專利名稱：惡臭假單胞菌kt2440高效的基因敲除方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一種高效地對惡臭假單胞菌KT2440進行 基因敲除的方法。
背景技術(shù)：
惡臭假單胞菌KT2440 (Pseudomonas putida KT2440)是重要的模式環(huán)境微生物 菌株，廣泛應(yīng)用于生理、生態(tài)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)等研究，也是表達異源基因的良好宿主菌。 惡臭假單胞菌KT2440的基因組在2002年被解析，也是第一個被美國衛(wèi)生部重組DNA委員 會認定對環(huán)境安全的革蘭氏陰性菌株。惡臭假單胞菌KT2440是迄今遺傳研究闡述得最為 清晰、代謝多樣性研究得最為透徹的腐生假單胞菌，它保留了在環(huán)境中生存和發(fā)揮功能的 特點，在重要的環(huán)境活動如元素循環(huán)、生物體和非生物體污染物的降解及在生物催化、生物 排污、生物塑料等方面有很大的發(fā)展?jié)摿?。通過遺傳操作，使惡臭假單胞菌KT2440為降解 多種環(huán)境污染物的“超級工程菌”，將對環(huán)境保護和生物防治具有重要意義?；蚯贸蔷?株遺傳操作的主要方式，也是進行基因和蛋白功能的研究、闡述生物降解的途徑和調(diào)控的 主要方法，因此發(fā)展快速、簡便、高效和可以高通量化的基因敲除是充分利用惡臭假單胞菌 KT2440的重要前提。常規(guī)的惡臭假單胞菌KT2440基因敲除方法是利用菌株本身所具有的recA重組系 統(tǒng)。首先利 用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增待敲除的靶基因上游和下游的同源基因，克隆測 序正確后，隨后將抗性基因克隆至上下游的同源基因中間，接著克隆至不能在惡臭假單胞 菌KT2440中自我復(fù)制的“自殺”載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至惡臭假單胞菌KT2440，在抗生 素的抗性作用之下，菌株本身所具有的recA重組系統(tǒng)催化同源片段之間的同源重組而將 重組質(zhì)粒整合至基因組，最后通過重組質(zhì)粒上所攜帶的編碼蔗糖6-果糖轉(zhuǎn)移酶的sacB基 因所行使的負篩選作用，在含10%蔗糖的培養(yǎng)基中促使再發(fā)生一次同源重組而去除整合至 基因組上的質(zhì)粒骨架部分，如此抗性基因取代靶基因而實現(xiàn)了基因敲除。此方法雖然行之有效，但克隆、測序多個步驟耗時、耗力，也增加了實驗的費用。也 未見采用此方法實現(xiàn)大片段基因敲除的報道，此方法還有著需要特殊的載體、難以高通量 化等等缺點。重組工程是上世紀八十年代末興起而逐漸成熟的一種DNA克隆和修飾的基因工 程技術(shù)。它利用重組酶催化的DNA片段之間的同源重組而形式作用。目前所廣泛使用的重 組酶是來自于lambda噬菌體的exo，bet和gam基因，exo (reda) 基因編碼DNA 5’ ->3 外切酶，其作用于雙鏈DNA得到3’端突出的DNA分子，bet (redb)基因編碼DNA單鏈結(jié)合 蛋白，其結(jié)合在突出的DNA分子上，Bet兼有重組酶活性，即可催化同源片段之間發(fā)生同源 重組。gam(redg)基因編碼抑制內(nèi)源性核酸酶的Gam蛋白，Gam可保護外源的、轉(zhuǎn)化至所研 究的宿主菌中的雙鏈DNA片段免受內(nèi)源性DNA酶的降解。在大腸桿菌中同源片段的長度可短至36個堿基對，這使得通過簡便易行的PCR的 手段來獲得線性雙鏈DNA分子并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌而實現(xiàn)基因敲除成為可能。Datsenko等研究人員于2000年報道了利用重組工程手段來實現(xiàn)大腸桿菌的基因敲除(Datsenko，K. Α. and B. L. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA, 2000. 97(12) : 6640-5)。他們 將通過PCR獲得的、兩側(cè)含有同源臂(即與靶基因上下游5’端或3’端序列一致的一段堿基 序列)的抗性基因電轉(zhuǎn)化至經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)而表達重組酶的大腸桿菌細胞中，通過一步 抗性篩選直接得到了靶基因敲除的大腸桿菌突變株。此研究產(chǎn)生了廣泛而深遠的影響，促 進了重組工程的研究和開發(fā)。 重組工程在常規(guī)的基因克隆和修飾方法難以進行或效率極低(如DNA片段過大、 難以尋找合適的酶切位點、DNA凝膠回收難以進行等等)時有著顯著的優(yōu)勢。重組工程避免 了電泳、紫外照射(可引入異常突變)、凝膠回收、DNA連接、轉(zhuǎn)化、克隆篩選等等煩瑣耗時的 操作步驟，可實現(xiàn)高效的基因克隆和修飾。重組工程已逐漸成為常規(guī)基因克隆和修飾手段。重組工程最初是在大腸桿菌的遺傳操作中發(fā)生、發(fā)展和成熟，研究人員不斷地將 此技術(shù)運用于更多地用重要研究價值和實際應(yīng)用價值的微生物菌種中，多數(shù)取得了令人滿 意的效果。但在不同的微生物中，同源片段的長度需加以調(diào)整，且需開發(fā)出不同的誘導(dǎo)和表 達重組酶的系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明提供了一種通過重組工程的方法來實現(xiàn)惡臭假單胞菌 KT2440高效快捷的基因敲除的方法。在本發(fā)明提供了一種運用簡便快捷的重組工程法來實現(xiàn)惡臭假單胞菌KT2440基 因敲除。含待敲除靶基因上下游的抗性基因的獲得是通過重疊一延伸PCR來獲得的。首 先分別采用PCR的方法擴增待敲除靶基因上游的同源基因、抗性基因和下游的同源基因， 分別在上游同源基因和抗性基因之間、抗性基因和下游基因之間設(shè)計重疊的堿基序列。將 所得的三個片段合并后作為模板，再用兩側(cè)的引物擴增得到融合的DNA片段。運用這種重 疊一延伸PCR技術(shù)可快速地獲得用于轉(zhuǎn)化至惡臭假單胞菌KT2440的線性DNA分子。在設(shè) 計基因敲除的引物時，考慮到待敲除的靶基因兩側(cè)的基因分布情形，實現(xiàn)靶基因的讀碼框 內(nèi)敲除，使得靶基因敲除后所留下的卡那霉素抗性基因不造成極性效應(yīng)，即不破壞靶基因 的相鄰基因的表達。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括以下步驟
(1)通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應(yīng)的手段擴增而獲得左右兩側(cè)分別為待敲除的靶基 因上下游各500個堿基對的同源基因、中間為卡那霉素抗性基因的DNA片段；
(2 )將含重組酶基因的質(zhì)粒pLS512轉(zhuǎn)化至惡臭假單胞菌KT2440中，制成電轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細胞；
(3)將步驟(1)的得到的DNA片段電轉(zhuǎn)化至以終濃度為2mM間甲基苯甲酸誘導(dǎo)重組酶 表達的步驟(2)的惡臭假單胞菌KT2440電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞中，通過重組酶介導(dǎo)的同源片段 之間的同源重組，卡那霉素抗性基因取代了靶基因而直接獲得了靶基因敲除的突變株。在得到的突變株中，可能會殘余微量的重組酶表達載體pLS512，對此，可通過濃度 為10%的蔗糖負篩選作用去除突變株中殘余的PLS512質(zhì)粒。PLS512中含有編碼蔗糖6-果 糖轉(zhuǎn)移酶的sacB基因，sacB基因為負篩選標(biāo)記，通過在培養(yǎng)基中添加濃度為10%的蔗糖去除含sacB基因的重組酶表達載體。重組酶基因選擇是來自于lambda噬菌體的exo，bet和gam，將這三個基因從lambda噬菌體DNA中擴增后，克隆至常規(guī)的高拷貝大腸桿菌克隆載體pBluescript KS(-)， 待測序正確后，從重組質(zhì)粒上酶切回收，隨后與編碼6-果糖基轉(zhuǎn)移酶的sacB基因一起克隆 至可在惡臭假單胞菌KT2440中呈游離形式存在的、可自主復(fù)制的載體ρJB866之上，最終得 到重組酶表達載體PLS512。pLS512中重組酶基因置于受間甲基苯甲酸誘導(dǎo)的Pm啟動子之 下，這樣保證了重組酶短暫的、嚴謹性的誘導(dǎo)表達，避免了過分表達重組酶而導(dǎo)致的異常重 組的發(fā)生。sacB基因起到負篩選標(biāo)記的作用，在含10%蔗糖培養(yǎng)基的情況下，sacB基因編 碼的6-果糖基轉(zhuǎn)移酶催化蔗糖形成對菌株有毒害的聚蔗糖，因此含有sacB基因表達的菌 株不能生存。如此可有效地去除突變株中殘余的微量PLS512，獲得具有良好遺傳背景的突 變株。優(yōu)選實施例中的敲除惡臭假單胞菌KT2440基因組中的1. Okb, 7. 3kb和9. 3kb三 個實驗充分證明了本發(fā)明方法較常規(guī)所使用的方法的優(yōu)越性即簡便、快捷和可同時進行 多個基因敲除的高通量操作。類似的，可采取與基因敲除同樣的策略實現(xiàn)基因敲入和基因 突變等等研究。


圖1是11910個堿基對的間甲基苯甲酸誘導(dǎo)重組酶表達的質(zhì)粒pLS512的圖譜。其 中
469-598是受間甲基苯甲酸誘導(dǎo)的Pm啟動子序列； 599-1015是編碼抑制內(nèi)源性核酸酶的gam基因的開放閱讀框序列； 1021-1806是編碼DNA單鏈結(jié)合蛋白的bet基因的開放閱讀框序列； 1803-2483是編碼DNA 5’ ->3外切酶的exo基因的開放閱讀框序列； 2491-3912是編碼6-果糖基轉(zhuǎn)移酶的基因的sacB基因的開放閱讀框序列； 4349-4958是雙向終止子區(qū)域；
5009-6157是調(diào)節(jié)基因trfA的開放閱讀框序列，trfA為質(zhì)粒復(fù)制所必須；
6555-7080是質(zhì)粒的復(fù)制子區(qū)域；
7654-8853是四環(huán)素抗性基因tetA的開放閱讀框序列；
8959-9609是調(diào)節(jié)基因tetR的開放閱讀框序列，tetR為tetA表達所必須；
10064-10174 RK2是質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移功能片段
10714-11679是調(diào)節(jié)基因xylS的開放閱讀框序列，xylS為Pm活性所必須； 質(zhì)粒圖上的Xbal，NsiI, EcoRI等為限制性酶切位點，括號內(nèi)的數(shù)字表示限制性酶切位 點在質(zhì)粒上的相對位置。圖2是擴增同源基因和抗性基因的重疊一延伸聚合酶鏈式反應(yīng)(OE-PCR)以及此 片段用于惡臭假單胞菌KT2440基因敲除示意圖?；虮硎敬贸陌谢?；上游和下游表示靶基因上游和下游的同源基因，Pl和 P2為擴增靶基因上游同源基因的引物，P3和P4為擴增卡那霉素抗性基因片段的引物，P5 和P6為擴增靶基因下游同源基因的引物，P2和P3、P4和P5含有重疊的堿基以利于重疊一 延伸PCR反應(yīng)的進行；PCR表示聚合酶鏈式反應(yīng)；重疊區(qū)以含斜線的方框表示；粗線條表示基因組上靶基因兩側(cè)片段。首先以Pl至P6為引物，PCR擴增出上游同源基因、卡那霉素抗 性基因和下游同源基因，隨后以三個片段為模板，Pl和P6為引物以重疊一延伸PCR擴增出 三個片段融合的DNA產(chǎn)物。DNA產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化經(jīng)2mM間甲基苯甲酸誘導(dǎo)重組酶表達的惡臭假 單胞菌KT2440/pLS512的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，在卡那霉素的篩選作用下，經(jīng)過轉(zhuǎn)化的DNA與 惡臭假單胞菌KT2440的基因組上的靶基因兩側(cè)的同源基因發(fā)生同源重組，卡那霉素抗性 基因取代了靶基因，最終獲得靶基因敲除的突變株。圖3是實施例2中PP_3948基因敲除所得突變株的基因型分析的凝膠電泳結(jié)果
1.DL2000 分子量標(biāo)準2. 0，1. 0，0. 75，0. 5，0. 25，0. 1 kb ；
2.以變株的基因組為模板，擴增得到2.2kb片段；
3.以原株的基因組為模板，擴增得到2.25 kb片段；
4.2. 2 kb 以 PstI 酶切得到 0. 9kb 和 1. 3kb ；
5.2. 25 kb 以 PstI 酶切得到 0. 7kb 和 1. 5kb。圖4是實施例3中PP_1384基因敲除所得突變株的基因型分析的凝膠電泳結(jié)果
1.DL2000 分子量標(biāo)準2. 0，1. 0，0. 75，0. 5，0. 25，0. 1 kb ；
2.以變株的基因組為模板，擴增得到2.1kb片段；
3.2. 1 kb 以 PstI 酶切得到 0. 3，0. 6kb 和 1. 2kb ；
4.2. 1 kb 以 NcoI 酶切得到 0. 8kb 和 1. 3kb ；
(注在所使用的PCR條件下，引物從原株KT2440的基因組中不能擴增出產(chǎn)物，故未加 原株的PCR結(jié)果)。圖5是實施例4中PP_2064基因敲除所得突變株的基因型分析的凝膠電泳結(jié)果
1.DL2000 分子量標(biāo)準2. 0，1. 0，0. 75，0. 5，0. 25，0. 1 kb ；
2.以變株的基因組為模板，擴增得到2.1kb片段；
3.2. 1 kb 以 NcoI 酶切得到 0. 9kb 和 1. 2kb ；
4.2. Ikb 以 PstI 酶切得到 0. 8kb 和 1. 3kb ；
(注在所使用的PCR條件下，引物從原株KT2440的基因組中不能擴增出產(chǎn)物，故未加 原株的PCR結(jié)果)。
具體實施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施 例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相 同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實施例中所用到的菌株和質(zhì)粒，均為已公開的 菌株和質(zhì)粒
1. Escherichia coli DH10B?；蛐?F crA D (mrr-hsdMS-mcrBC) f80 d7acZDM15 D7acX74 deoR reckl araD139D (ara, leu) 7697 galM gaVk rpsL end Al nupQ. ο 文獻Life Technologies, Inc. Focus, 1990, 12:19。購自美國 Invitrogen 公司。2. Pseudomonas putida KT2440。文獻Nelson KE, Weinel C, Paulsen IT et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environ Micr obiol 2002, 4:799—808。* 自 _ 國 The Institute for Genomic Research 的 Karen Nelson 博士。3. pBluescript II KS(-) 。tj^ :Alting_Mees MA, Short Jl. pBluescript II: gene mapping vectors. Nucleic Acids Res. 1989，17(22) :9494.購自美國 Novagen 公 司。4. pEXlOOTlink。文獻Quenee L, Lamotte D, Polack B. Combined sacB-based negative selection and cre-lox antibiotic marker recycling for efficient gene deletion in pseudomonas aeruginosa. Biotechniques. 2005, 38 (1) : 63-7.來自法國 Centre Hospitalier Universitaire 的 Benoit Polack 教授。5. pJB866。文獻:Blatny JM, Brautaset Τ, Winther-Larsen HC, et al. Improved broad-host-range RK2 vectors useful for high and low regulated gene expression levels in gram-negative bacteria. Plasmid. 1997, 38 (1) : 35-51.來自 H 威 Norwegian University of Science and Technology 的 Svein Valla 教授。6. pKD4。 文 獻Datsenko ΚΑ, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K—12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA. 2000，97(12) : 6640-5.來自美國 Purdue 大學(xué) Barry Wanner 的教授。7. pGEM-T easy，購自美國 Promega 公司。實施例1.間甲基苯甲酸誘導(dǎo)重組酶表達的質(zhì)粒的構(gòu)建 1.大腸桿菌DHlOB的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備和DNA轉(zhuǎn)化
自平板上接種新鮮劃線培養(yǎng)的單菌落至2ml LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩過夜，以1/50 體積轉(zhuǎn)至50 ml LB,振蕩培養(yǎng)至菌體OD6tltl約為0.6。將菌液倒入預(yù)冷的離心管，冰浴10分 鐘，4°C，5000rpm離心5分鐘，棄上清。以10%的甘油洗滌沉淀兩次，最后懸浮于200ml的 10%甘油中，50ml每管分裝。將溶解于TE緩沖液或雙蒸水的DNA加至50ml冰上融化的DHlOB的電轉(zhuǎn)化感 受態(tài)細胞中，輕彈混勻。將混合液轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的Imm電轉(zhuǎn)杯中，電擊轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件 200 Ω，1800 V，Bio-Rad公司Gene Pulser IIk電轉(zhuǎn)化儀。加Iml LB液體培養(yǎng)基至電轉(zhuǎn)杯， 吹打混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至一個無菌的1. 5ml eppendorf管中，37°C振蕩培養(yǎng)60分鐘后，轉(zhuǎn)化 液涂布在相應(yīng)抗生素的抗性平板上，37°C培養(yǎng)。挑取單菌落，在含相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切和測序鑒定。LB培養(yǎng)基的組成(％):蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，氯化鈉lg，固體培養(yǎng)時加1. 5% (w/v)的瓊脂。115。C 滅菌 20min。TE緩沖液的組成IOmM三羥甲基氨基甲烷的鹽酸鹽，ImM 二胺四乙酸的二鈉鹽，pH 8. O。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)
設(shè)立50ml的PCR反應(yīng)體系，分別加入 37. 7 ml dd H2O ；5 ml IOXPCR反應(yīng)緩沖液；
4 ml 25 mM MgCl2 ；
1 ml 10 mM dNTP ；
0. 5 ml上游引物(終濃度0. 5mM)；
0. 5 ml下游引物(終濃度0. 5mM)；
1 ml模板(質(zhì)粒50ng，基因組DNA 200ng)；
0.3ml Ex-Taq 聚合酶(5U/ml)。PCR反應(yīng)程序為首先在97° C變性處理5分鐘，循環(huán)的條件為97° C 45秒， 60° C 1分鐘，72° C 1-2分鐘(視目的產(chǎn)物大小而定)，共30個循環(huán)。最后在72 ° C延 伸10分鐘。使用儀器為Bio-rad公司的PTC-200型號的PCR儀。反應(yīng)完畢后，以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠中加入20 mg/ml的溴化乙錠的。 PCR產(chǎn)物沉淀回收加1/10體積3M pH 5. 2醋酸鈉及2倍體積冰乙醇，混勻，_80°C冷凍5 min，13200 rpm離心10分鐘，棄上清， 加500 ml 70%乙醇洗滌，13200 rpm離心5分鐘，棄 上清，室溫至干，加適量體積的無菌水溶解。質(zhì)粒構(gòu)建
設(shè)計引物 NRl 5' - GGGGAGCTCCATGGATATTAATACTGAAACTG-3，，(SEQ ID NO. 1) ；NR2 5，-GGGTCTAGAGTCATCGCCATTGCTCCCCAAATAC -3，，(SEQ ID NO. 2)。以 lambda 噬菌體 DNA (購自大連寶生物公司)為模板，PCR擴增出1. 9kb的重組酶基因(gam，exo和bet)片段， 以SacI和XbaI酶切后克隆至pBluescript II KS(-)的SacI和XbaI位點，得到重組克隆 PNcRed0設(shè)計引物SAKl 5' - GGGTCTAGATTATTTGTTAACTGTTAATTGTC-3，，(SEQ ID N0. 3)； SAK2 5' - GGGGGATCCGGCAACTTTATGCCCATGCAAC-3，，(SEQ ID N0. 4)。以 pEXlOOTlink 為 模板，PCR擴增出1. 9kb的sacB基因片段，以XbaI-BamHI酶切后克隆至pBluescript II KS(-)的XbaI和BamHI位點，得到重組克隆pKsacB。NcoI和XbaI酶切pNcRed，分離1. 9kb的重組酶基因片段；XbaI和BamHI酶切 pKsacB，分離1. 9kb的sacB基因片段。兩片段和以AflIII和BamHI酶切并通過堿性磷酸 酯酶去磷酸化的載體PJB866相連。NcoI和AflIII為同尾酶，二者所作用于DNA所產(chǎn)生的 粘性堿基末端相連后，二個的酶切位點均消失。經(jīng)四環(huán)素抗性篩選，提質(zhì)粒酶切驗證，最終 得到間甲基苯甲酸誘導(dǎo)重組酶表達的質(zhì)粒PLS512。pLS512的質(zhì)粒圖譜如說明書附圖中的 圖1所示。實施例2.惡臭假單胞菌KT2440基因組PP_3948基因1. Okb片段的敲除
1.惡臭假單胞菌KT2440電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備和PLS512的轉(zhuǎn)化
從儲存于_70°C的惡臭假單胞菌KT2440凍存管中劃線至LB固體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，挑 取單菌落至2ml EM液體培養(yǎng)基中30°C振蕩過夜，以1/50體積轉(zhuǎn)至50 ml EM培養(yǎng)基，振蕩 培養(yǎng)至菌體0D_約為0. 6。將菌液倒入預(yù)冷的離心管，冰浴10分鐘，4°C，7000rpm離心5分 鐘，棄上清。以冰冷的3 mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，pH=7. 0)液洗滌菌體3次，菌體 濃縮300倍，50ml分裝并用于一次電轉(zhuǎn)化。pLS512的轉(zhuǎn)化將溶解于TE緩沖液的pLS512加至50ml的感受態(tài)細胞，輕彈混 勻。將混合液轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的Imm電轉(zhuǎn)杯中，電擊轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件1. 2 kV，200 Ω，Bio-Rad公司Gene Pulser IIk電轉(zhuǎn)化儀。電轉(zhuǎn)化后，以1 mL SOC培養(yǎng)基懸浮，轉(zhuǎn)至15 ml 聚丙烯離心管，30°C振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)2 h，涂布至含10mg/ml四環(huán)素的LB平板。EM培養(yǎng)基的組成(％):蛋白胨2g，酵母膏5g，氯化鈉5g，葡萄糖5g，pH7. 3，115°C 滅菌20min。

SOC培養(yǎng)基的組成(％)蛋白胨2. Og ；酵母提取物0. 5g ；氯化鈉0. 05g,氯化鉀 0. 019g，pH 7. O。115°C滅菌20min。使用前加入單獨無菌的IM氯化鎂溶液1ml，單獨無菌 的IM硫酸鎂溶液Iml和過濾除菌的20%葡萄糖溶液2ml。誘導(dǎo)重組酶表達的惡臭假單胞菌KT2440/pLS512的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備和 DNA轉(zhuǎn)化
自含10mg/ml四環(huán)素的LB平板上挑取KT2440/pLS512單菌落，接至2ml含10mg/ml四 環(huán)素的EM液體培養(yǎng)基中30°C振蕩過夜，以1/50體積轉(zhuǎn)至相同培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至菌體0D_ 約為0. 2時，加入終濃度為2mM的間甲基苯甲酸，繼續(xù)培養(yǎng)至0D600約為0.6。后續(xù)的操作 與KT2440電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備和DNA的轉(zhuǎn)化的方法相同。3. PP_3948 基因敲除
設(shè)計引物PCR擴增含同源片段的卡那霉素抗性基因。R401 5' -GC CGGCGCCGCCGGCCGCAATATC，(SEQ ID NO. 5 ) ；R4O 2 5‘ -CCGGTTCGCTT GCTGTCCATACAGCGAGGTACGGATGCCAGT，(SEQ ID NO. 6 ) ；R403 5' -CA CTGGCATCCGTACCTCGCTGTATGGACAGCA AGCGMCCGG, (SEQ ID NO. 7);R404 5' -CTGCACCGCACG CGACAGCAGCATCAGAAGAACTCGTCA AGA AG, (SEQ ID NO. 8);R405 5' -CTTCTTGACGAGTTCTTCT GATGCTGCTGTC GCGTGCGGTGCAG, (SEQ ID NO. 9)； R406 5'-GGGCCGGGTATGCGGCTGC CATTG, (SEQ ID NO. 10)。R402與R403有43個堿基對的重疊，R404與R405有44個堿基對的重 疊，均以反向互補的形式呈現(xiàn)。以惡臭假單胞菌KT2440基因組DNA為模板，R401和R402為引物，PCR擴增得到 PP_3948基因上游500bp的DNA片段；R405和R406為引物，PCR擴增得到PP_3948基因下 游500bp的DNA片段。以含卡那霉素抗性基因的pKD4質(zhì)粒為模板，R403和R404為引物， PCR擴增得到0. 9kb的卡那霉素抗性基因片段。分別凝膠回收這三個片段，各20ng的三個 片段為模板，R401和R406為引物，通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應(yīng)(OE-PCR)擴增得到三個 片段融合的1.9kb的DNA片段。轉(zhuǎn)化2mg的1. 9kb的DNA片段，在卡那霉素抗性篩選之下，得到抗性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)三 次實驗，平均可獲得210個轉(zhuǎn)化子。在沒有加間甲基苯甲酸進行誘導(dǎo)的對照實驗中，沒有或 僅有一兩個抗性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)，這表明間甲基苯甲酸誘導(dǎo)表達的重組酶所催化的同源重組 是得到重組菌株的決定因素。設(shè)計引物以菌落PCR的方法來驗證卡那霉素抗性敲入至基因組所得 變株的基因型。R407 5' -GGCCCCAAGTACGGCTGCGGC, (SEQ ID N0. 11) ；R408 5，-CCACGCGGGTACGCCACTTC, (SEQ ID N0. 12。R407 位于 R401 上游 lOObp，R408 位于 R406 下游200p。隨機挑取10個抗性菌落，以其基因組為模板，R407和R408為引物，PCR擴增 發(fā)現(xiàn)所用的菌落均得到2. 2 kb的擴增片段，而以原株的基因組為模板擴增得到2. 25 kb片 段。2.2吐和2.25 kb兩個片段的酶切結(jié)果與預(yù)期完全一致。擴增同源片段和抗性基因的重疊一延伸聚合酶鏈式反應(yīng)(OE-PCR)以及此片段用于惡臭假單胞菌KT2440基 因敲除示意圖見圖2。PP_3948基因敲除的實驗結(jié)果圖見圖3。隨機挑取兩個變株的擴增產(chǎn)物，克隆至pGEM-T easy后，測序發(fā)現(xiàn)序列與預(yù)期完全 一致。證明惡臭假單胞菌KT2440基因組中PP_3948基因中1. Okb的片段被敲除。從重組菌株中的消除
PLS512中sacB基因編碼6-果糖基轉(zhuǎn)移酶，此酶催化蔗糖為對假單胞菌有毒害作用的 果聚糖，含有PLS512的菌株不能在含有蔗糖的培養(yǎng)基上生長，因此在蔗糖的負篩選作用下 可得到PLS512消除的菌株。將含有pLS512的重組菌株劃線于含10%蔗糖的LB固體平板上，30°C培養(yǎng)過夜，挑 取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以1χ10_6稀釋后涂布LB固體平板，隨機挑 取30個單菌落至無抗LB平板和含四環(huán)素的抗性LB平板，過夜培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)所有的菌落均只能 在無抗LB平板上生長，而不能在含四環(huán)素抗性的LB平板上生長，這些四環(huán)素敏感性菌株即 為PLS512消除的菌株。實施例3.惡臭假單胞菌KT2440基因組PP_1384至PP_1388 7. 3kb片段的敲除 誘導(dǎo)重組酶表達的惡臭假單胞菌KT2440/pLS512的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備和DNA轉(zhuǎn)
化同實施例2。設(shè)計引物PCR擴增含同源片段的卡那霉素抗性基因。KSDl 5'-GTCGACGA AGTTGCGGTTGATG, (SEQ ID NO. 13) ；KSD2 5' -CCGGTTCGCTTGCTGTC CATATGATCGGCCTTGTTGCMAAGC, (SEQ ID NO. 14)； KSD3 5' -GCTTTT GCAACAAGGCCGATCATATG GACAGCAAGCGAACCGG,(SEQ ID NO. 15);KSD4 5' - GAC AAAACAAGGTATTCCCGTGTCAGAAGAACTCG TCAAGAA G,(SEQ ID NO. 16);KSD5 5' -CTTCTTGACGAGTTCTTCTGACACGGGMTA CCTTGTTTTGTC, (SEQ ID NO. 17)； KSD6 5'-GCGTGCCGACATTGGGTCG AAC，(SEQ ID NO. 18)。KSD2 與 KSD3之 間以及KSD4與KSD5之間均有43個堿基對的重疊，且均以反向互補的形式呈現(xiàn)。以惡臭假單胞菌KT2440基因組DNA為模板，KSDl和KSD2為引物，PCR擴增得到 PP_1384基因上游500bp的DNA片段；KSD5和KSD6為引物，PCR擴增得PP_1388基因下游 500bp的DNA片段。以含卡那霉素抗性基因的pKD4質(zhì)粒為模板，KSD3和KSD4為引物，PCR 擴增得到0. 9kb的卡那霉素抗性基因片段。分別凝膠回收這三個片段，以分別為20ng的這 三個片段為模板，KSDl和KSD6為引物，通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應(yīng)(OE-PCR)擴增得到 三個片段融合的1. 9kb的DNA片段。轉(zhuǎn)化2mg的DNA片段，在卡那霉素抗性篩選之下，得到抗性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)三次實驗， 平均可獲得156個轉(zhuǎn)化子。在沒有加間甲基苯甲酸進行誘導(dǎo)的對照實驗中，沒有或僅有一 兩個抗性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)，與實施例2相同，這表明了間甲基苯甲酸誘導(dǎo)表達的重組酶所催 化的同源重組是得到重組菌株的決定因素。設(shè)計引物以菌落PCR的方法來驗證卡那霉素 抗性敲入至基因組所得變株的基因型。KSD7:5'- TGAAACCGGAACGGGCATCGAG, (SEQ ID NO. 19);KSD8 5' - AGGGTGATCAGAGCGAAGTCC, (SEQ ID NO. 20)。KSD7 位于 KSDl 上游 lOObp， KSD8 位于 KSD6 下游 100bp。隨機挑取10個抗性菌落，以其基因組為模板，KSD7和KSD8為引物，PCR擴增發(fā)現(xiàn) 所用的菌落均得到2.1 kb的擴增片段，而以原株的基因組為模板不能擴增出產(chǎn)物。2.1 kb 酶切結(jié)果與預(yù)期完全一致。PP_1384至PP_1388之間7. 3kb片段敲除的實驗結(jié)果圖見圖4。隨機挑取兩個變株的擴增產(chǎn)物，克隆至pGEM-T easy后，測序發(fā)現(xiàn)序列與預(yù)期完全一致。證明惡臭假單胞菌KT2440基因組中PP_1384至PP_1388之間的7. 3kb片段被完全 的敲除。pLS512從重組菌株中的消除同實施例2。實施例4.惡臭假單胞菌KT2440基因組PP_2064至PP_2069 9. 3kb片段的敲除 誘導(dǎo)重組酶表達的惡臭假單胞菌KT2440/pLS512的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備和DNA轉(zhuǎn)
化同實施例2。 設(shè)計引物PCR擴增含同源片段的卡那霉素抗性基因。KAEl 5'-TGTGTCTG CGCTTATGAATCG, (SEQ ID NO. 21) ；KAE2 5'-CCGGTTCGCTTGCTGTCC ATACATGCACAGCTCCGATCACAGG, (SEQ ID NO. 22) ；KAE3 5' - CCTGT GATCGGAGCTGTGCATG TATGGACAGCAAGCGAACCGG,(SEQ ID NO. 23) ；KAE4 5' - CGACCTTTGAGCGACAATCGTGTCAGAA GAACTCGTCAAG AAG，(SEQ ID NO. 24) ；KAE5 5' - CTTCTTGACGAGTTCTTCTGACACGATTGTCG CTCAAAGGTCG, (SEQ ID NO. 25) ；KAE6 5' -TGATCCTGTACGAACTCGCC G, (SEQ ID N0. 26)。 KAE2與KSD3之間以及KAE 4與KAE 5之間均有43個堿基對的重疊，且均以反向互補的形 式呈現(xiàn)。以惡臭假單胞菌KT2440基因組DNA為模板，KAEl和KAE2為引物，PCR擴增得到 PP_1384基因上游500bp的DNA片段；KAE5和KAE 6為引物，PCR擴增得PP_1388基因下游 500bp的DNA片段。以含卡那霉素抗性基因的pKD4質(zhì)粒為模板，KAE3和KAE4為引物，PCR 擴增得到0. 9kb的卡那霉素抗性基因。分別凝膠回收這三個片段，以分別為20ng的這三個 片段為模板，KAEl和KAE6為引物，通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應(yīng)(OE-PCR)擴增得到三 個片段融合的1. 9kb的DNA片段。轉(zhuǎn)化2mg的DNA片段，在卡那霉素抗性篩選之下，得到抗性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)三次實驗， 平均可獲得92個轉(zhuǎn)化子。在沒有加間甲基苯甲酸進行誘導(dǎo)的對照實驗中，沒有或僅有一兩 個抗性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)，與實施例2和實施例3相同，這表明了間甲基苯甲酸誘導(dǎo)表達的重組 酶所催化的同源重組是得到重組菌株的決定因素。設(shè)計引物以菌落PCR的方法來驗證卡那霉素抗性敲入至基因組所得 變株的基因型。KAE7 :5，-GATTGGGTCGTTCAGGCAGTAG，(SEQ ID N0. 27) ；KAE8 5' -TGCTGCGCGAACTGATCCTGG, (SEQ ID N0. 28)。KAE7 位于 KAE 1 上游 lOObp，KAE8 位于 KAE 6 下游 100bp。隨機挑取10個抗性菌落，以其基因組為模板，KAE 7和KAE 8為引物，PCR擴增發(fā) 現(xiàn)所用的菌落均得到2.1 kb的擴增片段，而以原株的基因組為模板不能擴增出產(chǎn)物。2.1 kb酶切結(jié)果與預(yù)期完全一致。PP_2064至PP_2069之間的9. 3kb片段敲除的實驗結(jié)果圖見 圖4。隨機挑取兩個變株的擴增產(chǎn)物，克隆至pGEM-T easy后，測序發(fā)現(xiàn)序列與預(yù)期完全 一致。證明惡臭假單胞菌KT2440基因組中PP_2064至PP_2069之間的9. 3kb片段被完全 的敲除。pLS512從重組菌株中的消除同實施例2。
權(quán)利要求
1.一種惡臭假單胞菌KTM40高效的基因敲除方法，其特征在于，包括以下步驟(1)通過重疊一延伸聚合酶鏈式反應(yīng)的手段擴增而獲得左右兩側(cè)分別為待敲除的靶基 因上下游各500個堿基對的同源基因、中間為卡那霉素抗性基因的DNA片段；(2 )將含重組酶基因的質(zhì)粒pLS512轉(zhuǎn)化至惡臭假單胞菌KTM40中，制成電轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細胞；(3)將步驟(1)的得到的DNA片段電轉(zhuǎn)化至以終濃度為2mM間甲基苯甲酸誘導(dǎo)重組酶 表達的步驟(2)的惡臭假單胞菌KTM40電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞中，通過重組酶介導(dǎo)的同源片段 之間的同源重組，卡那霉素抗性基因取代了靶基因而直接獲得了靶基因敲除的突變株。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將步驟(3)得到的靶基因敲除的突變株通過 濃度為10%的蔗糖負篩選作用去除突變株中殘余的質(zhì)粒PLS512。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，重組酶基因是來自于lambda噬菌體的exo， bet和gam基因，重組酶基因是克隆在受間甲基苯甲酸誘導(dǎo)的啟動子之下，含重組酶基因的 質(zhì)粒pLS512游離于惡臭假單胞菌KTM40的基因組。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，重組酶表達載體中含有編碼蔗糖6-果糖轉(zhuǎn) 移酶的sacB基因，sacB基因為負篩選標(biāo)記，通過在培養(yǎng)基中添加濃度為10%的蔗糖去除含 sacB基因的重組酶表達載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過重組工程手段對惡臭假單胞菌KT2440進行基因敲除的方法。具體方法是首先通過重疊－延伸聚合酶鏈式反應(yīng)的手段擴增而獲得左右兩側(cè)分別為待敲除的靶基因上下游各約500個堿基對的同源基因，中間為卡那霉素抗性基因的DNA片段。再將此DNA片段電轉(zhuǎn)化至以終濃度為2mM間甲基苯甲酸誘導(dǎo)重組酶表達的惡臭假單胞菌KT2440電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞中，通過重組酶介導(dǎo)的同源片段之間的同源重組，卡那霉素抗性基因取代了靶基因而直接獲得了靶基因敲除的突變株。本發(fā)明所述方法簡便快捷，可成為在生物降解有機化合物等方面有著重要應(yīng)用價值的環(huán)境微生物惡臭假單胞菌KT2440的遺傳操作手段。
文檔編號C12N15/54GK102071185SQ20101057520
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
發(fā)明者宋杰, 尚廣東, 楊運文, 高九彩 申請人:南京師范大學(xué)