以負(fù)向調(diào)控紅霉素生物合成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種通過糖多孢紅霉菌SACE_3986基因提高紅霉素產(chǎn)量的方法，其特征在于所述的方法具體表現(xiàn)為以糖多孢紅霉菌SACE_3986基因或其表達(dá)產(chǎn)物為出發(fā)點(diǎn)，尋找到與紅霉素生物合成相關(guān)的新基因或蛋白，通過對尋找到的所有相關(guān)基因進(jìn)行失活、增加拷貝、提高表達(dá)量等辦法構(gòu)建糖多孢紅霉菌紅霉素高產(chǎn)菌株，用于發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素或中間產(chǎn)物。`
【文檔編號】C12P19/62GK103849642SQ201410014348
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】張部昌, 吳攀攀, 吳杭, 朱林 申請人:安徽大學(xué), 合肥泰瑞生物技術(shù)有限公司