專利名稱：一種聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，利用該聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌可以去除生活污水中的磷。
背景技術(shù)：
無機(jī)磷酸鹽通常被認(rèn)為是湖泊富營養(yǎng)化的關(guān)鍵因子。因而，降低水環(huán)境中磷的濃度是控制富營養(yǎng)化的重要手段之一。環(huán)境中磷的去除有物理、化學(xué)以及生物法。生物尤其是微生物，去除磷的機(jī)理在于包括Escherichia coli, Pseudomonas spp.等細(xì)菌均具有積累無機(jī)磷酸鹽,生成多聚磷酸鹽(poly-phosphate)的能力。但是，在天然條件下，微生物聚磷能力通常比較弱，或者需要厭氧好氧交替環(huán)境才能有效聚磷。多聚磷酸鹽由聚磷激酶(Poly-phosphate Kinase,PPK)催化形成。是由3 1000 多個(gè)不等的正磷酸鹽通過高能磷酸鍵連接而成的線性多聚體。聚磷通常被認(rèn)為是能量?jī)?chǔ)存的一種手段，同時(shí)具有多種生理功能。有學(xué)者通過轉(zhuǎn)基因手段，將聚磷酸激酶基因PPk轉(zhuǎn)化到各種質(zhì)粒中，過量表達(dá)聚磷激酶。攜帶重組有PPk基因質(zhì)粒的微生物或植物能夠過量的吸收環(huán)境中磷酸鹽形成大量聚磷。從而用于廢水中磷的去除或者利用聚磷的絡(luò)合能力降低環(huán)境中重金屬毒性，增加重金屬的生物有效性，增加植物對(duì)重金屬的耐受性，提高植物對(duì)重金屬的去除能力等。通過重組質(zhì)粒表達(dá)PPk基因，雖然能夠過量的表達(dá)聚磷激酶，但是，質(zhì)粒表達(dá)的缺點(diǎn)同樣明顯，重組質(zhì)粒容易丟失。只有在抗生素脅迫下才能夠相對(duì)穩(wěn)定存在，由此引發(fā)實(shí)際應(yīng)用成本的增加。并且高拷貝質(zhì)粒對(duì)菌的生命活動(dòng)造成負(fù)擔(dān)。因而質(zhì)粒作為載體表達(dá)PPk基因有很大的局限。另外，當(dāng)前用于廢水中去除磷的研究中所用表達(dá)宿主全部為E. coli。E. coli直接用于廢水或自然水體磷的去除是不切實(shí)際的。雖然整合表達(dá)一定程度上解決了質(zhì)粒表達(dá)的遺傳不穩(wěn)定的問題，同時(shí)選擇環(huán)境中以及廢水處理的活性污泥中的優(yōu)勢(shì)種惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)作為宿主，可以用于實(shí)際的廢水處理。但是由于整合表達(dá)會(huì)在一定程度上導(dǎo)致基因拷貝數(shù)較低，進(jìn)而影響基因的表達(dá)、 翻譯。因此，對(duì)于基因工程菌的聚磷能力有較大的影響。為了克服該問題，將PPk基因進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)。在一定程度上提高了 PPk基因在基因工程菌中的拷貝數(shù)。提高了極影工程菌的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有較高遺傳穩(wěn)定性的聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌，能夠高效去除廢水中的磷。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌在廢水除磷中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌，它是DNA整合串聯(lián)表達(dá)聚磷激酶PPk基因的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。上述聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌的構(gòu)建方法，它包括ppk基因的獲取、載體的構(gòu)建、三親接合三大步驟，具體步驟如下(l)ppk基因的犾取(Ia)提取E. coii DH5 α總DNA，具體方法參見《環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(北京中國環(huán)境科學(xué)出版社，2004. 71-72)。(Ib)根據(jù)大腸桿菌的基因序列(Genbank登錄號(hào)L03719)設(shè)計(jì)引物，①并在引物上游引物5’端加入EcoR V和Sph I，下游引物5’端加入Sal I ;②上游引物5’端加入Sal I，下游引物5’端加入Xbal I ;③上游引物5’端加入Xbal I，下游引物5’端加入Small ； ④上游引物5’端加入Smal I，下游引物5’端添加EcoR V酶切位點(diǎn)，以總DNA為模板，分別 PCR擴(kuò)增上述ppk基因片段。(Ic)將(Ib)中擴(kuò)增的4種DNA片段，分別用對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切或者單酶切。(Id)用T4 DNA連接酶將(Ic)中的酶切產(chǎn)物連接。得到4段ppk基因首尾相連的 DNA片段。(2)載體的構(gòu)建(2a)將步驟(Id)得到的PCR產(chǎn)物插入到質(zhì)粒pBBRlMCS_2中，獲得重組質(zhì)粒 pBBRlMCS-2-4ppk ;具體為將質(zhì)粒pBBRlMCS-2以及步驟(Id)得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR V酶切，質(zhì)粒pBBRlMCS-2進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)磷酸化反應(yīng)，在5’端加磷，然后將上述處理的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒酶連反應(yīng)過夜，即獲得重組質(zhì)粒pBBRlMCS-2-4ppk。(2b)將步驟(2a)得到的重組質(zhì)粒pBBRlMCS-2_4ppk轉(zhuǎn)化E. coii DH5 α進(jìn)行復(fù)制。(2c)提取重組質(zhì)粒pBBRlMCS-2_4ppk，作為模板，設(shè)計(jì)含有NoT I酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增含有多克隆位點(diǎn)上游多重啟動(dòng)子序列和多克隆位點(diǎn)下游終止子序列的片段。(2d)將步驟(2c)得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)Not I酶切后插入到自殺質(zhì)粒pUTmini_Tn5 中，得到重組質(zhì)粒pUTmini-Tn5_4ppk。(3)三親接合(3a)將步驟(2d)得到的重組質(zhì)粒pUTmini-Tn5_4ppk經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化到供體菌E. coli SMlO(Apir)(電擊轉(zhuǎn)化及感受態(tài)細(xì)胞的制備參見《分子克隆指南》3汔北京科學(xué)出版社· 2002.)。(3b)將受體菌Pseudomonas putida KT2440、步驟(3a)得到的含重組質(zhì)粒的供體菌 e. coli SMlO (Apir)/pUTmini-Tn5-4ppk和輔助菌E. coli DH5 a (pRK600)，分別在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；在受體菌培養(yǎng)基中加入終濃度為25μ g/mL的氯霉素，在供體菌培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的氯霉素,在輔助菌培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的氯霉素。受體菌在42°C下孵育15min使其限制性系統(tǒng)失活。
(3c)將步驟(3b)培養(yǎng)后的受體菌、供體菌和輔助菌按照1:2:2的體積比三親接合，獲得聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌KT4PPK。具體為受體菌、供體菌和輔助菌按照 1:2: 2的體積比混合，6000r/min下離心5min收集菌體,用鹽水重懸菌體,洗去其中的抗生素，重復(fù)兩遍；然后用LB培養(yǎng)液重懸，涂平板，28°C下培養(yǎng)過夜；再挑取菌體用LB培養(yǎng)液重懸，稀釋不同梯度濃度涂在含有LB選擇培養(yǎng)基的平板上(分別加入25 μ g/mL的Chl 和 5 μ g/mL 的 Kan)。上述聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌在廢水除磷中的應(yīng)用。有益效果盡管 Jones [Jones K L, Kim S ff,Keasling J D. Low-copy plasmids can perform as well as or better than high-copy plasmids for metabolic enginnering of bacteria[J]. Metabolic Engineering, 2000, 2 ;328_338.]等通過將 ppk 基因分別連入到低拷貝和高拷貝的質(zhì)粒中，表明低拷貝質(zhì)?？梢詼p輕菌株生長的負(fù)擔(dān)；并通過采用強(qiáng)啟動(dòng)子提高基因表達(dá)；低拷貝質(zhì)粒也表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性和維持DNA大片段的能力。但是，質(zhì)粒無疑具有丟失的可能性，尤其是重組質(zhì)粒增加了遺傳的不穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-ppk盡管能夠比較穩(wěn)定的維持3 4代，但是，隨著微生物的不斷繁殖，重組質(zhì)粒確實(shí)出現(xiàn)了丟失的情況。而DNA整合表達(dá)很大程度上提高了遺傳穩(wěn)定性。同時(shí)不存在由于質(zhì)?？截悢?shù)高而影響微生物生長繁殖的情況。另外，本發(fā)明選用Pseudomonas putida 作為PPk基因的宿主菌，該菌是廢水中常見的菌種，甚至可以形成優(yōu)勢(shì)種，且該菌本身能夠用于環(huán)境污染物的處理，因而能夠應(yīng)用于實(shí)際污水除磷工藝中。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒 pET28a(+)-ppk需要IPTG誘導(dǎo)才能表達(dá)。而KT4PPK不需要經(jīng)過誘導(dǎo)，因而節(jié)省成本同時(shí)可以簡(jiǎn)化污水處理工藝。此外，在4h以后，KT4PPK菌的生長量大于KT2440，是因?yàn)榕囵B(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)因?yàn)榫甑纳L被消耗影響了菌株的生長速度；另一方面，在外源性營養(yǎng)物下降時(shí)，聚磷能促進(jìn)E. coli的生長在培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)減少的情況下，KT4PPK利用自身合成的聚磷提供磷源和能量繼續(xù)生長。KT4PPK過量合成聚磷，不但可以有效地去除水體中的磷，還可以在菌株生長的穩(wěn)定期促進(jìn)菌株的生長，這對(duì)于提高生物除磷的效率具有重要意義。合成廢水實(shí)驗(yàn)表明KT4PPK菌不需要經(jīng)過常規(guī)的除磷工藝中的厭氧過程，就能夠大量合成聚磷。這將大大降低處理成本和控制難度。本試驗(yàn)獲得的可以有效地去除水體中磷的KT4PPK轉(zhuǎn)基因菌可應(yīng)用于廢水的生物除磷。


圖IRT-PCR分析KT4PPK中ppk基因表達(dá)情況。圖2KT4PPK細(xì)胞中聚磷含量隨時(shí)間變化。圖3模擬污水中磷酸鹽含量隨時(shí)間變化過程。圖4KT4PPK及KT2440在合成廢水中的生長曲線。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
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實(shí)施例I :ppk基因的犾取。提取E. coli DH5 α總DNA，具體方法參見《環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(北京中國環(huán)境科學(xué)出版社，2004. 71-72)。以Ε. coli DH5a基因組為模板，依據(jù)ppk基因DNA序列 (Genebank登錄號(hào)L03719)設(shè)計(jì)引物(并分別在下面的引物的上游下游引物的5’端添加對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶)，PCR擴(kuò)增ppk基因用于轉(zhuǎn)基因操作。正向引物5'-ATG CAG ATG GGT CA GGA AAA GCT ATA CAT-3'；反向引物5'-GGT ACC CAG GTT GTT CGA GTG ATT TGA-3'。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，60°C退火45s，72 °C下延伸 2min，循環(huán)數(shù)為30。PCR所用酶是購自 TAKARA(JAPAN)的 PrimeSTAR HS DNA polymerase。擴(kuò)增出大約2kb的片段。PCR所用酶是高保真酶，且產(chǎn)物是平滑末端。實(shí)施例2 :載體的構(gòu)建。將實(shí)施例I得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)磷酸化反應(yīng)，在5 '端加磷。質(zhì)粒 pBBRlMCS-2 [Kovach, Μ. , P. Elzer, et al. (1995). " Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. " Gene 166(1) 175-176.]經(jīng) EcoR V 酶切后進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)，從而避免自連。將上述處理的PCR產(chǎn)物(ppk)和質(zhì)粒pBRlMCS-2酶連反應(yīng)過夜。挑去單克隆進(jìn)行測(cè)序。得到正向插入的重組質(zhì)粒pBRlMCS-2-4ppk。經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主E. coli DH5a進(jìn)行復(fù)制。提取重組質(zhì)粒pBBRlMCS-2_4ppk，作為模板，設(shè)計(jì)含有Not I 酶切位點(diǎn)的引物。正向引物5'-GCG GCC GCC GTT GCG TCG CGG TGCA-3' (Not I)；反向引物5'-GCG GCC GCT GAG CGG GAC TGT GGG GTT-3' (Not I)。PCR反應(yīng)程序95 V預(yù)變性5min ；94 V變性30s，60 °C退火45s，72 °C下延伸
2.5min。循環(huán)數(shù)為30。PCR擴(kuò)增含有多克隆位點(diǎn)上游多重啟動(dòng)子序列和多克隆位點(diǎn)下游終止子序列的片段。經(jīng)Not I酶切后連入自殺質(zhì)粒pUTmini_Tn5,得到重組質(zhì)粒pUTmini-Tn5_4ppk。通過PCR擴(kuò)增ppk基因，DNA測(cè)序表明，PCR所得片段含有完整的ppk基因完整的閱讀框。且序列與E. coli的ppk基因序列相同。由于ppk基因含有質(zhì)粒pBBRlMCS-2多克隆位點(diǎn)上酶切位點(diǎn)。只能采取單酶切的方法將PPk基因連入pBBRlMCS-2。對(duì)ppk基因進(jìn)行磷酸化，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化。然后進(jìn)行連接，有效避免質(zhì)粒的自連，提高重組質(zhì)粒的產(chǎn)量。 通過電擊轉(zhuǎn)化成功將重組質(zhì)粒pBBRlMCS-2-4ppk轉(zhuǎn)化到DH5a中。挑取單克隆測(cè)序表明PCR 產(chǎn)物成功插入到質(zhì)粒pBBRlMCS-2的EcoR V位點(diǎn)。通過PCR從pBBRlMCS-2_4ppk中擴(kuò)增出含有載體強(qiáng)啟動(dòng)子和終止子的PPk基因序列，將其插入pUTmini-Tn5的Not I酶切位點(diǎn)。挑取單克隆測(cè)序表明ppk基因成功插入到mini-Tn5轉(zhuǎn)座子中到重組質(zhì)粒pUTmini-Tn5_4ppk。 然后經(jīng)三親接合轉(zhuǎn)化到Pseudomonas putida KT2440中并整合到Pseudomonas putida KT2440的DNA上。ppk基因受到來自質(zhì)粒pBRlMCS_2上強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控能夠在Pseudomonas putida KT2440中過量表達(dá)并且ppk基因且具有更高的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)施例3 :三親接合。重組質(zhì)粒pUTmini-Tn5_ppk經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化到供體菌E. coli SMlO(Apir)(電擊轉(zhuǎn)化及感受態(tài)細(xì)胞的制備參見《分子克隆指南》3汔北京科學(xué)出版社.2002.)。受體菌(Pseudomonas putida KT2440)、含有相應(yīng)質(zhì)粒的供體菌[E. coli SMlO ( λ pir) /pUTmini-Tn5-ppk]和輔助菌 E. coli DH5 a (pRK600)分別在 LB 培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。并在KT2440培養(yǎng)基中加入氯霉素(終濃度為25 μ g/mL)，在供體菌和輔助菌的培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的氯霉素。受體菌在42°C下孵育 15min使其限制性系統(tǒng)失活。然后在ImL的受體菌中加入2mL的供體菌和2mL的輔助菌并混合。6000r/min下離心5min收集菌體。用ImL的鹽水重懸菌體，洗去其中的抗生素，重復(fù)兩遍。然后用IOOyL的LB培養(yǎng)液重懸，涂平板。28°C下培養(yǎng)過夜。挑取菌體用ImL的LB 培養(yǎng)液重懸，稀釋不同梯度濃度涂在含有LB選擇培養(yǎng)基的平板上(分別加入25 μ g/mL的氯霉素和5 μ g/mL的卡那霉素)，得到聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌KT4PPK。實(shí)施例4 :轉(zhuǎn)基因菌株中ppk基因的檢測(cè)。將實(shí)施例3得到的KT4PPK以及KT2440接種到人工合成生活污水中，培養(yǎng)不同時(shí)間，用TRIzoI試劑(Invitrogen，美國，含3g/L的溶菌酶)提取細(xì)菌總RNA?？俁NA的逆轉(zhuǎn)錄所使用的逆轉(zhuǎn)錄酶酶為Superscript II RNase H-reverse (Invitrogen,美國)，引物為 5' -TGG ATC CTT ATT CAG GTT GTT CGA GTG ATT TG-3/ 以轉(zhuǎn)基因菌株的總 RNA 為模板。檢測(cè)PPk基因的表達(dá)時(shí)，采用5' -GGA CAA ATC TAA CCC GCT GAS1 (正向引物)和 5' -ACG ATC AAC CTG GCC TTT AT-3'(反向引物)，PCR 擴(kuò)增出 ppk 基因的 cDNA 片段， PCR條件為94°C預(yù)變性Imin，然后在94°C下變性30s，55°C退火30s，72°C延伸Imin，循環(huán)數(shù)為20。以工程菌KT4PPK以及原始菌的總RNA為模板，RT-PCR結(jié)果表明工程菌中ppk基因表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原始菌株，尤其在低循環(huán)數(shù)拷貝下原始菌株P(guān)Pk基因的表達(dá)幾乎不可檢測(cè)。 PPk基因受到強(qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控，可以避免厭氧過程。將KT4PPK接種到人工合成生活污水中，其不同時(shí)間PPk基因轉(zhuǎn)錄水平見圖I。實(shí)驗(yàn)表明，隨著時(shí)間的增加，PPk基因的轉(zhuǎn)錄水平得到
顯著提高。實(shí)施例5 :聚磷能力分析。將原始菌株和轉(zhuǎn)基因菌株接種到一定量的人工合成生活污水中，在250mL的三角燒瓶中，37°C、150r/min連續(xù)培養(yǎng)。然后在不同時(shí)間間隔測(cè)定細(xì)胞中聚磷的含量。細(xì)胞中聚磷用鑰藍(lán)比色法測(cè)定。從菌體中提取聚磷及前處理過程如下I)取40mL菌液6000r/min下離心15min,吸出上清液到干凈試管中備用；2)向沉淀中加入ImL 5. 4%堿性高氯酸,30°C恒溫培養(yǎng)90min,然后13000r/min離心20min，得沉淀物；3)用 ImL. 5moL/l NaCl+5mmol/L EDTA 溶液洗 13000r/min 離心 15min,重復(fù)操作 I次；4)加入0. 5mL蒸懼水抽提,6000r/min離心15min,重復(fù)操作I次；5)取上清液,加入3mL無水乙醇，12000r/min離心30min,棄上清液；6)將沉淀物烘干后加入2mL蒸餾水溶解，取出ImL作空白樣，另ImL作為測(cè)試樣品，加入ImL 2mol/L HC1，100°C水浴加熱15min，取出后調(diào)pH值至中性；7)將樣品和空白樣在700nm處用鑰藍(lán)比色法測(cè)定。培養(yǎng)液中磷酸鹽含量的測(cè)定直接在在700nm處用鑰藍(lán)比色法測(cè)定。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。聚磷和溶解性磷酸鹽的含量以平均值土方差表示。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。由圖2表明，原始菌株中的聚磷含量在O-IOh內(nèi)沒有較大變化，且有輕微的降低。 工程菌中的聚磷含量則明顯增加。在Ih時(shí)達(dá)到最大。聚磷最大含量是3. 053mg/g。隨后， KT4PPK含有的聚磷逐漸減少。起始時(shí)兩株菌聚磷含量沒有明顯差別(P > O. 05)。O. 5h之后，KT4PPK中的聚磷含量增加很快，明顯比KT2440含聚磷的量要高的多(P < O. 01)。圖3表明模擬污水中磷酸鹽含量隨時(shí)間變化過程，由圖可知，原始菌株培養(yǎng)液中的磷含量輕微下降。而工程菌培養(yǎng)液中磷酸鹽濃度則明顯下降。從Oh 10h，KT4PPK菌株培養(yǎng)液中的磷酸鹽含量下降了 90%以上。圖4為KT4PPK及KT2440在合成廢水中的生長曲線。由圖4可見，O 7h，KT2440 和KT4PPK的生長均處于增長期，7h以后基本處于穩(wěn)定期。兩菌株的D6tltl值均無顯著性差異 (P > O. 05)。而7 IOh時(shí)，KT4PPK比KT2440生長要快(p < O. 05)。該結(jié)果表明聚磷對(duì)于基因工程菌的生長沒有造成負(fù)擔(dān)，相反在穩(wěn)定期，對(duì)于菌株的生長具有促進(jìn)作用。
權(quán)利要求
1.一種聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌，其特征在于它是DNA整合串聯(lián)表達(dá)聚磷激酶 ppk基因的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。
2.權(quán)利要求I所述的聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于它包括如下步驟(1)ppk基因的獲取(Ia)提取 E. coli DH5 α 總 DNA ；(Ib)根據(jù)大腸桿菌的基因序列設(shè)計(jì)含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物，以總DNA為模板， PCR擴(kuò)增ppk基因，使目的片段的兩端含有相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；(Ic)將擴(kuò)增片段依次用不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切；(Id)用Τ4 DNA連接酶將上述雙酶切的產(chǎn)物連接。得到4段ppk基因首尾相連的DNA 片段；(2)載體的構(gòu)建(2a)將步驟(Id)得到的酶連產(chǎn)物連入質(zhì)粒pBBRlMCS-2中，獲得重組質(zhì)粒 pBBRlMCS-2-4ppk ；(2b)將步驟(2a)得到的重組質(zhì)粒pBBRlMCS-2-4ppk轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α進(jìn)行復(fù)制；(2c)提取重組質(zhì)粒pBBRlMCS-2-4ppk，作為模板，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增含有多克隆位點(diǎn)上游多重啟動(dòng)子序列和多克隆位點(diǎn)下游終止子序列的片段；(2d)將步驟(2c)得到的PCR產(chǎn)物插入到自殺質(zhì)粒pUTmini-Tn5中，得到重組質(zhì)粒 pUTmini-Tn5_4ppk ；(3)三親接合(3a)將步驟(2d)得到的重組質(zhì)粒pUTmini-Tn5_4ppk經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化到供體菌E. coli SMlO(Apir)；(3b)將受體菌Pseudomonas putida KT2440、步驟(3a)得到的含重組質(zhì)粒的供體菌 E.coli SMlO Upir)/pUTmini-Tn5-ppk、輔助菌 Ε· coli DH5 a (pRK600)，分別在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，在受體菌培養(yǎng)基中加入終濃度為25μ g/mL的氯霉素，在供體菌培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的氯霉素,在輔助菌培養(yǎng)基中加入終濃度為 10 μ g/mL的卡那霉素和25 μ g/mL的氯霉素；(3c)將步驟(3b)培養(yǎng)后的受體菌、供體菌和輔助菌按照1:2:2的體積比三親接合，獲得聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌KT4PPK。
3.權(quán)利要求I所述的聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌在廢水除磷中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌，它是DNA整合串聯(lián)表達(dá)聚磷激酶ppk基因的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。本發(fā)明還公開了上述聚磷轉(zhuǎn)基因惡臭假單胞工程菌的構(gòu)建方法及其在廢水除磷中的應(yīng)用。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，所得基因工程菌具有高效去磷能力。
文檔編號(hào)C02F101/10GK102586163SQ20121003334
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月15日
發(fā)明者劉露, 杜宏偉, 楊柳燕, 武俊, 肖 琳 申請(qǐng)人:南京大學(xué)