專(zhuān)利名稱：惡臭假單胞菌zwl73及其制法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是一種惡臭假單胞菌ZWL73及其制法和應(yīng)用。本專(zhuān)利用的微生物即惡臭假單胞菌ZWL73(Pseudomonas putida ZWL73)，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期是2003年4月4日，保藏號(hào)是CCTCC NOM 203021。
背景技術(shù)：
眾所周知，氯代硝基苯類(lèi)化合物(Chloronitrobenzenes，以下簡(jiǎn)稱CNBs)作為原材料和中間體被廣泛用于生產(chǎn)和制造各種染料、農(nóng)藥、醫(yī)用藥品，氯代硝基苯等芳香族化合物具有多種途徑進(jìn)入環(huán)境成為污染物，例如殘留在生產(chǎn)過(guò)程中排放的廢水、作為染料、農(nóng)藥等生產(chǎn)過(guò)程的中間體的不徹底轉(zhuǎn)化而隨廢物排放。歐共體早已宣布氯代硝基苯是一種特別有害的化合物且在環(huán)境中難以降解(EEC，1982)，我國(guó)確定其為水中的優(yōu)先污染物。氯代硝基苯還被發(fā)現(xiàn)會(huì)引起人體和動(dòng)物的高鐵血紅蛋白血癥(methemoglobinemia)(Linch，1974)，而且是一種誘變劑(Shimizu，1983)和致癌劑(Weisburger，1978)。因比，研究氯代硝基苯類(lèi)化合物的生物降解對(duì)于環(huán)境保護(hù)及人類(lèi)的健康具有重要意義。
對(duì)于氯代硝基苯類(lèi)化合物的生物降解，以及微生物對(duì)此類(lèi)化合物降解途徑鮮有報(bào)道，有些工作者觀察到了對(duì)CNBs的生物轉(zhuǎn)化而不是它們的徹底無(wú)機(jī)化，例如，假單胞桿菌CBS3菌株的靜止細(xì)胞以低速率將1-氯-4-硝基苯(以下簡(jiǎn)稱1C4NB)轉(zhuǎn)化成4-氯苯胺等物，但不能繼續(xù)降解(Schackmann and Muller，1991)。Livingston(1993)用一混合培養(yǎng)物降解1-氯-3硝基苯，并使其徹底無(wú)機(jī)化。而Park(1999)等人用兩株菌株共同作用，將1-和2-C4NBs降解并無(wú)機(jī)化。細(xì)菌LW1(屬于Comamonadaceae)能夠利用1C4NB作為唯一的碳源、氮源和能源生長(zhǎng)，推測(cè)其代謝途徑可能是通過(guò)2-氨基-5-氯酚作為開(kāi)環(huán)底物(Katsivela et al.，1999)，這是目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)純培養(yǎng)微生物菌株徹底礦化氯代硝基苯僅有的兩個(gè)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種惡臭假單胞菌ZWL73及其制法和應(yīng)用，該菌以1C4NB作為唯一的碳源、氮源和能源生長(zhǎng)，從而為生物治理這類(lèi)化合物的污染提供充足的菌種資源。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題的方案是惡臭假單胞菌ZWL73，是通過(guò)16S rDNA序列測(cè)定且與GenBank已收錄的序列進(jìn)行核苷酸同源性比較而確定的。
惡臭假單胞菌ZWL73，作為1-氯-4-硝基苯的降解菌，其以1-氯-4-硝基苯作為唯一的碳源、氮源和能源生長(zhǎng)。
惡臭假單胞菌ZWL73的制備方法，包括如下步驟a.配制無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分為Na2HPO4·12H2O 14.3g；KH2PO43.0g；MnSO4·H2O 0.28mg；FeSO4·7H2O0.3mg；MgSO4 0.06mg；CaCL21mg；CuSO40.05mg；ZnSO40.05mg和H3BO30.05mg，將其以雙蒸水定容至1000ml，調(diào)pH 7.0，高壓滅菌。
b.菌種的富集從化工廠土壤中取樣，將土樣配制成20％懸浮液，以10％的接種量接種到含1-氯-4-硝基苯(0.5mM)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，恒溫30℃，搖床培養(yǎng)，待菌長(zhǎng)出后，取1％菌液接入同樣培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖床培養(yǎng)。
c.分離在獲得有顯著降解性能的富集培養(yǎng)物后，利用平板培養(yǎng)技術(shù)，將培養(yǎng)物在含1-氯-4-硝基苯的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中反復(fù)分離和純化，得到菌體形態(tài)一致的降解菌。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)其一.惡臭假單胞菌ZWL73可耐受較高濃度的1C4NB，并能以之為唯一C、N源生長(zhǎng)。因此，該菌能夠徹底降解對(duì)環(huán)境毒害較大的1C4NB，且其降解能力強(qiáng)，若按1％接種的培養(yǎng)物可在48小時(shí)內(nèi)徹底降解6.3mM的1C4NB，同時(shí)，可將其轉(zhuǎn)化為對(duì)環(huán)境無(wú)毒害的物質(zhì)，或?yàn)榫w所利用。
其二.惡臭假單胞菌ZWL73的分離和獲得，為今后研究微生物對(duì)1C4NB的降解代謝途徑，以及從分子生物學(xué)水平揭示1C4NB的降解途徑和機(jī)理，提供了材料。
其三.鑒于惡臭假單胞菌ZWL73能夠徹底降解1C4NB的能力，該菌為生物治理這類(lèi)化合物污染提供了菌種資源。
其四.對(duì)惡臭假單胞菌ZWL73的深入研究，可以為此類(lèi)污染物引起的環(huán)境問(wèn)題的生物控制和生物修復(fù)提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
其五.惡臭假單胞菌ZWL73的制備方法簡(jiǎn)單，操作方便。


圖1是惡臭假單胞菌ZWL73的電鏡照片(×12000)。
圖2是惡臭假單胞菌ZWL73的質(zhì)粒pZWL73的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖3是質(zhì)粒pZWL73的限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切片段的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖4是惡臭假單胞菌ZWL73利用1-氯-4-硝基苯生長(zhǎng)曲線。
圖5是惡臭假單胞菌ZWL73的16S rDNA序列具體實(shí)施方式
本發(fā)明是一種惡臭假單胞菌ZWL73(Pseudomonas putida ZWL73)CCTCC 203021及其制法和應(yīng)用。下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
一.惡臭假單胞菌ZWL731.形態(tài)特征菌落呈白色，光滑，邊緣整齊。菌體呈短桿狀，極生多重鞭毛(見(jiàn)圖1)，革蘭氏染色陰性。
鞭毛觀察方法接種該菌于含0.6％瓊脂的LB斜面，30℃，靜止培養(yǎng)10小時(shí)，蒸餾水洗下菌體，制樣，電鏡觀察。
2.16S rDNA1)序列如圖5所示，約1500bp片段，16s rRNA為原核生物核糖體亞基16s RNA，在原核生物中具有較高的保守性，能夠提供科、屬、種、等多層次的信息。
2)制備方法用E.Z.N.A.Bacterial DNA kit(Omega Bio-tek)制備細(xì)菌基因組DNA。以細(xì)菌16SrDNA通用引物1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)和細(xì)菌的特異引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3)為擴(kuò)增引物，細(xì)菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增降解菌的16S rDNA(約1500bp)片段，送交上?；瞪锛夹g(shù)有限公司測(cè)序。
3)同源性比較用NCBI(natioal center for biotechnology information)BLAST程序?qū)υ摼?6SrDNA序列和GenBank已收錄的序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，16S rDNA序列與GenBank中的16S rDNA序列的同源性見(jiàn)附表，與之序列同源性達(dá)到99.8～99.9％的菌種主要是Pseudomonas putida菌株。所以鑒定該菌為惡臭假單胞菌，并命名為惡臭假單胞菌ZWL73(Pseudomonas putida ZWL73)。
3.質(zhì)粒檢測(cè)通過(guò)堿裂解法提取(參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第二版p19)，發(fā)現(xiàn)該菌具有一較大質(zhì)粒pZWL73(見(jiàn)圖2的73樣品)。與標(biāo)準(zhǔn)的117kb的惡臭假單胞菌PaW1的TOL質(zhì)粒pWWO(見(jiàn)圖2的pWWO樣品)，以及81kb的惡臭假單胞菌NCIB 9816-4的pDTG1質(zhì)粒(見(jiàn)圖2的9816樣品)比較，該菌質(zhì)粒pZWL73約為100kb。用限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切pZWL73質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到pZWL73質(zhì)粒特征性的EcoRI酶切片段電泳圖(見(jiàn)圖3的2電泳孔)。
圖3中的1是分子量對(duì)照λ-HindIII酶切片段，該片段由大到小分別為23kb、9.4kb、6.5kb、4.3kb、2.3kb、2.0kb和0.56kb。
二.惡臭假單胞菌ZWL73的應(yīng)用惡臭假單胞菌ZWL73作為1-氯-4-硝基苯的降解菌，該菌以1-氯-4-硝基苯作為唯一的碳源、氮源和能源生長(zhǎng)。
惡臭假單胞菌ZWL73降解1-氯-4-硝基苯的特性如下接種惡臭假單胞菌ZWL73于0.5mM 1C4NB的10ml無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)接于含1mM 1C4NB的100ml無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體，用新鮮的含0.33mM 1C4NB的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基重懸菌體，28℃搖床培養(yǎng)，不同時(shí)間間隔取樣，用HPLC法測(cè)1C4NB濃度，OD600測(cè)定菌體濃度，離子選擇電極(奧力龍)測(cè)定氯離子濃度，奈氏法測(cè)定銨離子濃度，結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖4結(jié)果表明隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，1C4NB的濃度逐漸降低，菌體濃度逐漸增加，并伴隨著銨離子和氯離子產(chǎn)生。因無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中不含有碳，氮源，惡臭假單胞菌ZWL73細(xì)菌不能利用其生長(zhǎng)，而補(bǔ)充了1C4NB的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基可供該菌生長(zhǎng)，表明該菌以1C4NB為唯一C、N源生長(zhǎng)。另外銨離子的產(chǎn)生表明1C4NB中的硝基首先被徹底還原為氨基，然后經(jīng)分解產(chǎn)生銨離子，氯離子也是在1C4NB分解時(shí)產(chǎn)生。在圖4中， 曲線表示菌體濃度(OD600吸收值)， 曲線表示1C4NB的濃度， 曲線表示銨離子濃度 曲線表示氯離子濃度。
按1％接種量，將Pseudomonas putida ZWL73菌接種于6.3mM 1C4NB的100ml無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，恒溫28℃，搖床培養(yǎng)48小時(shí)，即可使1C4NB完全降解。
三.惡臭假單胞菌ZWL73的制備a.配制無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分為Na2HPO4·12H2O 14.3g；KH2PO43.0g；MnSO4·H2O 0.28mg；FeSO4·7H2O0.3mg；MgSO4 0.06mg；CaCL21mg；CuSO40.05mg；ZnSO40.05mg和H3BO30.05mg，將其以雙蒸水定容至1000ml，調(diào)pH7.0，高壓滅菌。
b.菌種的富集從武漢市葛店化工廠土壤中取樣，將土樣配制成20％懸浮液，以10％的接種量接種到含1-氯-4-硝基苯(0.5mM)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，恒溫30℃，搖床培養(yǎng)，待菌長(zhǎng)出后，取1％菌液接入同樣培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖床培養(yǎng)。
c.分離在獲得有顯著降解性能的富集培養(yǎng)物后，利用平板培養(yǎng)技術(shù)，將培養(yǎng)物在含1-氯-4-硝基苯的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中反復(fù)分離和純化，得到菌體形態(tài)一致的降解菌。
四.附表惡臭假單胞菌ZWL73的16S rDNA的BLAST分析

權(quán)利要求
1.一種惡臭假單胞菌ZWL73(Pseudomonas putida ZWL73)CCTCC 203021，其特征在于所述的惡臭假單胞菌ZWL73，其16S rDNA序列如下GTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGG
2.惡臭假單胞菌ZWL73 CCTCC 203021的應(yīng)用，其特征在于惡臭假單胞菌ZWL73作為1-氯-4-硝基苯的降解菌，該菌以1-氯-4-硝基苯作為唯一的碳源、氮源和能源生長(zhǎng)。
3.惡臭假單胞菌ZWL73 CCTCC 203021的制備方法，包括如下步驟a.配制無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分為Na2HPO4·12H2O 14.3g；KH2PO43.0g；MnSO4·H2O 0.28mg；FeSO4·7H2O0.3mg；MgSO4 0.06mg；CaCL21mg；CuSO40.05mg；ZnSO40.05mg和H3BO30.05mg，將其以雙蒸水定容至1000ml，調(diào)pH 7.0，高壓滅菌，b.菌種的富集從化工廠土壤中取樣，將土樣配制成20％懸浮液，以10％的接種量接種到含1-氯-4-硝基苯(0.5mM)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，恒溫30℃，搖床培養(yǎng)，待菌長(zhǎng)出后，取1％菌液接入同樣培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖床培養(yǎng)，c.分離在獲得有顯著降解性能的富集培養(yǎng)物后，利用平板培養(yǎng)技術(shù)，將培養(yǎng)物在含1-氯-4-硝基苯的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中反復(fù)分離和純化，得到菌體形態(tài)一致的降解菌。
全文摘要
本發(fā)明是一種惡臭假單胞菌ZWL73及其制法和應(yīng)用。惡臭假單胞菌ZWL73，是通過(guò)16S rDNA序列測(cè)定且與GenBank已收錄的序列進(jìn)行核苷酸同源性比較而確定的；該菌作為1－氯－4－硝基苯的降解菌，其以1－氯－4－硝基苯作為唯一的碳源、氮源和能源生長(zhǎng)；該菌的制備方法，包括配制無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基、菌種的富集和分離步驟，得到菌體形態(tài)一致的降解菌。本發(fā)明具有制備方法簡(jiǎn)單、操作方便和降解1－氯－4－硝基苯化合物能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為生物治理這類(lèi)化合物的污染提供了菌種資源，從而利于環(huán)境保護(hù)及人類(lèi)的健康。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1513980SQ0312812
公開(kāi)日2004年7月21日 申請(qǐng)日期2003年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月10日
發(fā)明者周寧一, 劉虹, 王淑君 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所