Alk融合基因檢測的pcr引物、試劑盒和液相芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測ALK融合基因的PCR引物、試劑盒和液相芯片。所述液相芯片包括:PCR擴增引物;由tag序列和特異性引物組成的ASPE引物,所述特異性引物序列為:針對K15;DEL15A20的SEQ?ID?NO.12、針對K17;A20的SEQ?ID?NO.13、針對K9;A20的SEQ?IDNO.14、針對T6;A20的SEQ?ID?NO.15、和/或針對T3;A20的SEQ?ID?NO.16;微球。本發(fā)明所述的液相芯片具有非常好的信號-噪聲比,可一步完成5種融合亞型的擴增,且特異性引物具有非常好的特異性。
【專利說明】ALK融合基因檢測的PCR引物、試劑盒和液相芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域,涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù),具體的是涉及ALK融合基因檢測的的PCR引物、試劑盒和液相芯片。
技術(shù)背景
[0002]ALK基因位于染色體2p23位點,正常情況下人源的alk可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大小6222bp的mRNA,由29個外顯子構(gòu)成,編碼1620個氨基酸序列200KDa的I型穿膜蛋白ALK,該蛋白為一種受體酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase, RTK),是RTK胰島素超家族的成員。完整的ALK具有典型的RTK三部分結(jié)構(gòu),即胞外區(qū)、親脂性穿膜區(qū)和胞漿內(nèi)酪氨酸激酶。據(jù)文獻報道,ALK蛋白除在極少部分彌漫性大B細胞淋巴瘤中表達外,可在60%~85%的原發(fā)性系統(tǒng)性ALCL中表達,是原發(fā)性系統(tǒng)性ALCL相對特異的免疫表型特征。ALK在某些ALCL中的異常表達來源于不同的染色體易位,每個易位會產(chǎn)生不同的融合蛋白質(zhì),由配偶體的5’端和ALK酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域3’端融合得到。在大部分ALK融合基因中,ALK斷裂點位于第19內(nèi)含子內(nèi),在mRNA上,斷裂點一般位于第20個外顯子的第一個核苷酸上。
[0003]目前,與ALK相關(guān)的融合基因,除了發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因之外,又發(fā)現(xiàn)了KIF5B-ALK.,KLCl-ALK和TFG-ALK融合基因。在腺癌患者檢測中發(fā)現(xiàn)了兩種KIF5B-ALK基因融合亞型,K15;DEL15A20 和 K17;A20。
[0004]KLCl-ALK融合基因也許并不多見,但是該融合基因在肺腺癌中確實存在。KLCl與ALK基因發(fā)生融合,與ALK基因發(fā)生t (2; 14) (p23;q32.3)易位產(chǎn)生KLCl-ALK融合基因。這兩個基因之間,形成框內(nèi)基因 融合。完整KLCl-ALK cDNA可能產(chǎn)生的具有984個氨基酸的蛋白質(zhì),包含KLCl基因三分之二的氨基末端和ALK基因細胞內(nèi)區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn),具有這個融合基因的病人極可能受益于ALK抑制劑治療。另外,KLCl-ALK融合基因從腺癌(原發(fā)生位置細支氣管肺泡癌)中被發(fā)現(xiàn)。而細支氣管肺泡癌很少發(fā)現(xiàn)KLCl-ALK融合基因,從病理學(xué)角度出發(fā),大規(guī)模檢測細支氣管肺泡癌個體以及對ALK融合基因癌前情況,這是非常有意義的。
[0005]在非小細胞肺癌(NSCLC)中,Rikova等研究發(fā)現(xiàn)了 TFG-ALK融合基因,這個融合基因有兩種異位的變異型:最近證實為t (2 ;3) (p23;q35)和inv (2) (p23q25),兩種不同的融合蛋白 85kDa (TFG-ALK 短的)和 97kDa (TFG-ALK 長的)是與 t (2 ;3) (p23 ;q25)有關(guān),這種包括TFG (TRF融合基因),inv (2) (p23q25)包括ATIC基因(以前稱為pur_T),是轉(zhuǎn)錄ATIC,其在嘌呤生物合成通路上起著重要作用。
[0006]目前,針對ALK融合基因的研究大部分采用RT-PCR方法以及非放射性同為雜交FISH方法進行檢測。RT-PCR方法是針對已知的ALK融合基因的類型以及融合方式來設(shè)計引物,將RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后,通過PCR擴增目的片段的方式來進行檢測,則存在靈敏度低,樣品易污染、假陽性率高的缺點。非放射性原位雜交技術(shù)FISH法的原理是設(shè)計與被檢測的ALK融合基因同源互補的核酸探針,二者經(jīng)過變性一退火一復(fù)性,即可形成KALK融合基因的DNA與核酸探針的雜交體。用報告分子(如生物素等)標(biāo)記核酸探針的某一種核酸,可利用該報告分子與熒光素標(biāo)記的特異性堿基之間的免疫化學(xué)反應(yīng),經(jīng)熒光檢測體系的鏡下對待測DNA進行定性以及相對定位分析。盡管該法較為直觀,但是試驗過程過于繁瑣,需要的試劑種類繁多,費時費力,且試驗結(jié)果需要經(jīng)驗豐富的專家來判讀,結(jié)果判讀存在較大的主觀性,而且其只能檢出融合基因是否存在,不能準(zhǔn)確得出具體的融合類型,且靈敏性較低,因而一定程度上限制了該法的應(yīng)用。鑒于各種融合基因(如ALK融合基因)的表達產(chǎn)物對癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要作用,因此,本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)更為實用的融合基因檢測方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測ALK融合基因的PCR引物,所述PCR引物可用于單獨或并行檢測KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因的5種基因融合亞型:KIF5B-ALK 的 K15;DEL15A20、K17;A20 ;KLC1-ALK 的 K9;A20 ;TFG-ALK 的 T6;A20、T3;A20。
[0008]實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:
[0009]一種檢測ALK融合基因的PCR引物,所述PCR引物為:針對K15; DEL15A20的SEQIDN0.1 和 SEQ ID N0.2、針對 K17;A20 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.3、針對 K9;A20 的 SEQIDN0.1 和 SEQ ID N0.4、針對 T6;A20 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.5、和 / 或針對 T3;A20的 SEQID N0.1 和 SEQ ID N0.6。
[0010]本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測ALK融合基因的PCR試劑盒。
[0011]實現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下:
[0012]一種檢測ALK融合基因的PCR試劑盒,包括有上述的PCR引物。
[0013]在其中一個實施例`中,所述PCR試劑盒還包括有陽性對照品,所述陽性對照品為:針對K15;DEL15A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.2反向互補配對的序列的核酸片段、針對K17;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.3反向互補配對的序列的核酸片段、針對K9;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.4反向互補配對的序列的核酸片段、針對T6;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.5反向互補配對的序列的核酸片段、和/或針對T3;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.6反向互補配對的序列的核酸片段。更優(yōu)選地,所述陽性對照品為針對K15;DEL15A20的SEQ ID N0.7、針對K17;A20的SEQ ID N0.8、針對 K9;A20 的 SEQID N0.9、針對 T6;A20 的 SEQ ID N0.10、和 / 或針對 T3;A20 的 SEQ IDN0.11。
[0014]本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測ALK融合基因的液相芯片。
[0015]實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:
[0016]—種檢測ALK融合基因的液相芯片,包括有:
[0017](A)上述 PCR 引物;
[0018](B).針對ALK融合基因不同融合類型分別設(shè)計的ASPE引物:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的融合類型的特異性引物序列組成,所述特異性引物序列為:針對 K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.12、針對 K17; A20 的 SEQ ID N0.13、針對 K9; A20 的 SEQIDN0.14、針對 T6;A20 的 SEQ ID N0.15、和 / 或針對 T3;A20 的 SEQ ID N0.16 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.17—SEQ ID N0.26 ;
[0019](C).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列;所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.27—SEQ ID N0.36,且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(B)中所選的tag序列互補配對。
[0020]在其中一個實施例中,所述ASPE引物為:針對K15;DEL15A20的由SEQ ID N0.17和SEQID N0.12組成的序列、針對K17;A20的由SEQ ID N0.18和SEQ ID N0.13組成的序列、針對K9;A20的由SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.14組成的序列、針對T6; A20的由SEQID N0.20 和 SEQ ID N0.15 組成的序列、和 / 或針對 T3;A20 的由 SEQ ID N0.21 和 SEQ IDN0.16組成的序列。
[0021]本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測ALK融合基因的特異性引物。
[0022]具體技術(shù)方案如下:
[0023]一種用于檢測ALK融合基因的特異性引物,所述特異性引物為:針對K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.12、針對 K17;A20 的 SEQ ID N0.13、針對 K9;A20 的 SEQ IDN0.14、針對 T6;A20 的 SEQ ID N0.15、和 / 或針對 T3;A20 的 SEQ ID N0.16。
[0024]本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:
[0025]1、本發(fā)明所提供的ALK融合基因檢測液相芯片與測序法的吻合率高達100%。
[0026]2、本發(fā)明的檢測液相芯片步驟簡單,使用逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板,通過嚴格篩選的PCR引物,通過一步PCR即可完成含有5種KIF5B-ALK、KLC1-ALK、TFG-ALK融合基因亞型的目標(biāo)序列的擴增,避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素,因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率,體現(xiàn)了精確的定性分析特征。
[0027]3、本發(fā)明的檢測試劑盒使用含有目標(biāo)檢測融合亞型序列的質(zhì)粒載體作為陽性對照品,進一步保證了檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。
[0028]4、本發(fā)明所制備的KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因的液相芯片具有非常好的信號-噪聲比,所設(shè)計的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng),同時,本發(fā)明設(shè)計的ASPE型特異性引物具有非常好的特異性,能準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的融合基因亞型。
[0029]5、本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時間遠遠低于常用的測序技術(shù),特別符合實際應(yīng)用的需要。
[0030]6、本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高,檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷,同時對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進行改進,使得所制備微球能適用于不同的檢測項目,具有很強的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高,從而使得檢測的靈敏度進一步得到提高,信噪比增強,檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
[0031]說明書附圖
[0032]圖1是實施例2中PCR擴增的組I的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖片。
【具體實施方式】
[0033]本發(fā)明實施例中未說明的常規(guī)條件和方法,按照本領(lǐng)域技術(shù)人員采用的常規(guī)方法來進行,如《分子克隆實驗指南》第三版,或按照生產(chǎn)廠商所提供的操作方法來實施。
[0034]實施例1 一 種檢測ALK融合基因的融合基因檢測的PCR引物和陽性對照品
[0035]一、RT-PCR 擴增
[0036]1、逆轉(zhuǎn)錄[0037]針對各種目標(biāo)檢測的KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因亞型,本發(fā)明先使用隨機引物對目標(biāo)檢測樣本進行逆轉(zhuǎn)錄,將樣本中mRNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA,具體實驗步驟參照《分子克隆實驗指南》,使用隨機引物進行mRNA的反轉(zhuǎn)錄為常規(guī)操作步驟。
[0038]2、PCR 擴增
[0039]表1中的融合類型為本發(fā)明目標(biāo)檢測的5種ALK融合基因亞型,根據(jù)該融合基因序列的核酸組成特征,利用Primer5.0設(shè)計正向引物和反向引物。使用步驟I所得的cDNA作為模板,對5種目標(biāo)檢測融合基因亞型進行并行擴增。
[0040]所有引物由Invitrogen公司合成。合成后的每條引物分別用10mmol/L TrisBuffer配制成300pmol/mL的忙存液。
[0041]其中,K9;A20表示KLCl基因的外顯子9和ALK基因的外顯子20發(fā)生融合。
[0042]表1KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因亞型擴增引物
融介祛產(chǎn)物大
融介類鹽il-浪引物 (5.-3,)反N引物(5.- 30
H+ (bp)
K15-DEL1GAATCAGAAATCGGCAA
+233
KIF5B- 5A20CTTTA`G ( SEQID N0.2)
ALKCGTATCTCTCAACATGAA
Κ17;Α20 220
GCCAAA (SEQ ID N0.3 )
[0043]----
KI C' 1-4ATAACCTGGCATCCTGCT TGGTCG AGGTG
K9;A20 198
LKATT (SEQIDN0.4)CGGAGCTT
TCCTCAGCAGCTCACCC (SEQ ID N0.1)
T6;A20172
TFG-ALAC (SEQ 丨D N0.5)
KTTGATAGTTCTGACCTTT
T3;A20153
CCTTTGC ( SEQIDN0.6)
[0044]二、陽性對照品
[0045]本發(fā)明根據(jù)目標(biāo)檢測ALK融合基因的5種亞型的融合序列特征,設(shè)計核酸片段作為檢測的陽性對照品,該陽性對照品為含有表1中擴增引物的正向引物和與反向引物反向互補配對的序列的核酸片段,其正向引物和反向引物反向互補配對的序列之間的核酸片段可以是人類基因組序列,也可以是來源于植物、微生物等非人源的核酸序列,且所合成的陽性對照品的片段大小與表1中相應(yīng)的目標(biāo)檢測融合類型的擴增產(chǎn)物大小一致,從而實現(xiàn)在擴增過程中陽性對照的作用,同時,實現(xiàn)其它的實驗?zāi)康?例如:當(dāng)使用來源于植物、微生物等非人源的核酸序列時,可以避免陽性對照品中人類基因組序列對其它檢測樣本的陽性污染等。)
[0046]本發(fā)明檢測方法中,針對各種目標(biāo)檢測融合基因亞型,采用插入相應(yīng)人類基因組序列作為陽性對照品。具體見表2中的SEQ ID N0.7~SEQ ID N0.11,委托金唯智生物科技(北京)有限公司進行目標(biāo)插入序列的合成,將經(jīng)過純化的合成序列插入到PMD18-T載體上,然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中,通過藍白斑篩選,構(gòu)建目標(biāo)檢測的5種ALK融合基因亞型重組質(zhì)粒DNA作為陽性對照品。構(gòu)建的5種重組質(zhì)粒經(jīng)雙向DNA測序鑒定正確。提取質(zhì)粒,紫外分光光度計定量,稀釋至5.0X 101°拷貝/毫升于-20° C保存。
[0047]表2KIF5B-ALK、KLC1-ALK, TFG-ALK融合基因亞型陽性對照質(zhì)粒的插入序列
【權(quán)利要求】
1.一種檢測ALK融合基因的PCR引物,其特征是,所述PCR引物為:針對K15; DEL15A20的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2、針對 K17; A20 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ IDN0.3、針對 K9; A20的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.4、針對 T6;A20 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ IDN0.5、和 / 或針對T3;A20 的 SEQ ID N0.1和 SEQ ID N0.6。
2.一種檢測ALK融合基因的PCR試劑盒,其特征是,包括有權(quán)利要求1所述的PCR引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PCR試劑盒,其特征是,所述PCR試劑盒還包括有陽性對照品,所述陽性對照品為:針對K15;DEL15A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.2反向互補配對的序列的核酸片段、針對K17;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.3反向互補配對的序列的核酸片段、針對K9;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.4反向互補配對的序列的核酸片段、針對T6;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.5反向互補配對的序列的核酸片段、和/或針對T3;A20的含有SEQ ID N0.1和與SEQ ID N0.6反向互補配對的序列的核酸片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的PCR試劑盒,其特征是,所述陽性對照品為針對K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.7、針對K17; A20 的 SEQ ID N0.8、針對K9; A20 的 SEQ ID N0.9,針對 T6;A20 的 SEQ ID N0.10、和 / 或針對 T3; A20 的 SEQ ID N0.11。
5.—種檢測ALK融合基因的液相芯片,其特征是,包括有: (A)權(quán)利要求1所述的PCR引物; (B).針對ALK融合基因不同融合類型分別設(shè)計的ASPE引物:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的融合類型的特異性引物序列組成,所述特異性引物序列為:針對 K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.12、針對 K17;A20 的 SEQ ID N0.13、針對 K9;A20 的 SEQIDN0.14、針對 T6;A20 的 SEQ ID N0.15、和 / 或針對 T3;A20 的 SEQ ID N0.16 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.17-SEQ ID N0.26 ; (C).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列;所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.27-SEQ ID N0.36,且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(B)中所選的tag序列互補配對。
6.根據(jù)權(quán)要求5所述的液相芯片,其特征是,所述ASPE引物為:針對K15;DEL15A20的由 SEQ ID N0.17 和 SEQ ID N0.12 組成的序列、針對 K17;A20 的由 SEQ ID N0.18 和 SEQIDN0.13組成的序列、針對K9;A20的由SEQ ID N0.19和SEQ ID N0.14組成的序列、針對T6;A20的由SEQ ID N0.20和SEQ ID N0.15組成的序列、和/或針對T3;A20的由SEQ IDN0.21和SEQID N0.16組成的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的液相芯片,其特征是,所述間隔臂為5-10個T。
8.一種用于檢測ALK融合基因的特異性引物,其特征是,所述特異性引物為:針對 K15;DEL15A20 的 SEQ ID N0.12、針對 K17; A20 的 SEQ ID N0.13、針對 K9;A20 的 SEQIDN0.14、針對 T6;A20 的 SEQ ID N0.15、和 / 或針對 T3;A20 的 SEQ ID N0.16。
【文檔編號】C12Q1/68GK103805687SQ201210448636
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月9日
【發(fā)明者】陳昌華, 陳菲, 許昌有 申請人:益善生物技術(shù)股份有限公司