一種假單胞菌菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領域，涉及一種假單胞菌菌株，特別涉及一種假單胞菌菌株及 其應用。
【背景技術】
[0002] 嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila)和溫和氣單胞菌（Aeromonassobria)存 在于養(yǎng)殖水環(huán)境中，常引起幾乎所有淡水養(yǎng)殖魚類患出血性敗血癥，發(fā)病率高，死亡率也很 高，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。過去防治該病主要采用投喂抗生素，外用消毒劑殺滅 水體中的病原菌，長期如此不僅會產(chǎn)生藥物殘留、誘導耐藥病原菌產(chǎn)生和污染水環(huán)境，而且 消毒劑無選擇性殺滅水中有益菌，破壞了水體微生態(tài)平衡，為后續(xù)爆發(fā)細菌性敗血癥埋下 了隱患。
[0003] 由于引起魚類患出血性敗血癥的病原菌（嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌）來自養(yǎng) 殖水體，所以，需要在不影響有益菌的情況下專一殺滅水環(huán)境中的嗜水氣單胞菌和溫和氣 單胞菌，消除養(yǎng)殖魚類的病原來源，預防出血性敗血癥發(fā)生。這是解決上述問題的有效途 徑。

【發(fā)明內容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種假單胞菌菌 株。該菌株的發(fā)酵液中的活性物質具有專一"性抑制嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila) 和溫和氣單胞菌（Aeromonassobria)的作用，對水環(huán)境中分離的其它菌無不良影響，正好 解決了現(xiàn)有技術中的問題。該假單胞菌菌株可開發(fā)成微生態(tài)制劑控制養(yǎng)殖環(huán)境中的病原溫 和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌，預防其感染魚類引起出血性敗血癥。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述假單胞菌菌株的應用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種假單胞菌，菌種命名為Pseudomonasprotegens IAS03,是從池塘底泥分離純化獲得的。
[0008] 所述的假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03的保藏信息：保藏單位：中國典 型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏日期：2015年11月27日，保藏地址：中國.武漢.武漢大 學，保藏編號：CCTCCΝ0:Μ2015711。
[0009] 所述的假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03菌株的液體培養(yǎng)基為牛肉膏蛋 白胨液體培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基配方基礎上，每l〇〇〇ml液體培 養(yǎng)基中加入瓊脂15~20g加熱融化制成。
[0010] 所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂 15~20g/L，pH7. 0~7. 2,121°C、20min高溫滅菌處理；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基不加瓊脂 即可。
[0011] 所述的假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基為LB培養(yǎng) 基，其組分為：蛋白胨l〇g/L、酵母提取粉5g/L、氯化鈉10g/L，pH值7. 0~7. 2,121°C、20min 高溫滅菌處理。
[0012] 本發(fā)明提供的假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03菌株應用于抑制嗜水氣 單胞菌和/或溫和氣單胞菌。
[0013] 所述的假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03在預防嗜水氣單胞菌和/或溫 和氣單胞菌感染中的應用。
[0014] 所述的假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03在制備抑制嗜水氣單胞菌和/ 或溫和氣單胞菌的產(chǎn)品中的應用。
[0015] 所述的假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03菌株抑制嗜水氣單胞菌和溫和 氣單胞菌的原理在于假單胞菌屬既能通過營養(yǎng)競爭抑制病原菌的生長，還能產(chǎn)生嗜鐵素、 氫氰酸、卵菌素、吩嗪-1-羧酸和藤黃菌素等具有抑菌作用的次級代謝產(chǎn)物和抗菌多肽，專 一抑殺病原菌，而對其他菌或者藻類不造成傷害，從而保證了在不破壞水體生態(tài)系統(tǒng)平衡 的前提下，從源頭上殺滅病原菌。
[0016] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，具有如下的優(yōu)點及效果：
[0017] (1)本發(fā)明提供了假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03 菌株。
[0018] (2)本發(fā)明的假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03菌株從池塘底泥篩選得 至IJ，再用回水體不存在生態(tài)安全風險，符合生物安全法規(guī)。
[0019] (3)本發(fā)明的假單胞菌IAS03菌株能夠有效抑制水產(chǎn)病原菌：嗜水氣單胞菌和/ 或溫和氣單胞菌。
[0020] (4)本發(fā)明的假單胞菌IAS03菌株對嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌產(chǎn)生抑菌效 果，而對其他細菌無抑制效果，具有專一性的抑菌作用，而且該菌對魚無致病性。
[0021] (5)本發(fā)明的假單胞菌IAS03菌株僅須單一菌株即可應用于抑制嗜水氣單胞菌和 /或溫和氣單胞菌，相對于傳統(tǒng)的抗生素和消毒劑防治措施，具有安全、綠色、高效的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0022] 圖1是假單胞菌IAS03菌株的菌液對嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的抑制效果； 其中，圖1A為假單胞菌IAS03菌株的菌液對嗜水氣單胞菌的抑制效果；圖1B為假單胞菌 IAS03菌株的菌液對溫和氣單胞菌的抑制效果。
[0023] 圖2是假單胞菌IAS03菌株的無菌發(fā)酵液10倍濃縮液對嗜水氣單胞菌和溫和氣 單胞菌的抑制效果；其中，圖2A為假單胞菌IAS03菌株的無菌發(fā)酵液10倍濃縮液對溫和氣 單胞菌的抑制效果；圖2B為假單胞菌IAS03菌株的無菌發(fā)酵液10倍濃縮液對嗜水氣單胞 菌的抑制效果。
[0024] 圖3是假單胞菌IAS03菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落生長情況和在KB固體培養(yǎng)基 上的熒光現(xiàn)象；其中，圖3A為假單胞菌IAS03菌株在PDA固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結果；圖3B 為假單胞菌IAS03菌株在KB固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結果，在302nm的紫外燈下觀察到藍色熒 光。
[0025] 圖4是假單胞菌IAS03菌株16SrDNAPCR擴增凝膠電泳圖；其中，泳道Μ為DNA markerDL2000 ;泳道1~6為擴增的假單胞菌IAS03菌株16SrDNA條帶。
[0026] 圖5是10ppm假單胞菌IAS03發(fā)酵液對嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的抑制效 果；其中，圖5A為嗜水氣單胞菌；圖5B為溫和氣單胞菌。
[0027] 圖6是15ppm假單胞菌IAS03發(fā)酵液對嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的抑制效 果；其中，圖6A為嗜水氣單胞菌；圖6B為溫和氣單胞菌。
[0028] 圖7是20ppm假單胞菌IAS03發(fā)酵液對嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的抑制效 果；其中，圖7A為嗜水氣單胞菌；圖7B為溫和氣單胞菌。
[0029] 圖8是25ppm假單胞菌IAS03發(fā)酵液對嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的抑制效 果；其中，圖8A為嗜水氣單胞菌；圖8B為溫和氣單胞菌。
[0030] 圖9是30ppm假單胞菌IAS03發(fā)酵液對嗜水氣單胞菌與溫和氣單胞菌的抑制效 果；其中，圖9A為嗜水氣單胞菌；圖9B為溫和氣單胞菌。
[0031] 注：*表示加入假單胞菌IAS03發(fā)酵液的組（試驗組）的嗜水氣單胞菌或溫和氣 單胞菌的量顯著低于對照組（P〈〇. 05)，不同小寫字母表示試驗組不同時間點嗜水氣單胞菌 或溫和氣單胞菌的量間存在顯著差異（P〈〇. 05)，而相同字母表示無顯著差異。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細描述，但本發(fā)明的實施方式不限于 此。
[0033] 實施例中所述的溫和氣單胞菌（Aeromonassobria)在文獻"滅活菌苗免疫的中華 倒刺鈀外周血免疫指標的變化[J].水產(chǎn)學報，2010, 04:626-634. "中公開。
[0034] 嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila)在文獻"42種中草藥對嗜水氣單胞菌的 體外抑菌試驗[J].淡水漁業(yè)，2011，03:61-65. "中公開。
[0035] 所述的假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03的保藏信息：保藏單位：中國典 型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏日期：2015年11月27日，保藏地址：中國.武漢.武漢大 學，保藏編號：CCTCCΝ0:Μ2015711。
[0036] 實施例1
[0037] 所述的假單胞菌（Pseudomonasprotegens)IAS03的篩選與鑒定方法，步驟如下：
[0038] (1)稱取來自廣州市某池塘的底泥10g于三角燒瓶中，加90mL滅菌水，28°C， 160r/min，恒溫搖床振蕩30min，靜置5min后取上清，采用梯度稀釋法將上清稀釋103倍， 取0. 15mL稀釋液于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板均勻涂布，28°C恒溫培養(yǎng)16h。牛肉膏蛋 白胨固體培養(yǎng)基：蛋白胨l〇g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂15~20g、加水至1000mL、pH7. 0， 121°C、20min高溫滅菌處理。相同配方的液體培養(yǎng)基不加瓊脂。
[0039] (2)挑取步驟⑴中平板上的單菌落于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28°C，160r/ min，恒溫搖床振蕩8h，待0D6。。達到0. 8時，吸取10μL的菌液，通過梯度稀釋10 4倍，取 0.lmL于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板均勻涂布，28°C恒溫培養(yǎng)16h，觀察菌落是否單一， 重復3次，并做好標記。
[0040](3)將單一的菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28°C，160r/min，恒溫搖床 振蕩8h，作為種子液，按照2% (v/v)的比例接種于裝有50mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的 250mL的三角燒瓶，在28°C下1