一種假單胞菌及其生物制劑和制備方法與應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種假單胞菌及其生物制劑和制備方法與應用。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草生產(chǎn)過程中常常受到病害的危害，目前化學農(nóng)藥仍然是防治病害的主要方法。化學農(nóng)藥使用后或多或少會對植煙土壤和煙葉造成殘留，影響著環(huán)境和煙葉的安全。在減少農(nóng)殘方面，除了篩選高效低殘留的農(nóng)藥、科學施用方法、農(nóng)藥替代等技術(shù)外，生物降解也是有效的技術(shù)之一。美國科學家從上世紀60年代開始，著手研究污染環(huán)境的異生物質(zhì)包括化學農(nóng)藥等的微生物降解，旨在通過微生物技術(shù)清除環(huán)境污染物。國內(nèi)外有許多報道將微生物作為接種劑直接接種到自然環(huán)境中，降解、清除環(huán)境中污染物成功的例子。利用微生物對農(nóng)藥污染物進行降解和轉(zhuǎn)化有著巨大潛力，這與微生物所具備的幾個方面的特點有關(guān):微生物個體微小，比表面積大，代謝速度快；微生物種類繁多，分布廣，代謝類型多樣；微生物繁殖快、易變異、適應性強；在自然界的生態(tài)系統(tǒng)中微生物可產(chǎn)生降解酶將農(nóng)藥分解為無毒的小分子化合物甚至完全礦化為二氧化碳和水；另外微生物可通過共代謝作用，加快或促進農(nóng)藥殘留的降解速度。國內(nèi)外已分離篩選到許多降解或轉(zhuǎn)化一種或幾種農(nóng)藥的微生物類群。據(jù)不完全統(tǒng)計，已報道的農(nóng)藥降解細菌至少有28各屬、真菌有14個屬，放線菌有5個屬。細菌主要有假單胞菌屬棒狀桿菌屬芽抱桿菌屬(SaciWiAs)、節(jié)桿菌屬(AriAraAacter)、黃桿菌屬、黃擔保桿菌屬{Xanthomolza^)。真菌主要有曲霉屬(AspergUJua)、青霉屬{Penlcilliuii)霉罵(Trichoderma)和鐮刀菌屬{Fuariuni)。農(nóng)藥殘留的微生物降解技術(shù)相比于物理化學修復技術(shù)，具有經(jīng)濟、高效和無二次污染等優(yōu)點，是一個有潛力的、充滿希望的農(nóng)藥污染修復方法。農(nóng)藥的微生物降解研究受到國內(nèi)外的關(guān)注，在大農(nóng)業(yè)農(nóng)殘的降解和環(huán)境修復中逐步得到應用。甲基托布津是煙草生產(chǎn)過程中的常見農(nóng)藥，也經(jīng)常會造成煙葉的農(nóng)藥殘留。分離和篩選到能夠降解甲基托布津的微生物，并應用其降低煙葉中甲基托布津的殘留量是本發(fā)明的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明第一目的在于提供一種假單胞菌，第二目的在于提供一種以所述假單胞菌作為活性成分的生物制劑，第三目的在于提供所述以假單胞菌作為活性成分的生物制劑制備方法，第四目的在于提供所述假單胞菌作為活性成分的生物制劑的應用。
[0004]本發(fā)明第一目的是這樣實現(xiàn)的，所述的假單胞菌為黃色海假單胞菌Pseudomonasxanthomarina TP 157，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日:2014年11月21日，保藏編號:CGMCC N0.10034 ;所述假單胞菌屬于細菌界，變形菌門，γ -變形菌綱，假單胞菌目，假單胞菌科，假單胞菌屬。
[0005]黃色海假單胞菌Pseuckmonas xan thomarina TP 157的獲得與鑒定: 菌株分離篩選方法:
分離培養(yǎng)基:Na2HP04 3g，ΚΗ2Ρ04 1.5g，NH4C1 0.5g，蒸餾水 500ml，瓊脂 7_8g，pH 7.0(用NaOH調(diào)節(jié))，在倒平板的時候再加入0.5ml的CaCljP MgSO 47H20，終濃度為0.1 %的甲基托布津。
[0006]量取45ml水放入小三角瓶內(nèi)，在121°C、20min高壓蒸汽滅菌一稱取5g煙葉樣品放入滅菌后的小三角瓶內(nèi)，放入30°C，150r/min搖床，30min后取出靜置片刻一用移液槍吸取200ul上層液于已經(jīng)倒好的的分離培養(yǎng)基平板上，用涂布器涂布均勻一放于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d—待長出多個單菌落后，在操作臺內(nèi)挑選長出的單個菌落于已經(jīng)裝滿1ml LB液體培養(yǎng)基的保存管內(nèi)一再放于放入30°C，150r/min搖床培養(yǎng)3d —待菌長滿保存管后一加入甘油終濃度達到40%，放于-80 °C冰箱內(nèi)保藏。
[0007]分離的菌株通過液體培養(yǎng)的方法鑒定其降解甲基托布津的能力。上述分離菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1天，加入終濃度為200ppm的甲基托布津農(nóng)藥，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3天，取樣通過HPLC檢測方法檢測甲基托布津的殘留量。
[0008]甲基托布津的HPLC檢測方法:取lmL培養(yǎng)液，過0.22 μ m有機相濾膜，待測。色譜柱:Z0RBAX Eclipse XDB- C18 (4.6 X 250mm，5 μ m);柱溫:30.0°C ;檢測波長:275nm，流動相A:CH30H，B:H20，C:CH3CN ;流速:0.7mL/min ;進樣量:10.Ομ?，洗脫采用梯度洗脫。
[0009]菌株分離篩選結(jié)果:
通過分離和篩選得到一株能夠在3天培養(yǎng)后高效降解甲基托布津的菌株，降解率達到98.6%，該菌株標記為了？157。該菌株于2014年11月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏登記入冊的編號CGMCCΝ0.10034。
[0010]菌株鑒定方法:
降解菌株的培養(yǎng)特征及生理生化鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》。和《Bergey’ sManual of Determinative Bacter1logy》進行。菌體總DNA的提取采用高鹽法，并以總DNA為模板，擴增降解菌株的16S rRNA基因序列。PCR擴增產(chǎn)物純化回收，進行TA克隆后進行測序。測序結(jié)果使用原核生物鑒定數(shù)據(jù)庫EzBilCloud (http: //eztaxon~e.ezb1cloud.net/)進行在線比對分析。
[0011]鑒定結(jié)果:
TP 157菌株系本發(fā)明人從大量煙草葉片上篩選出來的，具有顯著降低甲基托布津含量的能力，經(jīng)生理生化實驗和16S rDNA序列進行鑒定，確定是黃色海假單胞菌Pseudomomsxan thomarina TP 157 菌株。
[0012]隹Pseudcmonas xan thomarina TP 157菌株主要特征為:菌落呈白色假根狀，表面干燥高起，邊緣絲狀。菌體呈短桿狀，革蘭氏陽性。明膠液化、牛奶凝固、V.P、硝酸鹽還原、亞硝酸還原、反硝化、產(chǎn)氨、卵磷脂酶等特性均為陰性，牛奶胨化、淀粉水解、甲基紅、檸檬酸鹽利用試驗、丙二酸利用、蔗糖發(fā)酵、葡萄糖氧化發(fā)酵等反應特性均為陽性。
[0013]本發(fā)明第二目的是這樣實現(xiàn)的，是以所述黃色海假單胞菌而mm狀xan thomarina TP 157經(jīng)試管種培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)后制成的生物制劑。
[0014]本發(fā)明第三目的是這樣實現(xiàn)的，包括試管種培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)步驟，具體包括:
A、試管種培養(yǎng):將黃色海假單胞菌xan thomarina TP 157接種到試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度28~31°C恒溫培養(yǎng)1~2天，得試管種；
B、液體發(fā)酵培養(yǎng):將試管種接種到液體培養(yǎng)基中，在溫度28~31V下?lián)u床培養(yǎng)2~3天得到目標物假單胞菌為活性成分的生物制劑。
[0015]本發(fā)明第四目的是這樣實現(xiàn)的，所述的假單胞菌為活性成分的生物制劑在降低煙草甲基托布津殘留量中的應用。
[0016]本發(fā)明從大量煙草葉面中分離篩選出一株能夠顯著降低甲基托布津含量的菌株TP157，通過液體發(fā)酵制備成煙草降害生物制劑。本制劑可顯著降低煙草葉片甲基托布津殘留量，在煙葉生產(chǎn)上具有較好的應用價值。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或改進，均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0018]本發(fā)明所述的假單胞菌為黃色海假單胞菌Pseudomoims xan thomarina TP 157，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏日:2014年11月21日，保藏編號:CGMCC N0.10034 ;所述假單胞菌屬于細菌界，變形菌門，γ-變形菌綱，假單胞菌目，假單胞菌科，假單胞菌屬。
[0019]本發(fā)明所述的假單胞菌為活性成分的生物制劑，是以所述黃色海假單胞菌Pseudomonas xan thomarina TP 157經(jīng)試管種培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)后制成的生物制劑。
[0020]所述的假單胞菌為活性成分的生物制劑中菌濃度為??每ml活菌數(shù)多108o
[0021]本發(fā)明所述的假單胞菌為活性成分的生物制劑的制備方法，包括試管種培養(yǎng)、液體發(fā)酵培養(yǎng)步驟，具體包括:
A、試管種培養(yǎng):將黃色海假單胞菌xanthomarina TP 157接種到試管斜面培養(yǎng)基上，在溫度28~31°C恒溫培養(yǎng)1~2天，得試管種；
B、液體發(fā)酵培養(yǎng):將試管種接種到液體培養(yǎng)基中，在溫度28~31V下?lián)u床培養(yǎng)2~3天得到目標物假單胞菌為活性成分的生物制劑。
[0022]A步驟中所述的試管斜面培養(yǎng)基的成分為:酪蛋白l~3g，大豆蛋白胨0.5~1.5 g，氯化鈉0.4-0.7 g，瓊脂1.5-2 g，其余為水，pH值為6.0-7.0。
[0023]B步驟中所述的液體培養(yǎng)基的成分為:酪蛋白1~3 g，大豆蛋白胨0.3-1.0 g，氯化鈉0.2-0.6 g，磷酸氫二鉀0.2-0.4 g，蔗糖0.2-0.6 g，其余為水，pH值為6.0-7.0。
[0024]B步驟中所述搖床的轉(zhuǎn)速為180~200rpm。
[0025]本發(fā)明所述的假單胞菌為活性成分的生物制劑的應用為所述的假單胞菌為活性成分的生物制劑在降低煙草甲基托布津殘留量中的應用。
[0026]本發(fā)明生物制劑制備的具體操作如下:
1、試管種培養(yǎng)
試管斜面培養(yǎng)基配方為:酪蛋白l~3g，大豆蛋白胨0.5-1.5g，氯化鈉0.4-0.7g，瓊脂
1.5~2g，瓊脂 1.5~2g，其余為水，pH 6-7 ;
將TP157菌株接種到試管斜面培養(yǎng)基上，28~31°C