技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及借助alkL基因產(chǎn)物氧化有機化合物的生物催化方法以及在該方法中使用的微生物。
背景技術(shù)：
：例如惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida）的OCT質(zhì)粒含有alkL基因。此外，該質(zhì)粒編碼負責烷烴降解的基因產(chǎn)物。這些烷烴降解基因排列在該假單胞菌OCT質(zhì)粒上的2個alk操縱子中；第一個alk操縱子編碼基因產(chǎn)物AlkB、AlkF、AlkG、AlkH、AlkJ、AlkK和AlkL，第二個alk操縱子編碼AlkS和AlkT，其中AlkS對第一個alk操縱子的表達行使調(diào)節(jié)功能。關(guān)于該alk操縱子的詳細的綜述和其它基因的功能，參見Chen等人,JBacteriol.1995十二月,177(23):6894-901。另外，由EP277674已知一種借助于對非極性相有抗性的惡臭假單胞菌屬的微生物，將具有6-12個碳原子的非極性脂族化合物的末端羥基化，如生產(chǎn)1-辛醇，的微生物學方法，其中，尤其使用具有alkL基因的質(zhì)粒pGEc47，所述質(zhì)粒pGEc47也攜帶來自惡臭假單胞菌的2種alk操縱子。alkL基因的控制，是在天然操縱子啟動子的控制下，并因此與alkB、alkF、alkG、alkH、alkJ和alkK一起轉(zhuǎn)錄和翻譯。WO2002022845描述了一種通過使用攜帶上述質(zhì)粒pGEc47的大腸桿菌細胞來羥基化N-芐基-4-哌啶，從而生產(chǎn)N-芐基-4-羥基哌啶的方法。EP0502524描述了一種將芳族5-或6-元環(huán)雜環(huán)上的乙基末端羥基化的微生物學方法，其中使用alk操縱子生產(chǎn)不同的基因產(chǎn)物，這例如通過質(zhì)粒pGEc41編碼alkB、alkG、alkH、alkT和alkS的基因產(chǎn)物，但是不編碼alkL的基因產(chǎn)物。此外，該同一申請描述了一種質(zhì)粒pGMK921，其如pGEc41一樣，含有alkB、alkG、alkH、alkT和alkS的基因，但是不含有alkL的基因，然而，其表達不僅可通過天然啟動子的烷烴誘導，而且可通過tac啟動子的IPTG誘導(也參見US5306625)。Schneider等人在ApplEnvironMicrobiol.1998Oct;64(10):3784-90中描述了大腸桿菌中的飽和脂肪酸向其ω-1-、ω-2-和ω-3-羥基脂肪酸的生物轉(zhuǎn)化，其中使用細胞色素P-450BM-3單加氧酶和上述質(zhì)粒pGEc47。Favre-Bulle等人在NatureBio/Technology9,367-371(1991年4月)中描述了一種通過辛烷的生物轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)1-辛酸的方法，其中使用攜帶pGEc47的大腸桿菌細菌作為生物催化劑。在所述的方法中，兩種alk操縱子都完全表達。Rothen等人在BiotechnolBioeng.1998May20;58(4):356-65中遵循相同的方法。所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點是，由用作生物催化劑的細胞過多地生產(chǎn)對所希望的氧化過程沒有重大貢獻的基因產(chǎn)物，并因此降低了其性能。此外，所述多余共合成的alk基因產(chǎn)物可能具有不希望的酶活性，所述酶活性，例如通過中間產(chǎn)物流失到不希望的副產(chǎn)物中而有損于所希望的產(chǎn)物形成。在希望的有機殘基的ω-羥基化中，alkJ基因產(chǎn)物導致形成相應的醛。在例如同時存在alkH基因產(chǎn)物的情況下，所生成的醛被進一步氧化成羧酸。因而，在EP0502524中，為了產(chǎn)生希望的羥基化的方法產(chǎn)物，僅需要alkB、alkG和alkT的基因產(chǎn)物，因此，例如，基因alkF、alkJ、alkH和alkS是多余的。此外，在這里不利的是，其它alk基因產(chǎn)物的合成，對宿主的代謝能力提出了高要求。例如，alkJ是一種含有FAD的酶(Chen等人,J.Bacteriol,(1995),6894-6901)。但是，同樣含有FAD的alkT的不可放棄的生產(chǎn)已經(jīng)對宿主的FAD庫（FAD-Pool）造成了負擔。因為在例如大腸桿菌中的FAD合成能力是有限的，且同樣需要現(xiàn)存的細胞代謝，在生產(chǎn)不必要的alkJ的情況下，給細胞加上了可避免的負擔。此外，alkB、alkJ和alkH的基因產(chǎn)物是位于細胞質(zhì)膜上的或細胞質(zhì)膜相結(jié)合的。呼吸鏈也位于該區(qū)域中。膜蛋白的過量生產(chǎn)，導致從細胞膜中的變化直至膜囊泡的脫離，所述膜囊泡遷移進胞質(zhì)溶膠中(Nieboer等人,MolecularMicrobiology(1993)8(6),1039-1051)。這最終導致所述細胞的過早裂解(Wubbolts等人,BiotechnologyandBioengineering(1996),第52卷,301-308)，所有這些在工業(yè)過程不可缺少的高細胞密度發(fā)酵中尤其如此。類似地，在Schneider等人中，alkB、alkF、alkG、alkH、alkJ、alkK、alkS和alkT的基因產(chǎn)物被過多地共同合成，因為實際用于所希望的反應的酶是細胞色素-P-450BM-3單加氧酶。就工業(yè)過程而言，難以使用質(zhì)粒編碼的代謝途徑。隨著發(fā)酵罐體積的增加，使用抗生素用于維持提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的選擇壓力，首先變得非常昂貴，其次到達廢水的臨界點（abwasserkritisch）。因此，大規(guī)模發(fā)酵實際上總是在沒有任何抗生素添加的情況下進行。盡管如此，為了確保人造氧化代謝途徑的遺傳穩(wěn)定性，將使用的基因整合進宿主生物的基因組中是合乎需要的。要整合的基因構(gòu)建體越小，這樣的做法就越好地成功。因為這里考慮的最小基因集合alkBGTL已經(jīng)具有相當大的尺寸，必須避免并非絕對必需的任何其它核苷酸序列。除了減少必要的分子生物學工作的范圍和增加其成功的可能性，盡可能小的構(gòu)建體也有益于宿主生物的基因組穩(wěn)定性。本發(fā)明的目的是，提供一種方法，所述方法能夠克服現(xiàn)有技術(shù)的所述缺點中的至少一個。技術(shù)實現(xiàn)要素：已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在下文中描述的方法和遺傳修飾的細胞為實現(xiàn)所提出的目的做出了貢獻。因此，本發(fā)明涉及使用如在權(quán)利要求1中描述的alkL基因產(chǎn)物來生產(chǎn)被氧化的有機物質(zhì)的方法，以及在該方法中使用的重組細胞。本發(fā)明另外涉及alkL基因產(chǎn)物用于增加氧化速率的用途。優(yōu)點是，在所述方法中存在的資源的最佳利用，例如在細胞代謝方面，尤其是在高細胞密度發(fā)酵條件下。本發(fā)明描述了使用至少一種氧化酶和至少一種alkL基因產(chǎn)物來氧化有機物質(zhì)的方法，其特征在于，獨立于由含有alkL基因的alk操縱子編碼的至少一種其它基因產(chǎn)物，提供所述alkL基因產(chǎn)物。與本發(fā)明有關(guān)的所述的alk基因編碼類似地命名為AlkX的蛋白序列。如果同時描述多個基因alkX、alkY和alkZ，則使用命名法alkXYZ，或類似地，在蛋白質(zhì)的情況中，使用命名法AlkXYZ。與本發(fā)明有關(guān)的表述“有機物質(zhì)的氧化”被理解為例如，羥基化或環(huán)氧化，醇轉(zhuǎn)化成醛或酮，醛轉(zhuǎn)化成羧酸，或雙鍵的水合。同樣地，在此表述下面也合并了多級氧化過程，所述多級氧化過程如尤其可通過使用多種氧化酶來實現(xiàn)，例如，在多個位點（例如在ω位置和ω-1位置）處烷基殘基的羥基化，所述羥基化由多種單加氧酶催化。與本發(fā)明有關(guān)的表述“使用至少一種氧化酶和至少一種alkL基因產(chǎn)物”被理解為，靶向地提供所述酶和基因產(chǎn)物，更確切地說，以被認為在天然自然界中本身不存在的每種單一酶或基因產(chǎn)物的形式。這可以如下進行：例如，通過異源生產(chǎn)或過量生產(chǎn)在細胞中使用的蛋白，或通過提供至少部分地純化的蛋白；但是，在這里也包括與存在于天然自然界中的酶相比改變的環(huán)境，例如，以經(jīng)過修改的含有所述酶的天然細胞的形式，以這樣的方式，它例如以修飾形式，例如，弱化或強化，或具有點突變來生產(chǎn)某些其它蛋白。與本發(fā)明有關(guān)的表述“alkL基因產(chǎn)物”被理解為滿足下述2個條件中的至少一個的蛋白：1.)所述蛋白被鑒別為OmpW蛋白超家族(在國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(CDD)中的蛋白家族3922)的一個成員，其中該分配如下做出：使用標準搜索參數(shù)，小于0.01的e值（英語：“e-value”），并使用算法“blastp2.2.23+”，將所述蛋白的氨基酸序列與在2010年3月22日之前已經(jīng)保藏的NCBI的CDD中存在的數(shù)據(jù)庫條目進行比對，2.)在借助于RPS-BLAST在NCBICDD(2.20版)中搜索有關(guān)氨基酸序列中含有的保守蛋白結(jié)構(gòu)域時，以小于1×10-5的e值（英語：“e-value”），觀察到保守結(jié)構(gòu)域“OmpW,外膜蛋白W”(COG3047)的存在(（英語：“domainhit”）)。與本發(fā)明有關(guān)的表述“獨立于由含有alk基因的alk操縱子編碼的至少一種其它基因產(chǎn)物提供”被理解為，所述alkL基因產(chǎn)物的提供獨立于至少一種其它alk基因產(chǎn)物，所述其它alk基因產(chǎn)物以天然存在的形式與所述alkL基因產(chǎn)物的形成相關(guān)聯(lián)。例如，在一個包含基因alkBFGHJKL的操縱子中，各alkBFGHJ和K的alk基因產(chǎn)物與所述alkL基因產(chǎn)物的形成相關(guān)聯(lián)，因為它們通過同一個啟動子來提供。給出的所有百分比(%)是質(zhì)量百分比，除非另外說明。取決于使用的氧化酶，根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于氧化被該氧化酶接受為底物的任意有機物質(zhì)；優(yōu)選的有機物質(zhì)選自包含下述物質(zhì)、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組：支鏈的或無支鏈的、優(yōu)選支鏈的、飽和的或不飽和的、優(yōu)選飽和的、任選取代的烷烴、烯烴、炔烴、醇、醛、酮、羧酸、羧酸酯、胺和環(huán)氧化物，其中它們優(yōu)選地具有3-22個、尤其是6-18個、更優(yōu)選地8-14個、尤其是12個碳原子。在根據(jù)本發(fā)明的方法中特別優(yōu)選的有機物質(zhì)選自包含下述物質(zhì)、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組：羧酸及其對應的酯，尤其是具有3-22、優(yōu)選地6-18、特別優(yōu)選地8-14個碳原子，尤其是烷烴的羧酸，尤其是烷烴的無支鏈羧酸，尤其是月桂酸及其酯，尤其是月桂酸甲酯和月桂酸乙酯、癸酸、癸酸酯、肉豆蔻酸和肉豆蔻酸酯，具有3-22、優(yōu)選地6-18、特別優(yōu)選地8-14個碳原子的未被取代的烷烴，優(yōu)選無支鏈烷烴，尤其是選自包含、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組：辛烷、癸烷、十二烷和十四烷，具有3-22、優(yōu)選地6-18、特別優(yōu)選地8-14個碳原子的未被取代的烯烴，優(yōu)選無支鏈烯烴，尤其是選自包含、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組：反式-辛-1-烯、反式-壬-1-烯、反式-癸-1-烯、反式-十一碳-1-烯、反式-十二碳-1-烯、反式-十三碳-1-烯、反式-十四碳-1-烯、順式-辛-1-烯、順式-壬-1-烯、順式-癸-1-烯、順式-十一碳-1-烯、順式-十二碳-1-烯、順式-十三碳-1-烯、順式-十四碳-1-烯、反式-辛-2-烯、反式-壬-2-烯、反式-癸-2-烯、反式-十一碳-2-烯、反式-十二碳-2-烯、反式-十三碳-2-烯和反式-十四碳-2-烯、反式-辛-3-烯、反式-壬-3-烯、反式-癸-3-烯、反式-十一碳-3-烯、反式-十二碳-3-烯、反式-十三碳-3-烯和反式-十四碳-3-烯、反式-辛-4-烯、反式-壬-4-烯、反式-癸-4-烯、反式-十一碳-4-烯、反式-十二碳-4-烯、反式-十三碳-4-烯、反式-十四碳-4-烯、反式-癸-5-烯、反式-十一碳-5-烯、反式-十二碳-5-烯、反式-十三碳-5-烯、反式-十四碳-5-烯、反式-十二碳-6-烯、反式-十三碳-6-烯、反式-十四碳-6-烯和反式-十四碳-7-烯，所述組特別優(yōu)選地由下述物質(zhì)組成：反式-辛-1-烯、反式-癸-1-烯、反式-十二碳-1-烯、反式-十四碳-1-烯、順式-辛-1-烯、順式-癸-1-烯、順式-十二碳-1-烯、順式-十四碳-1-烯、反式-辛-2-烯、反式-癸-2-烯、反式-十二碳-2-烯和反式-十四碳-2-烯、反式-辛-3-烯、反式-癸-3-烯、反式-十二碳-3-烯和反式-十四碳-3-烯、反式-辛-4-烯、反式-癸-4-烯、反式-十二碳-4-烯、反式-十四碳-4-烯、反式-癸-5-烯、反式-十二碳-5-烯、反式-十四碳-5-烯、反式-十二碳-6-烯、反式-十四碳-6-烯和反式-十四碳-7-烯，具有3-22、優(yōu)選地6-18、特別優(yōu)選地8-14個碳原子的未被取代的一元醇，優(yōu)選無支鏈的一元醇，尤其是選自包含下述物質(zhì)、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組：1-辛醇、1-壬醇、1-癸醇、1-十一醇、1-十二醇、1-十三醇和1-十四醇，特別優(yōu)選地，所述組由下述物質(zhì)組成：1-辛醇、1-癸醇、1-十二醇和1-十四醇，具有3-22、優(yōu)選地6-18、特別優(yōu)選地8-14個碳原子的未被取代的醛，優(yōu)選無支鏈的醛，尤其是選自包含下述物質(zhì)、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組：辛醛、壬醛、癸醛、十二醛和十四醛，具有3-22、優(yōu)選地6-18、特別優(yōu)選地8-14個碳原子的未被取代的一元胺，優(yōu)選無支鏈的一元胺，尤其是選自包含下述物質(zhì)、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組：1-氨基辛烷、1-氨基壬烷、1-氨基癸烷、1-氨基十一烷、1-氨基十二烷、1-氨基十三烷和1-氨基十四烷，特別優(yōu)選地，所述組由下述物質(zhì)組成：1-氨基辛烷、1-氨基癸烷、1-氨基十二烷和1-氨基十四烷，以及被取代的化合物，所述化合物尤其含有一個或多個羥基-、氨基（Amin）-、酮-、羧基-、環(huán)丙基殘基-或環(huán)氧官能團作為其它取代基，尤其是選自包含、優(yōu)選由下述物質(zhì)組成的組：1,8-辛二醇、1,9-壬二醇、1,10-癸二醇、1,11-十一烷二醇、1,12-十二烷二醇、1,13-十三烷二醇、1,14-十四烷二醇、8-氨基-[1-辛醇]、9-氨基-[1-壬醇]、10-氨基-[1-十二醇]、11-氨基-[1-十一醇]、12-氨基-[1-十二醇]、13-氨基-[1-十三醇]、14-氨基-[1-十四醇]、8-羥基-[1-辛醛]、9-羥基-[1-壬醛]、10-羥基-[1-癸醛]、11-羥基-[1-十一醛]、12-羥基-[1-十二醛]、13-羥基-[1-十三醛]、14-羥基-[1-十四醛]、8-氨基-[1-辛醛]、9-氨基-[1-壬醛]、10-氨基-[1-癸醛]、11-氨基-[1-十一醛]、12-氨基-[1-十二醛]、13-氨基-[1-十三醛]、14-氨基-[1-十四醛]、8-羥基-[1-辛酸]、9-羥基-[1-壬酸]、10-羥基-[1-癸酸]、11-羥基-[1-十一烷酸]、12-羥基-[1-十二烷酸]、13-羥基-[1-十一烷酸]、14-羥基-[1-十四烷酸]、8-羥基-[1-辛酸甲酯]、9-羥基-[1-壬酸甲酯]、10-羥基-[1-癸酸甲酯]、11-羥基-[1-十一烷酸甲酯]、12-羥基-[1-十二烷酸甲酯]、13-羥基-[1-十一烷酸甲酯]、14-羥基-[1-十四烷酸甲酯]、8-羥基-[1-辛酸乙酯]、9-羥基-[1-壬酸乙酯]、10-羥基-[1-癸酸乙酯]、11-羥基-[1-十一烷酸乙酯]、12-羥基-[1-十二烷酸乙酯]、13-羥基-[1-十一烷酸乙酯]和14-羥基-[1-十四烷酸乙酯]，特別優(yōu)選地，所述組由下述物質(zhì)組成：1,8-辛二醇、1,10-癸二醇、1,12-十二烷二醇、1,14-十四烷二醇、8-氨基-[1-辛醇]、10-氨基-[1-十二醇]、12-氨基-[1-十二醇]、14-氨基-[1-十四醇]、8-羥基-[1-辛醛]、10-羥基-[1-癸醛]、12-羥基-[1-十二醛]、14-羥基-[1-十四醛]、8-氨基-[1-辛醛]、10-氨基-[1-癸醛]、12-氨基-[1-十二醛]、14-氨基-[1-十四醛]、8-羥基-[1-辛酸]、10-羥基-[1-癸酸]、12-羥基-[1-十二烷酸]、14-羥基-[1-十四烷酸]、8-羥基-[1-辛酸甲酯]、10-羥基-[1-癸酸甲酯]、12-羥基-[1-十二烷酸甲酯]、14-羥基-[1-十四烷酸甲酯]、8-羥基-[1-辛酸乙酯]、10-羥基-[1-癸酸乙酯]、12-羥基-[1-十二烷酸乙酯]和14-羥基-[1-十四烷酸乙酯]，其中月桂酸及其酯，尤其是月桂酸甲酯和月桂酸乙酯，是特別優(yōu)選的。用根據(jù)本發(fā)明的方法，取決于使用的氧化酶和使用的有機物質(zhì)，可以生產(chǎn)多種氧化產(chǎn)物，尤其是醇、醛、酮和羧酸?？梢酝ㄟ^如下列舉的有機物質(zhì)的反應通過根據(jù)本發(fā)明的方法得到這些氧化產(chǎn)物：-使烷烴/烯烴/炔烴反應，以形成醇(例如用單加氧酶)-使醇反應，以形成醛(例如用醇脫氫酶或醇氧化酶)-使醇反應，以形成酮(例如用醇脫氫酶或醇氧化酶)-使醛反應，以形成羧酸(例如用醛脫氫酶)-使環(huán)氧化物反應，以形成羥腈(例如用鹵代醇脫鹵素酶)在該背景下，優(yōu)選地，使用根據(jù)本發(fā)明的方法，尤其是以羥基化反應的形式，生產(chǎn)醇和醛，優(yōu)選醇，尤其是ω-醇，非常特別地ω-羥基羧酸。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，可以有利地使有機物質(zhì)，尤其是羧酸和羧酸酯，在ω-位置處氧化。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有氧化酶，因為所提供的alkL基因產(chǎn)物的功能不取決于氧化酶。這樣的酶在氧化還原酶名稱下是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且可以參見國際生物化學和分子生物學聯(lián)合會（InternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology）的酶委員會的系統(tǒng)命名法的酶類別EC1.X.X.X。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，使用的氧化酶是烷烴單加氧酶、二甲苯單加氧酶、醛脫氫酶、醇氧化酶或醇脫氫酶，優(yōu)選烷烴單加氧酶。適用于二甲苯單加氧酶的基因是，例如，xylM-或xylA基因，其中含有這2種基因的質(zhì)粒具有GENBANK登記號M37480。在該背景下，一種特別優(yōu)選的烷烴單加氧酶的特征在于，它是細胞色素-P450單加氧酶，尤其是來自下述生物的細胞色素-P450單加氧酶：酵母，尤其是畢赤酵母屬（Pichia）、子囊菌酵母屬（Yarrowia）和假絲酵母屬（Candida），例如熱帶假絲酵母（Candidatropicalis）或麥芽糖假絲酵母（Candidamaltose），或植物，例如鷹嘴豆（CicerarietinumL.），或哺乳動物，例如褐家鼠(Rattusnorvegicus)，尤其是CYP4A1。來自熱帶假絲酵母的合適的細胞色素-P450單加氧酶的基因序列公開在例如WO-A-00/20566中，而來自鷹嘴豆的合適的細胞色素-P450單加氧酶的基因序列可以參見例如：Barz等人,“CloningandcharacterizationofeightcytochromeP450cDNAsfromchickpea(CicerarietinumL.)cellsuspensioncultures”,PlantScience,第155卷,第101-108頁(2000)。其它優(yōu)選的烷烴單加氧酶由來自惡臭假單胞菌GPo1的alk操縱子的alkB基因編碼。alkB基因序列的分離，描述在：例如，vanBeilen等人,“FunctionalAnalysisofAlkaneHydroxylasesfromGram-NegativeandGram-PositiveBacteria”,JournalofBacteriology,第184(6)卷,第1733-1742頁(2002)。alkB基因的其它同系物也可以參見：vanBeilen等人,“Oil&GasScienceandTechnology”,第58(4)卷,第427-440頁(2003)。另外，優(yōu)選的烷烴單加氧酶是這樣的alkB基因產(chǎn)物，其由來自選自下述的生物的alkB基因編碼：革蘭氏陰性細菌，尤其是假單胞菌，那里是假單胞菌屬（Pseudomonas），尤其是門多薩假單胞菌（Pseudomonasmendocina），海洋柄菌屬（Oceanicaulis），優(yōu)選亞歷山大海洋柄菌（Oceanicaulisalexandrii）HTCC2633，柄桿菌屬（Caulobacter），優(yōu)選地柄桿菌屬K31種，海洋桿菌屬（Marinobacter），優(yōu)選Marinobacteraquaeolei，特別優(yōu)選地MarinobacteraquaeoleiVT8，海洋烷烴降解菌屬（Alcanivorax），優(yōu)選地Alcanivoraxborkumensis，醋桿菌屬（Acetobacter），無色桿菌屬（Achromobacter），嗜酸菌屬（Acidiphilium），食酸菌屬（Acidovorax），氣微菌屬（Aeromicrobium），Alkalilimnicola，交替單胞菌目（Alteromonadales），魚腥藻屬（Anabaena），Aromatoleum，固氮弧菌屬（Azoarcus），固氮螺菌屬（Azospirillum），固氮菌屬（Azotobacter），博德特菌屬（Bordetella），短根瘤菌屬（Bradyrhizobium），伯霍爾德桿菌屬（Burkholderia），綠菌屬（Chlorobium），Citreicella，梭菌屬（Clostridium），科爾韋爾氏菌屬（Colwellia），叢毛平胞菌屬（Comamonas），Conexibacter，Congregibacter，棒桿菌屬(Corynebacterium)，貪銅菌屬（Cupriavidus），藍絲菌屬（Cyanothece），代爾夫特菌屬（Delftia），脫硫微菌屬（Desulfomicrobium），Desulfonatronospira，Dethiobacter，Dinoroseobacter，赤桿菌屬（Erythrobacter），弗朗西絲菌屬（Francisella），Glaciecola，大頭茶屬（Gordonia），Grimontia，Hahella，鹽陸生菌屬（Haloterrigena），鹽硫桿狀菌屬（Halothiobacillus），Hoeflea，生絲單胞菌屬（Hyphomonas），Janibacter，Jannaschia，Jonquetella，克雷伯菌屬（Klebsiella），軍團病桿菌屬（Legionella），Limnobacter，Lutiella，磁螺菌屬（Magnetospirillum），中間根瘤菌屬（Mesorhizobium），Methylibium，甲基桿菌（Methylobacterium），噬甲基菌屬（Methylophaga），分枝桿菌屬（Mycobacterium），奈瑟球菌屬（Neisseria），亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas），諾卡爾菌屬（Nocardia），念珠藻科（Nostoc），Novosphingobium，Octadecabacter，副球菌屬（Paracoccus），Parvibaculum，短小盒菌屬（Parvularcula），消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus），Phaeobacter，苯基桿菌屬（Phenylobacterium），發(fā)光細菌屬（Photobacterium），Polaromonas，普雷沃氏菌屬（Prevotella），假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas），Pseudovibrio，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter），冷彎菌屬（Psychroflexus），羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia），紅桿菌屬（Rhodobacter），紅球菌屬（Rhodococcus），紅育菌屬（Rhodoferax），紅微菌屬（Rhodomicrobium），紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas），紅螺菌屬（Rhodospirillum），玫瑰桿菌屬（Roseobacter），Roseovarius，Ruegeria，Sagittula，斯瓦尼菌屬（Shewanella），Silicibacter，狹長平胞屬（Stenotrophomonas），眼點粘球菌屬（Stigmatella），鏈霉菌屬（Streptomyces），Sulfitobacter，Sulfurimonas，Sulfurovum，聚球藻屬（Synechococcus），Thalassiobium，熱球菌屬（Thermococcus），高溫單孢菌屬（Thermomonospora），Thioalkalivibrio，硫桿菌屬（Thiobacillus），硫微螺菌屬（Thiomicrospira），Thiomonas，冢村氏菌屬（Tsukamurella），弧菌屬（Vibrio）或黃單胞菌屬（Xanthomonas），其中特別優(yōu)選的是來自Alcanivoraxborkumensis、亞歷山大海洋柄菌HTCC2633、柄桿菌屬K31種和MarinobacteraquaeoleiVT8的那些。在該背景下，如果除了AlkB以外提供alkG和alkT基因產(chǎn)物是有利的；這些可以是可從生產(chǎn)alkB基因產(chǎn)物的生物分離出的基因產(chǎn)物，或者是來自惡臭假單胞菌GPo1的alkG和alkT。優(yōu)選的醇脫氫酶是，例如，由alkJ基因編碼的酶（EC1.1.99.8），尤其是由來自惡臭假單胞菌GPo1的alkJ基因編碼的酶（vanBeilen等人,MolecularMicrobiology,（1992）6（21）,3121-3136）。來自惡臭假單胞菌GPo1、Alcanivoraxborkumensis、副百日咳博代氏菌（Bordetellaparapertussis）、支氣管炎博德特菌（Bordetellabronchiseptica）或Roseobacterdenitrifican的alkJ基因的基因序列，可以參見例如KEGG基因數(shù)據(jù)庫（KyotoEncylopediaofGenesandGenomes）。另外，優(yōu)選的醇脫氫酶是這樣的醇脫氫酶，其由來自選自下述的生物的alkJ基因編碼：革蘭氏陰性細菌，尤其是假單胞菌，那里是假單胞菌屬（Pseudomonas），尤其是門多薩假單胞菌（Pseudomonasmendocina），海洋柄菌屬（Oceanicaulis），優(yōu)選地亞歷山大海洋柄菌（Oceanicaulisalexandrii）HTCC2633，柄桿菌屬（Caulobacter），優(yōu)選地柄桿菌屬K31種，海洋桿菌屬（Marinobacter），優(yōu)選地Marinobacteraquaeolei，特別優(yōu)選地MarinobacteraquaeoleiVT8，海洋烷烴降解菌屬（Alcanivorax），優(yōu)選地Alcanivoraxborkumensis，醋桿菌屬（Acetobacter），無色桿菌屬（Achromobacter），嗜酸菌屬（Acidiphilium），食酸菌屬（Acidovorax），氣微菌屬（Aeromicrobium），Alkalilimnicola，交替單胞菌目（Alteromonadales），魚腥藻屬（Anabaena），Aromatoleum，固氮弧菌屬（Azoarcus），固氮螺菌屬（Azospirillum），固氮菌屬（Azotobacter），博德特菌屬（Bordetella），短根瘤菌屬（Bradyrhizobium），伯霍爾德桿菌屬（Burkholderia），綠菌屬（Chlorobium），Citreicella，梭菌屬（Clostridium），科爾韋爾氏菌屬（Colwellia），叢毛平胞菌屬（Comamonas），Conexibacter，Congregibacter，棒桿菌屬(Corynebacterium)，貪銅菌屬（Cupriavidus），藍絲菌屬（Cyanothece），代爾夫特菌屬（Delftia），脫硫微菌屬（Desulfomicrobium），Desulfonatronospira，Dethiobacter，Dinoroseobacter，赤桿菌屬（Erythrobacter），弗朗西絲菌屬（Francisella），Glaciecola，大頭茶屬（Gordonia），Grimontia，Hahella，鹽陸生菌屬（Haloterrigena），鹽硫桿狀菌屬（Halothiobacillus），Hoeflea，生絲單胞菌屬（Hyphomonas），Janibacter，Jannaschia，Jonquetella，克雷伯菌屬（Klebsiella），軍團病桿菌屬（Legionella），Limnobacter，Lutiella，磁螺菌屬（Magnetospirillum），中間根瘤菌屬（Mesorhizobium），Methylibium，甲基桿菌（Methylobacterium），噬甲基菌屬（Methylophaga），分枝桿菌屬（Mycobacterium），奈瑟球菌屬（Neisseria），亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas），諾卡爾菌屬（Nocardia），念珠藻科（Nostoc），Novosphingobium，Octadecabacter，副球菌屬（Paracoccus），Parvibaculum，短小盒菌屬（Parvularcula），消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus），Phaeobacter，苯基桿菌屬（Phenylobacterium），發(fā)光細菌屬（Photobacterium），Polaromonas，普雷沃氏菌屬（Prevotella），假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas），Pseudovibrio，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter），冷彎菌屬（Psychroflexus），羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia），紅桿菌屬（Rhodobacter），紅球菌屬（Rhodococcus），紅育菌屬（Rhodoferax），紅微菌屬（Rhodomicrobium），紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas），紅螺菌屬（Rhodospirillum），玫瑰桿菌屬（Roseobacter），Roseovarius，Ruegeria，Sagittula，斯瓦尼菌屬（Shewanella），Silicibacter，狹長平胞屬（Stenotrophomonas），眼點粘球菌屬（Stigmatella），鏈霉菌屬（Streptomyces），Sulfitobacter，Sulfurimonas，Sulfurovum，聚球藻屬（Synechococcus），Thalassiobium，熱球菌屬（Thermococcus），高溫單孢菌屬（Thermomonospora），Thioalkalivibrio，硫桿菌屬（Thiobacillus），硫微螺菌屬（Thiomicrospira），Thiomonas，冢村氏菌屬（Tsukamurella），弧菌屬（Vibrio）或黃單胞菌屬（Xanthomonas）。在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的優(yōu)選的alkL基因產(chǎn)物的特征在于，所述alkL基因產(chǎn)物的生產(chǎn)在天然宿主中由二環(huán)丙基酮誘導；在該背景下，另外優(yōu)選地，alkL基因的表達作為一組基因的一部分，例如在調(diào)節(jié)子例如操縱子中進行。在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的alkL基因產(chǎn)物優(yōu)選地由來自下述生物的alkL基因編碼，所述生物選自革蘭氏陰性細菌組，尤其是含有下述生物、優(yōu)選地由下述生物組成的組：假單胞菌，特別是惡臭假單胞菌，尤其是惡臭假單胞菌GPo1和P1、固氮菌屬、Desulfitobacterium、伯霍爾德桿菌屬、優(yōu)選洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、紅桿菌屬、羅爾斯通氏菌屬、代爾夫特菌屬和立克次體屬（Rickettsia）、海洋柄菌屬、優(yōu)選亞歷山大海洋柄菌HTCC2633、柄桿菌屬（Caulobacter）、優(yōu)選地柄桿菌屬K31種、海洋桿菌屬、優(yōu)選Marinobacteraquaeolei、特別優(yōu)選MarinobacteraquaeoleiVT8和紅假單胞菌屬。如果所述alkL基因產(chǎn)物源自與形成根據(jù)本發(fā)明使用的氧化酶不同生物則是有利的。在該背景下，非常特別優(yōu)選的alkL基因產(chǎn)物由來自惡臭假單胞菌GPo1和P1的alkL基因編碼，所述基因由SeqIDNr.1和SeqIDNr.3描述，以及具有多肽序列SeqIDNr.2或SeqIDNr.4的蛋白，或是具有下述多肽序列的蛋白：相對于SeqIDNr.2或SeqIDNr.4，在所述多肽序列中最多60%、優(yōu)選地最多25%、特別優(yōu)選地最多15%、尤其是最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸殘基通過刪除、插入、置換或它們的組合被修飾，且所述產(chǎn)物仍然具有各個參照序列SeqIDNr.2或SeqIDNr.4的蛋白的活性的至少50%、優(yōu)選65%、特別優(yōu)選80%、尤其是超過90%，其中參照蛋白的100%活性被理解為：與不存在參照蛋白的生物催化劑的活性相比，用作生物催化劑的細胞的活性（換而言之，單位時間內(nèi)反應的物質(zhì)的量）（基于使用的細胞重量計，單位/克細胞干質(zhì)量（細胞干重）[U/gCDW]）的增加，更確切地說，在實施例所述的系統(tǒng)中，其中作為氧化酶使用來自惡臭假單胞菌GPo1的alkBGT的基因產(chǎn)物用于在大腸桿菌細胞中將月桂酸甲酯轉(zhuǎn)化成12-羥基月桂酸甲酯。選擇用于測定氧化速率的方法可以參見實施例。這里的單位的定義，是酶動力學中的常規(guī)定義。1單位的生物催化劑在1分鐘內(nèi)將1μmol的底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。不會導致給定的多肽的性質(zhì)和功能的重大變化的給定多肽序列的氨基酸殘基的修飾，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，有些氨基酸經(jīng)?？梢匀菀椎乇舜私粨Q；這樣的合適的氨基酸置換的實例是：Ala置換Ser；Arg置換Lys；Asn置換Gln或His；Asp置換Glu；Cys置換Ser；Gln置換Asn；Glu置換Asp；Gly置換Pro；His置換Asn或Gln；Ile置換Leu或Val；Leu置換Met或Val；Lys置換Arg或Gln或Glu；Met置換Leu或Ile；Phe置換Met或Leu或Tyr；Ser置換Thr；Thr置換Ser；Trp置換Tyr；Tyr置換Trp或Phe；Val置換Ile或Leu。同樣已知，特別在多肽的N-或C-端處例如以氨基酸插入或刪除的形式的修飾經(jīng)常對多肽的功能沒有重大影響。一種根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方法的特征在于，所述其它基因產(chǎn)物選自下述的至少一種：AlkB、AlkF、AlkG、AlkH、AlkJ和AlkK，尤其是AlkF、AlkG、AlkH、AlkJ和AlkK，其中其它基因產(chǎn)物尤其選自含有下述基因組合，優(yōu)選地由下述基因組合組成：alkBF、alkBG、alkFG、alkBJ、alkFJ、alkGJ、alkBH、alkFH、alkGH、alkJH、alkBK、alkFK、alkGK、alkJK、alkHK、alkBFG、alkBFJ、alkBFH、alkBFK、alkBGJ、alkFGJ、alkBGH、alkFGH、alkBGK、alkFGK、alkBJH、alkFJH、alkGJH、alkBJK、alkFJK、alkGJK、alkFHK、alkBHK、alkFHK、alkGHK、alkBGJH、alkBGJK、alkBGHK、alkBFGJ、alkBFGH、alkFGJH、alkBFGK、alkFGJK、alkGJHK、alkBFJH、alkBFJK、alkFJHK、alkBFHK、alkBFGJH、alkBFGJK和alkBFGJHK，尤其是alkFHJK和alkBFGHJK。如果所述氧化酶和所述alkL基因產(chǎn)物由微生物提供，則對于根據(jù)本發(fā)明的方法而言是有利的。在該情況下，兩種酶可以各自在一種微生物中各自分別提供，或在一種微生物中一起提供，其中后者是優(yōu)選的。因此，一種根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的方法的特征在于，它在至少一種微生物中或在包圍至少一種微生物的培養(yǎng)基中進行，所述微生物提供所述氧化酶和所述alkL基因產(chǎn)物。在該背景下優(yōu)選的是，在至少一種微生物中重組地提供所述氧化酶和所述alkL基因產(chǎn)物。那么下述關(guān)于重組生產(chǎn)的評論不僅與氧化酶有關(guān)，而且與alkL基因產(chǎn)物有關(guān)。原則上，重組生產(chǎn)可以如下實現(xiàn)：增加編碼所述蛋白的一個或多個基因序列的拷貝數(shù)，使用經(jīng)修飾的啟動子，修改基因的密碼子使用，以多種方式增加mRNA或酶的半衰期，修改基因表達的調(diào)節(jié)，或使用編碼對應蛋白的基因或等位基因，和任選地，組合這些措施。具有這樣的基因供給的細胞例如用含有下述希望的基因、該基因的等位基因或其部分，和使得所述基因的表達成為可能的啟動子的載體通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、接合或這些方法的組合來制備。尤其通過將所述基因或等位基因整合進細胞的染色體或染色體外復制的載體中，使得異源表達成為可能。就異檸檬酸裂合酶的實例而言，在EP0839211中給出了在細胞中重組生產(chǎn)的可能性的綜述，在此將該文獻作為引用并入本文，且其關(guān)于在細胞中重組生產(chǎn)的可能性的公開內(nèi)容，形成本發(fā)明的公開內(nèi)容的一部分。上述和所有在下文中提及的蛋白質(zhì)和/或基因的提供和/或生產(chǎn)和/或表達均是借助于1維和2維凝膠電泳和隨后使用相應的評價軟件對凝膠中的蛋白濃度進行光學鑒別可檢測的。如果發(fā)現(xiàn)的表達性能僅僅是基于增加對應基因的表達，則可以通過對比野生型和遺傳修飾的細胞之間的1維或2維蛋白分離，以簡單的方式定量測定重組表達。在棒狀桿菌的情況下，用于制備蛋白凝膠和用于鑒別蛋白的常規(guī)方法，是Hermann等人(Electrophoresis,22:1712.23(2001))描述的做法。同樣可以如下分析蛋白濃度：通過使用對要檢測的蛋白特異性的抗體進行蛋白質(zhì)印跡雜交(Sambrook等人,MolecularCloning:alaboratorymanual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.USA,1989)，隨后使用用于濃度測定的相應軟件進行光學評價(Lohaus和Meyer(1989)Biospektrum,5:32-39;Lottspeich(1999),AngewandteChemie111:2630-2647)。如果通過增加蛋白的合成來實現(xiàn)重組表達，則例如增加對應基因的拷貝數(shù)，或突變位于結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子-和調(diào)節(jié)區(qū)域或核糖體結(jié)合位點。另外，通過可誘導的啟動子可以增加在任意的時間點的表達。但此外，也可以將所謂的“增強子”指定給蛋白基因作為調(diào)控序列，它們通過RNA聚合酶和DNA之間改善的相互作用同樣起增加基因表達的作用。通過延長mRNA的壽命的措施，同樣改善表達。為了增加各個基因的重組表達，使用例如附加型質(zhì)粒?？梢钥紤]的質(zhì)?；蜉d體原則上是本領(lǐng)域技術(shù)人員可用于該目的的所有實施方式。這樣的質(zhì)粒和載體可以參見，例如，來自Novagen、Promega、NewEnglandBiolabs、Clontech或GibcoBRL的公司小冊子。其它優(yōu)選的質(zhì)粒和載體可以參見：Glover,D.M.(1985),DNAcloning:apracticalapproach,第I-III卷,IRLPressLtd.,Oxford;Rodriguez,R.L.和Denhardt,D.T.(編)(1988),Vectors:asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,179-204,Butterworth,Stoneham;Goeddel,D.V.(1990),Systemsforheterologousgeneexpression,MethodsEnzymol.185,3-7;Sambrook,J.;Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),Molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,NewYork。然后通過接合或轉(zhuǎn)化，將含有要擴增的基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進希望的菌株中。接合的方法例如描述于Sch?fer等人,AppliedandEnvironmentalMicrobiology60:756-759(1994)。用于轉(zhuǎn)化的方法例如描述于Thierbach等人,AppliedMicrobiologyandBiotechnology29:356-362(1988),Dunican和Shivnan,Bio/Technology7:1067-1070(1989)，以及Tauch等人,FEMSMicrobiologyLetters123:343-347(1994)。在借助于“交叉”事件進行同源重組以后，得到的菌株含有有關(guān)基因的至少2個拷貝。因此，在根據(jù)本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地使用重組微生物，由于良好的遺傳可達性，所述微生物優(yōu)選地選自細菌，尤其是革蘭氏陰性細菌，特別選自含有下述生物，優(yōu)選地由下述生物組成的組：大腸桿菌、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）、熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens）、惡臭假單胞菌、食酸假單胞菌（Pseudomonasacidovorans）、銅綠假單孢菌（Pseudomonasaeruginosa）、食酸菌屬（Acidovoraxsp.）、溫和假單胞菌（Acidovoraxtemperans）、不動桿菌屬（Acinetobactersp.）、伯霍爾德桿菌屬（Burkholderiasp.）、氰基細菌（Cyanobacteria）、克雷伯菌屬（Klebsiellasp.）、沙門菌屬（Salmonellasp.）、根瘤菌屬（Rhizobiumsp.）和苜蓿根瘤菌（Rhizobiummeliloti），其中大腸桿菌是特別優(yōu)選的。在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的細胞同樣是本發(fā)明的組成部分。因此，經(jīng)這樣遺傳修飾的微生物是本發(fā)明的主題，所述微生物增強合成至少一種氧化有機物質(zhì)的酶和至少一種alkL基因產(chǎn)物，其中獨立于由含有alkL基因的alk操縱子編碼的至少一種其它基因產(chǎn)物而合成所述alkL基因產(chǎn)物。在該背景下，優(yōu)選的氧化酶是在根據(jù)本發(fā)明的方法中優(yōu)選地使用的相同氧化酶；類似地適用于：優(yōu)選的alkL基因產(chǎn)物、由含有alkL基因的alk操縱子編碼的優(yōu)選基因產(chǎn)物、優(yōu)選的有機物質(zhì)以及優(yōu)選的微生物。本發(fā)明的另一個主題是，alkL基因產(chǎn)物，優(yōu)選在微生物中，用于增加至少一種氧化有機物質(zhì)的酶的氧化速率的用途，其特征在于，所述alkL基因產(chǎn)物的使用獨立于由含有alkL基因的alk操縱子編碼的至少一種其它基因產(chǎn)物而進行。在該背景下，所述氧化優(yōu)選地是將有機物質(zhì)氧化成醛或醇，尤其是氧化成醇。因此，在該背景下，優(yōu)選地增加羥基化速率，尤其是在羧酸的ω-位置，優(yōu)選地與羧酸及其酯轉(zhuǎn)化成相應的ω-羥基化的化合物，尤其是十二烷酸甲酯轉(zhuǎn)化成羥基十二烷酸甲酯有關(guān)。在該背景下，優(yōu)選的氧化酶是在根據(jù)本發(fā)明的方法中優(yōu)選地使用的相同氧化酶；類似地適用于：優(yōu)選的alkL基因產(chǎn)物、由含有alkL基因的alk操縱子編碼的優(yōu)選基因產(chǎn)物、優(yōu)選的有機物質(zhì)以及優(yōu)選的微生物。在下文詳述的實施例中，示例性地描述了本發(fā)明，而不應將本發(fā)明限于在所述實施例中提及的實施方式中，本發(fā)明的應用范圍源自整個說明書和權(quán)利要求書。附圖說明下面的附圖是實施例的組成部分：圖1:大腸桿菌質(zhì)?！皃BT10_alkL”。具體實施方式對比實施例1：來自惡臭假單胞菌GPo1的AlkBGT烷烴羥化酶體系的表達載體，其沒有alkL從pCOM體系(Smits等人,2001Plasmid64:16-24)開始，生產(chǎn)構(gòu)建體pBT10(SeqIDNr.5)，其含有來自惡臭假單胞菌的3種組分：烷烴羥化酶(AlkB)、紅素氧還蛋白(AlkG)和紅素氧還蛋白還原酶(AlkT)。為了表達這3個基因，將alkBFG基因序列置于alkB啟動子控制下，并將alkT基因置于alkS啟動子控制下。為了簡化alkB和alkG的克隆，與alkB和alkG一起擴增和克隆位于二者之間的基因alkF。AlkF對于要催化的反應而言不是重要的。載體pBT10的制備的詳細描述，可以參見WO2009077461。實施例1：來自惡臭假單胞菌GPo1的AlkBGT烷烴羥化酶體系的表達載體，其具有alkL在另一個方案中，將alkL基因靶向克隆進alkBFG操縱子中，以便能夠與氧化所需的酶的最小集合（Minimalsatz）一起合成它。為此目的，通過PCR，擴增pGEc47(Eggink等人,1987,JBiolChem262,17712-17718)的alkL基因。為此使用的引物P1和P2在靶序列之外同樣含有SalI限制酶切位點，用于克隆進質(zhì)粒pBT10的SalI限制酶切位點。此外，將終止密碼子摻入在SalI限制酶切位點下游的正向引物P1中，以終止可能的alkH殘基翻譯。為了擴增，使用了FinnzymePhusion聚合酶(NewEnglandBiolabs)。根據(jù)生產(chǎn)商的方案，混合34μlH2O、10μl5×PhusionHF緩沖液、1μldNTPs(各10mM)、1.25μlP1、1.25μlP2(對于0.5μM的末端引物濃度)、2μlpGEc47質(zhì)粒溶液(150ng/μl)和0.5μlPhusion聚合酶，并在薄壁PCR埃彭道夫管中用于PCR。根據(jù)聚合酶生產(chǎn)商的提議，將下述PCR方案程序化：[98℃/30秒]，([98℃/10秒][72℃/60秒])30x，[72℃/10分鐘]根據(jù)生產(chǎn)商的方案，借助于“peqGOLD循環(huán)純化試劑盒”(PEQLABBiotechnologyGmbH,Erlangen)，純化得到的具有754bp長度的PCR產(chǎn)物，并用T4多核苷酸激酶進行磷酸化。為此，將15μl純化得到的PCR產(chǎn)物溶液與2μlATP溶液(100mM)、2μl激酶緩沖液和1μlT4多核苷酸激酶混合，并在37℃溫育20分鐘。然后通過加熱至75℃持續(xù)10分鐘，將該酶滅活。然后，根據(jù)生產(chǎn)商的方案，現(xiàn)將如此制備的PCR產(chǎn)物連接進來自lucigen公司的pSMART載體中。通過熱激(42℃持續(xù)45秒)，將2μl連接批次轉(zhuǎn)化進化學感受態(tài)的DH5α大腸桿菌細胞中。在卡那霉素平板上過夜溫育以后，在液體培養(yǎng)基(5ml含有30μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基)中在37℃培養(yǎng)選擇的菌落過夜，并借助于peqGOLDMiniprep試劑盒(PEQLABBiotechnologieGmbH(Erlangen))分離質(zhì)粒。通過用SalI進行限制酶切，并隨后進行凝膠電泳，鑒別出正確地連接的質(zhì)粒。以較大的量制備這樣的質(zhì)粒，并用SalI切割。通過瓊脂糖凝膠(peqGOLD凝膠提取試劑盒)的純化，分離得到的693bp片段。質(zhì)粒pBT10同樣以較大的量來制備，并用SalI切割，并使用堿性磷酸酶(小牛腸[堿性]磷酸酶,CIP)(NEB)將末端去磷酸化。這些操作在一個反應管中同時進行。為此，將13.3μl質(zhì)粒DNA與4μl緩沖液、19.2μl水、2μl堿性磷酸酶和1.5μlSalI(NEB)相混合，并在37℃溫育2h。通過瓊脂糖凝膠，如上所述地同樣純化切割并去磷酸化的載體。為了在連接中設(shè)置載體和插入片段的正確比例，通過瓊脂糖凝膠電泳，確定相應的DNA溶液的濃度。為了連接，將10μl切割的載體-DNA溶液與5μl插入片段-DNA溶液相混合，以使DNA質(zhì)量比為1:5，摻入2μl連接酶緩沖液、1μl水以及1μl連接酶，然后在22℃溫育2h，此后在4℃過夜孵育。通過電穿孔，將5μl該批次轉(zhuǎn)化進DH5α大腸桿菌細胞中。在5ml含有抗生素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)卡那霉素抗性的菌落過夜，并如上所述制備質(zhì)粒。通過EcoRV限制酶切來自5個克隆的質(zhì)粒DNA，在三種情況下，分別顯示出在8248Bp、2234Bp和1266Bp的帶。該模式證實了alkL的正確克隆。得到的質(zhì)粒被稱作pBT10_alkL(參見圖1)，且具有SeqIDNr.8。實施例2：月桂酸甲酯向ω-羥基月桂酸甲酯的轉(zhuǎn)化為了生物轉(zhuǎn)化，通過在42℃持續(xù)2min的熱激，將質(zhì)粒pBT10或pBT10_alkL轉(zhuǎn)化進化學感受態(tài)的菌株大腸桿菌W3110中(HanahanD.,DNAcloning:Apracticalapproach.IRLPress,Oxford,109-135)。為了合成羥基月桂酸甲酯，在100ml含有30mg/l卡那霉素的M9培養(yǎng)基(Na2HPO46g/l,KH2PO43g/l,NaCl0.5g/l,NH4Cl1g/l,2mMMgSO4,0.1mMCaCl2,0.5%葡萄糖)中，在30℃和180rpm下過夜培養(yǎng)大腸桿菌W3110-pBT10和W3110-pBT10_alkL，并通過離心進行收獲。在無菌條件下，在250ml含有0.5%葡萄糖和30mg/l卡那霉素的M9培養(yǎng)基中，重新懸浮部分生物質(zhì)，到OD450=0.2，并在搖瓶中在30℃和180rpm下進一步培養(yǎng)。在4h的生長時間以后，通過加入0.025%(v/v)的二環(huán)丙基酮，誘導alk基因的表達，并在相同條件下，將培養(yǎng)物振搖另外4小時。然后將細胞離心分離，將細胞沉淀物重新懸浮于KPi緩沖液(50mM,pH7.4)中，并置于調(diào)節(jié)溫度至30℃的生物反應器中。設(shè)定約1.8gCDW/l的生物質(zhì)濃度。在劇烈攪拌(1500min-1)和2vvm(體積/體積*分鐘)的空氣流入下，以比例1:2將底物月桂酸甲酯加入細胞懸浮液中(100ml細胞懸浮液，50ml月桂酸甲酯)。使溫度保持恒定在30℃。通過反應批次的GC分析，檢測羥基月桂酸甲酯的形成。為此，在作為陰性對照的0min以后，和在150min以后，通過反應器的提升管，用注射器取樣，并在Eppendorf臺式離心機中在2ml埃彭道夫管中在13200rpm下離心5分鐘用于相分離。借助于氣相色譜法(ThermoTraceGCUltra)，分析有機相。使用的柱是VarianInc.FactorFourTMVF-5m，長度：30m，膜厚度：0.25μm，內(nèi)徑：0.25mm。分析條件：烘箱溫度80-280℃漸變速度15℃/min分流比15注射體積1μl載體流速1.5ml/minPTV注射器80-280℃，在15℃/s檢測器基礎(chǔ)溫度:320℃?，F(xiàn)在可以將測得的12-羥基月桂酸甲酯的形成速率轉(zhuǎn)化成生物催化劑的活性，并與使用的細胞團相關(guān)聯(lián)。在反應動力學的線性范圍內(nèi)，由下式給出活性：活性[U]=轉(zhuǎn)化的物質(zhì)的量[μmol]/時間[min]常規(guī)地用于描述酶的單位“U”是，這樣的生物催化劑在反應開始時的性能的度量。菌株起始活性[U/gCDW]W3110pBT101.82W3110pBT10_alkL48.6可以通過額外表達的alkL使所述起始活性增加了26.7倍。序列表<110>EvonikDegussaGmbH<120>使用alkL基因產(chǎn)物的生物催化的氧化方法<130>201000056<160>8<170>PatentIn3.4版<210>1<211>693<212>DNA<213>惡臭假單胞菌<220><221>AlkL<222>(1)..(693)<220><221>CDS<222>(1)..(693)<400>1atgagtttttctaattataaagtaatcgcgatgccggtgttggttgct48MetSerPheSerAsnTyrLysValIleAlaMetProValLeuValAla151015aattttgttttgggggcggccactgcatgggcgaatgaaaattatccg96AsnPheValLeuGlyAlaAlaThrAlaTrpAlaAsnGluAsnTyrPro202530gcgaaatctgctggctataatcagggtgactgggtcgctagcttcaat144AlaLysSerAlaGlyTyrAsnGlnGlyAspTrpValAlaSerPheAsn354045ttttctaaggtctatgtgggtgaggagcttggcgatctaaatgttgga192PheSerLysValTyrValGlyGluGluLeuGlyAspLeuAsnValGly505560gggggggctttgccaaatgctgatgtaagtattggtaatgatacaaca240GlyGlyAlaLeuProAsnAlaAspValSerIleGlyAsnAspThrThr65707580cttacgtttgatatcgcctattttgttagctcaaatatagcggtggat288LeuThrPheAspIleAlaTyrPheValSerSerAsnIleAlaValAsp859095ttttttgttggggtgccagctagggctaaatttcaaggtgagaaatca336PhePheValGlyValProAlaArgAlaLysPheGlnGlyGluLysSer100105110atctcctcgctgggaagagtcagtgaagttgattacggccctgcaatt384IleSerSerLeuGlyArgValSerGluValAspTyrGlyProAlaIle115120125ctttcgcttcaatatcattacgatagctttgagcgactttatccatat432LeuSerLeuGlnTyrHisTyrAspSerPheGluArgLeuTyrProTyr130135140gttggggttggtgttggtcgggtgctattttttgataaaaccgacggt480ValGlyValGlyValGlyArgValLeuPhePheAspLysThrAspGly145150155160gctttgagttcgtttgatattaaggataaatgggcgcctgcttttcag528AlaLeuSerSerPheAspIleLysAspLysTrpAlaProAlaPheGln165170175gttggccttagatatgaccttggtaactcatggatgctaaattcagat576ValGlyLeuArgTyrAspLeuGlyAsnSerTrpMetLeuAsnSerAsp180185190gtgcgttatattcctttcaaaacggacgtcacaggtactcttggcccg624ValArgTyrIleProPheLysThrAspValThrGlyThrLeuGlyPro195200205gttcctgtttctactaaaattgaggttgatcctttcattctcagtctt672ValProValSerThrLysIleGluValAspProPheIleLeuSerLeu210215220ggtgcgtcatatgttttctaa693GlyAlaSerTyrValPhe225230<210>2<211>230<212>PRT<213>惡臭假單胞菌<400>2MetSerPheSerAsnTyrLysValIleAlaMetPro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