一種嗜冷孟氏假單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種嗜冷孟氏假單胞菌Pseudomonas?mandelii?CBS-1，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M2013618，保藏日期為2013年11月28日。還提供了上述嗜冷孟氏假單胞菌在制備聚羥基丁酸酯中的應(yīng)用。該菌種能積累聚羥基丁酸酯，在48小時(shí)內(nèi)有氧生長(zhǎng)到細(xì)胞干重達(dá)29.3g/L，合成PHB量達(dá)22.3g/L，PHB產(chǎn)率高，大大降低了工業(yè)生產(chǎn)PHB的成本。
【專利說明】一種嗜冷孟氏假單胞菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，特別涉及一種嗜冷孟氏假單胞菌，還涉及該菌株的應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]聚羥基脂肪酸脂(PHAs)是由單體羥基脂肪酸酯構(gòu)成的可降解聚合物，它能被許多微生物合成。許多細(xì)菌用PHA作為碳源的儲(chǔ)備物來避免營(yíng)養(yǎng)的不足，包括氮、磷、續(xù)兀素(Dowes and Senior, 1973)。同時(shí)，PHA能被細(xì)菌和古生菌合成(Steinucheland Byrom, 1991),研究較多的有產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligene sp.) (Linko et al.，1993)、固氮菌屬(Azotobacter sp.) (Page, 1992)、芽抱桿菌屬(Bacillus sp.) (Huang andReusch, 1996)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas sp.) (Yue et al., 2007)和假單胞菌屬(Pseudomonas sp.) (Kimura et al., 1992)。
[0003]聚羥基丁酸酯(PHB)是最簡(jiǎn)單的PHA聚合物，擁有可降解性、質(zhì)量輕、熱塑性和抗磨損性的優(yōu)點(diǎn)(Steinbuchel and Valeniin, 1995), PHB在被用作為可降解塑料、醫(yī)用移植材料和優(yōu)質(zhì)化學(xué)品方面有很大的潛能。
[0004]由于嗜冷菌在相對(duì)較低溫度下的高效、多樣的生物合成能力，這些微生物給生物技術(shù)提供了重要的資源(Moyer and Morita, 2007)。從極地纟韋度帶獲得的土樣中有豐富的嗜冷菌，例如Jiang等人(2008)從阿拉斯加土樣中首次分離得到了熒光假單胞菌，又如在南極洲的一個(gè)臨時(shí)的池塘中分離得到了 P.Extremaustralis sp.nov.strainl4_3T。這兩種嗜冷菌能在低溫下積累PHB。然而，現(xiàn)有菌種即使長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵后PHB產(chǎn)量也很少，因此，PHB的生物合成比標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)合成更昂貴，這也就限制了生物合成PHB的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0005]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于提供一種在低溫下能高產(chǎn)PHB的嗜冷孟氏假單胞菌。
[0006]本發(fā)明的第二目的是提供上述菌種在制備聚羥基丁酸酯中的應(yīng)用。
[0007]技術(shù)方案:為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種嗜冷孟氏假單胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址:湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)，郵政編碼為430072，其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2013618，保藏日期為2013年11月28日。
[0008]本發(fā)明嗜冷孟氏假單胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1的分離過程為:來自中國(guó)吉林省長(zhǎng)白山的土壤將菌源土壤懸浮在無菌水中，充分斡旋振蕩，置于富集培養(yǎng)基中20°C下培養(yǎng)2天；取等量50 μ L的培養(yǎng)液加到平板培養(yǎng)基上，20°C培養(yǎng)過夜。
[0009]結(jié)合嗜冷孟氏假單胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1的菌落形態(tài)特征、生理和生化特征，將所測(cè)16SrDNA序列通過BLAST比對(duì)，鑒定其為嗜冷孟氏假單胞菌(Pseudomonasmandelii)。嗜冷孟氏假單胞菌 Pseudomonas mandelii CBS-1 的 16SrDNA 序列如 SEQ IDN0.1所示。[0010]本發(fā)明還提供了上述嗜冷孟氏假單胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1在制備聚羥基丁酸酯中的應(yīng)用。
[0011]所述應(yīng)用，具體為:將嗜冷孟氏假單胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1接種于基
本培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，分離，即得聚羥基丁酸酯。
[0012]所述基本培養(yǎng)基包括1%蔗糖作為碳源、谷氨酸鈉作為氮源、1.0g/L KH2PO4,2.5g/LNa2HPO4、0-2g/L NaCl，pH 為 7.0-8.0，優(yōu)選 7.0-7.5，C/N 比在 5 以上，優(yōu)選 5-30?
[0013]其中，培養(yǎng)溫度為15_30°C，優(yōu)選20_25°C，培養(yǎng)時(shí)間為48_72h。
[0014]有益效果:本發(fā)明提供了一種嗜冷孟氏假單胞菌，能積累聚羥基丁酸酯，在48小時(shí)內(nèi)有氧生長(zhǎng)到細(xì)胞干重達(dá)29.3g/L，合成PHB量達(dá)22.3g/L，PHB產(chǎn)率高，大大降低了工業(yè)生產(chǎn)PHB的成本。
[0015]與其他在低溫下產(chǎn)PHB的菌種相比，CBS-1菌在工業(yè)化生產(chǎn)方面更有前景。例如，Pseudomonas mandelii CBS-1 (縮寫CBS-1)菌是使用蔗糖作為碳源的，所以PHB的生產(chǎn)與那些需要昂貴碳源的菌種相比經(jīng)濟(jì)得多。而且，CBS-1菌比Jiang et al.(2008)研究的菌種能達(dá)到更高的最大細(xì)胞密度值，他們選用的菌種要培養(yǎng)4天才能達(dá)到A2a5菌的最大細(xì)胞密度和PHB的最大濃度，而CBS-1菌只要48小時(shí)。因此，CBS-1菌能以低的成本積累大量的PHB，與A2a5菌相比，能以更低的成本、更高的效率生產(chǎn)更高產(chǎn)量的PHB。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為包含PHB顆粒物的CBS-1菌的超薄切片的透射電子顯微圖，放大倍數(shù)2500χο
[0017]圖2為CBS-1菌和其它相關(guān)菌屬的系統(tǒng)進(jìn)化樹；展示了 1000個(gè)復(fù)制品的分支支持率，基準(zhǔn)尺代表著每個(gè)位置有0.001個(gè)核苷酸代替，括號(hào)里的號(hào)碼是16S rRNA基因序列進(jìn)入GenBank的登錄號(hào)。
[0018]圖3為培養(yǎng)條件對(duì)CBS-1菌生長(zhǎng)的影響；其中，溫度(A)，C/N比率(B)，pH(C)，NaCl濃度(D)。
[0019]圖4為標(biāo)準(zhǔn)PHB和CBS-1菌產(chǎn)生的PHB的核磁共振氫譜。
[0020]圖5為蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中25°C下有氧培養(yǎng)的CBS-1菌干重和PHB的產(chǎn)量；每個(gè)點(diǎn)代表三組平行實(shí)驗(yàn)的平均值。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做出進(jìn)一步說明。
[0022]實(shí)施例1菌株的分離
[0023]1、菌種和培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件
[0024]( I)菌源
[0025]來自中國(guó)吉林省長(zhǎng)白山(海拔為2183m，北緯42 ° 08 ' 19.7 "，東經(jīng)128° 10' 8.3")的土壤
[0026](2)培養(yǎng)基
[0027]富集培養(yǎng)基:5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨和2.5g/L Nacl ；
[0028]平板培養(yǎng)基:20g/L葡萄糖，2g/L(NH4)2SO4,13.3g/L KH2P04,1.2g/LMgS04.7H20,1.7g/L檸檬酸，1.7g/L微量元素溶液，15g/L瓊脂，0.5 μ g/mL尼羅藍(lán)A。
[0029]2、菌株的分離和鑒定
[0030](I)菌株的分離
[0031]將菌源土壤懸浮在無菌水中，充分斡旋振蕩，置于富集培養(yǎng)基中20°C下培養(yǎng)2天；取等量50 μ L的培養(yǎng)液加到平板培養(yǎng)基上，20°C培養(yǎng)過夜。
[0032]惡嗪染料尼羅藍(lán)A染色是檢測(cè)生長(zhǎng)的菌落中的聚羥基丁酸和其它PHAs的一種簡(jiǎn)單而高靈敏染色方法，在紫外下進(jìn)行觀察培養(yǎng)基，取帶熒光的菌落劃線接種到同樣的平板培養(yǎng)基上，59個(gè)帶熒光的菌落被純化出來，20°C培養(yǎng)過夜。使用蘇丹黑B染色，其中的27個(gè)能夠被蘇丹黑B染色。
[0033]蘇丹黑B染色最大的、染色最深的的菌體即為CBS-1。
[0034]取菌株，平板活化2天，得培養(yǎng)物。
[0035](2)菌株的鑒定
[0036]細(xì)胞形態(tài):
[0037]按照以下步驟用透射電子顯微鏡來檢測(cè)細(xì)胞形態(tài):指數(shù)后期(最好細(xì)胞濃度為OD600值55-80)的2mL均等菌液中混合進(jìn)4%戊二醛和1%四氧化鋨，并用一系列含量(30%、50%、70%、80%、90%和100%)的 丙醇脫水；脫水后的細(xì)胞包埋在環(huán)氧樹脂中，再轉(zhuǎn)移至樣品池中，樹脂分別在30°C、45°C和60°C下聚合24小時(shí)；超薄樣品使用超微切片機(jī)來切，菌液隨后用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛分別處理22分鐘和5分鐘,最后使用H-7650型號(hào)的透射電子顯微鏡觀察(Hitachi, Tokyo, Japan)。
[0038]電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示:CBS_1菌在潮濕、表面光滑的半透明平板上形成白色、圓形菌落，桿狀，直徑為3-4_，長(zhǎng)5-7_，并且不形成芽孢，細(xì)胞單一或成群地出現(xiàn)，內(nèi)部包含大顆粒物——PHB，見圖1。
[0039]Biolog革蘭氏陰性試驗(yàn):
[0040]把純培養(yǎng)物放在BUG瓊脂平板(Biolog Catalog#70101)上生長(zhǎng)，Biolog?GN96孔的微量滴定板含有95種不同的碳源，一個(gè)陰性對(duì)照和一個(gè)四唑染料(BiologInc.，Hayward, CA, USA)，細(xì)胞再?gòu)钠桨灞砻姹粦腋〉揭环N特定濃度的革蘭氏陰性接種液中。Biolog GN2的微孔板的孔內(nèi)接種著150 μ L稀釋過的懸浮液，然后在30°C下培養(yǎng)24小時(shí)(Garland and Mills, 1991)。根據(jù)廠家的說明，使用 Biolog MicroStation? 來觀察和分析微孔板，得到的結(jié)果與GN III數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比。
[0041]表1CBS-1菌和相關(guān)假單胞菌屬的生化特征
【權(quán)利要求】
1.一種嗜冷孟氏假單胞菌Pseudomonas mandelii CBS-1,保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2013618，保藏日期為2013年11月28日。
2.權(quán)利要求1所述的嗜冷孟氏假單胞菌Pseudomonasmandelii CBS-1在制備聚羥基丁酸酯中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:將嗜冷孟氏假單胞菌Pseudomonasmandelii CBS-1接種于基本培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，分離，即得聚羥基丁酸酯。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述基本培養(yǎng)基包括1%蔗糖作為碳源、谷氨酸鈉作為氮源、1.0g/L KH2PO4,2.5g/L Na2HP04、0_2g/L NaCl，pH 為 7.0_8.0，優(yōu)選7.0-7.5，C/N 比在 5 以上。
5.如權(quán)利要求 3所述的應(yīng)用，其特征在于:培養(yǎng)溫度為15-30°C，培養(yǎng)時(shí)間為48-72h。
【文檔編號(hào)】C12R1/38GK103865838SQ201410014205
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月13日
【發(fā)明者】李榮鵬, 胡南, 吳紅燕 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)