一種釀酒酵母菌菌株及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種能直接利用大豆糖蜜進(jìn)行發(fā)酵的釀酒酵母菌（Saccharomyces?cerevisiae）菌株及其應(yīng)用。該釀酒酵母菌能有效降解大豆糖蜜中的抗?fàn)I養(yǎng)因子包括棉籽糖和水蘇糖，提高大豆糖蜜在飼料中的添加量，并且發(fā)酵過程不需要稀釋大豆糖蜜，不需要對底物進(jìn)行滅菌，也不需要進(jìn)行成分調(diào)整，從而大大簡化了發(fā)酵工藝并降低成本。
【專利說明】一種釀酒酵母菌菌株及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)菌株及應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及一種能直接利用大豆糖蜜而無需經(jīng)過滅菌、稀釋和成分調(diào)整處理的菌株釀酒酵母菌，以及利用該菌株以大豆糖蜜為唯一的發(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆糖蜜是以大豆為原料生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白過程中得到的純天然副產(chǎn)品。生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白的方法包括酸提、醇提等，最終得到的可溶性物質(zhì)即是大豆糖蜜。其外觀呈棕黃色粘稠液狀，有特殊清香味，味甘、微苦，因富含糖類物質(zhì)，呈流動性，所以命名為大豆糖蜜。其主要成分含量為:粗蛋白質(zhì)(大豆乳清蛋白)5%-8%，碳水化合物50%-55%，蔗糖15%-20%，單糖5-10%，大豆低聚糖15%-20%，水蘇糖+棉籽糖10%-15%，大豆異黃銅2%_4%，總脂類及磷脂5%-8%，灰份(主要是P3+、Ca2+、Mg2+、K+、Fe2+) 4%左右，固型物60%左右。其中，以上指標(biāo)只是對大豆糖蜜作出的含量表述，大豆糖蜜的定義并不是通過以上含量來定義的，它只是生產(chǎn)大豆?jié)饪s蛋白過程中，醇溶部分物質(zhì)后，剩余部分經(jīng)過濃縮處理后的產(chǎn)品，因其富含糖類物質(zhì)，顏色和流動性類似蜂蜜，所以命名為大豆糖蜜。
[0003]大豆糖蜜中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，含大豆異黃酮、大豆低聚糖、大豆乳清蛋白、蔗糖、單糖及大豆中原有的水溶性礦物元素等。大豆糖蜜價格低廉，可用來提取大豆異黃銅、大豆低聚糖等。同時，它又是酵母等微生物發(fā)酵的良好營養(yǎng)物質(zhì)，可用作微生物的培養(yǎng)基。鑒于以上優(yōu)點，可利用微生物對大豆糖蜜進(jìn)行發(fā)酵，用來合成或降解目標(biāo)物。
[0004]此外，大豆糖蜜作為一種天然副產(chǎn)物，具有豐富的營養(yǎng)成分和一定的礦物元素，還可用作飼料添加劑。結(jié)合微生物發(fā)酵方法對大豆糖蜜進(jìn)行處理，一方面大豆糖蜜中的營養(yǎng)成分得到充分利用，一方面微生物也可為動物提供單細(xì)胞蛋白、維生素等物質(zhì)，并調(diào)節(jié)動物體內(nèi)微生態(tài)平衡，增強(qiáng)動物的防病抗病能力，提高動物的生長性能。微生物細(xì)胞中含有豐富的蛋白質(zhì)，單細(xì)胞蛋白則是指從單細(xì)胞生物的純培養(yǎng)基或混合培養(yǎng)基中提取得到的總蛋白或者微生物細(xì)胞其本身。微生物所含的營養(yǎng)物質(zhì)極為豐富，除蛋白質(zhì)外，還含有豐富的碳水化合物、脂類、維生素及礦物質(zhì)。用單細(xì)胞蛋白作為蛋白飼料喂養(yǎng)家禽、家畜，不僅產(chǎn)率高,還能增強(qiáng)禽畜機(jī)體免疫力。
[0005]這樣的方法已經(jīng)在例如，高玉榮等人申請的中國專利CN201010292389.3中公開，其中利用熱帶假絲酵母CGMCC2.587和益生性乳酸菌嗜酸乳桿菌CGMCC1.1854，其通過大豆糖蜜的除雜、成分調(diào)整、滅菌、兩段發(fā)酵、離心和干燥來生產(chǎn)益生性單細(xì)胞蛋白飼料，大豆糖蜜的用量為百分比濃度15-20%，并輔配一些其他營養(yǎng)物質(zhì)。
[0006]然而，大豆糖蜜雖然營養(yǎng)豐富、價格低廉，但其通常不能直接用作飼料而且添加量有一定限制。這主要是受保存期和抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響。抗?fàn)I養(yǎng)因子通過干擾營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、破壞正常的新陳代謝和引起動物不良的生理反應(yīng)等多種方式危害動物尤其是幼齡動物的生長和健康。其中，大豆低聚糖是抗?fàn)I養(yǎng)因子的主要成分之一，其是大豆中可溶性糖的總稱，包括棉籽糖和 水蘇糖等。大量的低聚糖在動物體內(nèi)不能被消化，經(jīng)微生物分解產(chǎn)生氣體，造成動物脹氣、消化不良。
[0007]因此，希望研究出一種方法，能夠有效降低大豆糖蜜中的低聚物尤其是棉籽糖和水蘇糖的含量，從而能夠提高大豆糖蜜在飼料中的添加量，降低飼料成本。目前通常常用的一種方法是利用ct -半乳糖苷酶來水解棉籽糖和水蘇糖。例如，Ang6lica Pataro Reis等人報道了利用土曲霉(Aspergillus Terreus)產(chǎn)生的半乳糖苷酶和轉(zhuǎn)化酶,來水解大豆糖蜜的低聚半乳糖(Ang6lica Pataro Reis, Valeria Monteze Guimaraes.Hydrolysisof Galacto-oligosaccharides in Soy Molasses by a -galactosidases and Invertasefrom Aspergillus terreus[J].BARZILIANARCHIVES OF BIOLOGYAND TECHNOLOGY,2010，53(3):719-729)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]待解決的技術(shù)問題
[0009]然而，為了保證微生物的良好生長，通常需要對發(fā)酵底物進(jìn)行稀釋、滅菌、成分調(diào)整等處理，致使整體工序復(fù)雜化。此外，由于用于發(fā)酵的設(shè)備需要具有耐壓耐酸堿等特性，在發(fā)酵過程中還需要監(jiān)測發(fā)酵條件的各種參數(shù)，使得運轉(zhuǎn)成本也大大增加。
[0010]迄今為止，關(guān)于釀酒酵母菌直接以原始濃度的大豆糖蜜不經(jīng)稀釋、發(fā)酵且不經(jīng)過成分調(diào)整而作為唯一的發(fā)酵原料，來降解大豆糖蜜中的抗?fàn)I養(yǎng)因子(棉籽糖、水蘇糖)的含量，從而提高大豆糖蜜在飼料中的添加比例的方法報道在國內(nèi)外文獻(xiàn)中還未發(fā)現(xiàn)。因此，尋找一種能有效分解大豆糖蜜中的低聚糖、并且發(fā)酵工藝簡單的菌株仍是需要解決的問題。
[0011]解決方案
[0012]本發(fā)明人進(jìn)行了廣泛的研究以實現(xiàn)上述目的。根據(jù)研究，本發(fā)明有以下發(fā)現(xiàn)。
[0013]本發(fā)明通過從大豆糖蜜中進(jìn)行菌株分離、培養(yǎng)，獲得一株能直接利用純大豆糖蜜的非工程菌野生釀酒酵母菌(Saccharomyc`escerevisiae)WBRD2.12052301,已于 2012 年 06月01日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號為=CGMCC N0.6183。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該釀酒酵母菌能夠快速發(fā)酵，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生較高含量的生物蛋白。而且，該釀酒酵母菌可以以純大豆糖蜜為唯一的發(fā)酵原料，快速降解大豆糖蜜中的低聚糖(主要是棉籽糖、水蘇糖)的含量，富集單細(xì)胞蛋白。此法處理的大豆糖蜜，解決了大豆糖蜜在飼料應(yīng)用中因抗?fàn)I養(yǎng)因子(棉籽糖、水蘇糖)含量高而導(dǎo)致的添加量受限的問題，提升了大豆糖蜜在飼料應(yīng)用中的蛋白含量?；谝陨习l(fā)現(xiàn)完成本發(fā)明。
[0014]一方面，本發(fā)明提供一種釀酒酵母菌WBRD2.12052301，其中所述釀酒酵母菌WBRD2.12052301于2012年06月01日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號為:CGMCC N0.6183。
[0015]再一方面，本發(fā)明提供包含釀酒酵母菌WBRD2.12052301所產(chǎn)生蛋白的蛋白組合物。該蛋白組合物可以來源于上述從釀酒酵母菌WBRD2.12052301的細(xì)胞破碎物中或從含有所述釀酒酵母菌的培養(yǎng)基中分離得到。其中，釀酒酵母菌的細(xì)胞破碎物可通過，例如超聲破碎、向酵母菌添加裂解液來獲得。此外，蛋白組合物中也可以含有該酵母菌所產(chǎn)生的一種或多種蛋白以及其它非酵母菌產(chǎn)生的物質(zhì)。
[0016]再一方面，本發(fā)明還提供一種分解水蘇糖和/或棉籽糖的方法，所述方法利用釀酒酵母菌WBRD2.12052301或包含該酵母菌所產(chǎn)生蛋白的蛋白組合物來分解底物中的水蘇糖和/或棉籽糖。該底物可以是任何含有水蘇糖和/或棉籽糖的物質(zhì)，例如，但不限于大豆糖蜜。根據(jù)此方法，也可利用本發(fā)明的釀酒酵母菌WBRD2.12052301或上述的蛋白組合物同時分解棉籽糖和水蘇糖。
[0017]再一方面，本發(fā)明還提供一種發(fā)酵方法，該方法使用釀酒酵母菌WBRD2.12052301進(jìn)行發(fā)酵。具體而言，該發(fā)酵方法中的底物中可含有低聚糖，比如棉籽糖、水蘇糖或其二者。進(jìn)一步，該發(fā)酵方法中的底物中可以含有大豆糖蜜。在一個具體的實施方式中，該發(fā)酵方法中的底物可以是大豆糖蜜。
[0018]具體而言，本發(fā)明的發(fā)酵方法可包括以下步驟:
[0019]I)菌株的活化。將釀酒酵母菌WBRD2.12052301接種到培養(yǎng)基中或者培養(yǎng)基上，于一定溫度下恒溫培養(yǎng)。其中菌株活化的溫度優(yōu)選為28°C，但不限于此。其中用于活化菌株的培養(yǎng)基可以是，例如固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基可以是，例如斜面培養(yǎng)基，但不限于此。培養(yǎng)基的配方可以根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員掌握的技術(shù)來進(jìn)行選擇。在本發(fā)明的一個實施方式中，培養(yǎng)基組成可包括(單位1L):麥芽汁粉130g，瓊脂粉10-20g，用蒸餾水定容至1L。
[0020]2)種子液的制備。對活化的菌株進(jìn)行初步的擴(kuò)大培養(yǎng)。其中制備種子液的溫度優(yōu)選為28°C，但不限于此。其中，用于制備種子液的培養(yǎng)基優(yōu)選為液體培養(yǎng)基，但不限于此。進(jìn)一步地，液體種子液培養(yǎng)基的組成在一個實施方式中如下所示(單位1L):蔗糖25g，葡萄糖25g,蛋白胨IOg,魚蛋白胨5g,玉米衆(zhòng)膏Ig,磷酸二氫鉀3g,硫酸鎂0.5g。
[0021]3)接種并開始發(fā)酵。按照一定比例將種子液接種到培養(yǎng)基中開始進(jìn)行發(fā)酵。
[0022]示例性地，可用大豆糖蜜作為本發(fā)明的發(fā)酵底物。并且，可以不對大豆糖蜜進(jìn)行滅菌，也可以不用為了適合菌株生長而對大豆糖蜜進(jìn)行PH調(diào)節(jié)，此外，還可以不對用于發(fā)酵的大豆糖蜜進(jìn)行稀釋。
[0023]盡管本發(fā)明沒有具體描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員也可想到，豆柏與大豆糖蜜同樣是以大豆生產(chǎn)濃縮蛋白的過程中得到的產(chǎn)物，豆柏與大豆糖蜜具有相似的組成，其都含有水蘇糖、棉籽糖，并且都因為這兩種物質(zhì)的存在會在用于飼料用途時引起動物脹氣。因此，本發(fā)明還可涉及利用本發(fā)明的釀酒酵母菌WBRD2.12052301對豆柏進(jìn)行發(fā)酵的方法，以及相應(yīng)的應(yīng)用。
[0024]在該發(fā)酵過程中，可以按照實際情況的需要，選擇對底物進(jìn)行滅菌或不進(jìn)行滅菌。在該發(fā)酵過程中，可以按照實際情況的需要，對底物進(jìn)行稀釋或不對底物進(jìn)行稀釋。在該發(fā)酵過程中，可以根據(jù)酵母菌的最適生長條件，比如PH、溫度等來設(shè)置發(fā)酵參數(shù)。例如，對底物進(jìn)行組分調(diào)整?；蛘?，也可以不對底物進(jìn)行組分調(diào)整。
[0025]本發(fā)明還涉及在利用本發(fā)明的酵母菌WBRD2.12052301對可發(fā)酵底物進(jìn)行發(fā)酵的過程中所產(chǎn)生的發(fā)酵組合物。比如，該可發(fā)酵底物可以是大豆糖蜜，發(fā)酵組合物中可以含有,例如乙醇。此外,該組合物中可包括蛋白。進(jìn)一步地，該蛋白可包括單細(xì)胞蛋白。
[0026]示例而言，發(fā)酵組合物可以是單細(xì)胞蛋白組合物，其中所述單細(xì)胞蛋白組合物包括進(jìn)行過發(fā)酵的釀酒酵母菌WBRD2.12052301。
[0027]在一些情況下，本發(fā)明的發(fā)酵組合物可用于飼料。具體而言，利用本發(fā)明的酵母菌WBRD2.12052301進(jìn)行發(fā)酵而得到的發(fā)酵組合物可直接用作飼料或者與其它物質(zhì)結(jié)合用作飼料。因此，本發(fā)明還可涉及一種飼料，其中該飼料含有利用本發(fā)明的酵母菌對可發(fā)酵底物進(jìn)行發(fā)酵而產(chǎn)生的發(fā)酵組合物。再者，本發(fā)明還可涉及本發(fā)明的酵母菌WBRD2.12052301在制備飼料中的用途。利用本發(fā)明的酵母菌制備飼料的具體步驟在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)，并可以參考現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行具體實施。比如，發(fā)酵大豆糖蜜的制備及在配合資料中的添加方法可以如圖1進(jìn)行。
[0028]
[0029]向大豆糖蜜中添加本發(fā)明的酵母菌WBRD2.12052301進(jìn)行發(fā)酵，所得的發(fā)酵產(chǎn)物中的抗?fàn)I養(yǎng)成分棉籽糖和水蘇糖可以得到有效降低，由此，可提高飼料中大豆糖蜜的添加比例，降低成本。因此，本發(fā)明還涉及一種提高飼料中的大豆糖蜜的添加比例的方法，其中所述方法包括向飼料中添加釀酒酵母菌WBRD2.12052301的步驟。
[0030]本文的可發(fā)酵底物是指可為本發(fā)明的釀酒酵母菌WBRD2.12052301所利用而進(jìn)行發(fā)酵的底物。其可以含有棉籽糖、水蘇糖或其二者。具體而言，可以利用含有棉籽糖、水蘇糖或其二者的底物進(jìn)行發(fā)酵。以棉籽糖為例，棉籽糖存在于許多富含碳水化合物的植物中，其在大豆、豌豆、扁豆中作為能量供給物質(zhì)。其還存在于谷物(小麥和黑麥等)和綠葉蔬菜比如卷心菜、蘆笑、朝鮮薊(artichokes)、抱子甘藍(lán)(brussel sprouts)和球花甘藍(lán)中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)實際需要選擇性地利用這些植物進(jìn)行發(fā)酵。此外，盡管本發(fā)明沒有具體示例，但也可利用含有棉籽糖的其它植物進(jìn)行發(fā)酵。
[0031]一方面，通過使用含有釀酒酵母菌WBRD2.12052301的酵母菌對可發(fā)酵底物進(jìn)行發(fā)酵的過程中產(chǎn)生的發(fā)酵組合物中可含有醇。在一個示例性實施方式中，所產(chǎn)生的組合物中含有乙醇。
[0032]此外，本發(fā)明還提供通過發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)物的方法，該方法包括提供可發(fā)酵底物和釀酒酵母菌WBRD2.12052301，并使該酵母菌在底物的存在下進(jìn)行發(fā)酵而產(chǎn)生產(chǎn)物。該方法還可進(jìn)一步包括將所產(chǎn)生的產(chǎn)物分離出來的步驟。所產(chǎn)生的產(chǎn)物并不具體限定，其可以是蛋白，也可以是由發(fā)酵底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的物質(zhì)。例如，通過該方法得到的產(chǎn)物可以是單細(xì)胞蛋白，也可以是醇比如乙醇。例如，本發(fā)明可提供一種生產(chǎn)乙醇的方法，其中該方法利用釀酒酵母菌WBRD2.12052301進(jìn)行發(fā)酵。具體而言，可以利用大豆糖蜜為發(fā)酵底物，從而生產(chǎn)乙醇。`
[0033]本發(fā)明的效果
[0034]本發(fā)明的優(yōu)點在于，本發(fā)明的釀酒酵母WBRD2.12052301可以大豆糖蜜為唯一的發(fā)酵原料，原料不需要稀釋、不需要滅菌，不需要成分調(diào)整，可直接利用其有效成分，生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。工藝簡單、方法便捷，利于操作處理。
[0035]本發(fā)明的另一優(yōu)點在于釀酒酵母WBRD2.12052301解決了大豆糖蜜在飼料應(yīng)用中由于抗?fàn)I養(yǎng)因子導(dǎo)致的添加量受限問題。具體而言，根據(jù)中國飼料信息網(wǎng)飼料研究中介紹中說明大豆糖蜜在各種養(yǎng)殖動物中的少量的添加具有正向效果，其添加比例為:家禽飼料中添加5-10% ;奶牛飼料中添加10-20% ;魚飼料中添加3-5% ;豬飼料中添加3-5%，受添加限制的因素主要取決于大豆糖蜜中的抗?fàn)I養(yǎng)因子(棉籽糖、水蘇糖)的高含量。而利用本發(fā)明的釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，一方面利用了大豆糖蜜成本低且營養(yǎng)豐富的優(yōu)點，同時也不會因其本身的高含量抗?fàn)I養(yǎng)子而影響動物的吸收。經(jīng)驗證，利用本發(fā)明的酵母菌發(fā)酵過的大豆糖蜜在飼料中的添加量可提高一倍。
[0036]釀酒酵母WBRD2.12052301可以高效快速的降解大豆糖蜜中的棉籽糖、水蘇糖。由此可有效地提高大豆糖蜜在飼料中的添加比例，并且發(fā)酵過程中產(chǎn)生的芳香類物質(zhì)又可以提高其在飼料中的適口性和誘食性。
[0037]本發(fā)明的優(yōu)點還在于釀酒酵母WBRD2.12052301直接發(fā)酵大豆糖蜜可以得到含量較高的單細(xì)胞蛋白。將發(fā)酵產(chǎn)物添加到飼料中可以增加飼料中的蛋白含量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]現(xiàn)在將參考本發(fā)明的附圖所圖示的某些示例性實施方式來詳細(xì)地描述本發(fā)明的上述和其它特征，下文給出的這些實施方式僅僅用于示例說明，因此不是對本發(fā)明的限制，其中:
[0039]圖1為發(fā)酵大豆糖蜜的制備及在配合資料中的添加方法的示例性方法。
[0040]圖2為釀酒酵母菌WBRD2.12052301的顯微鏡形態(tài)照片(1000X )。
[0041]圖3為釀酒酵母菌WBRD2.12052301的菌落形態(tài)照片。
圖4為釀酒酵母菌WBRD2.12052301的基因鑒定序列(SEQ:1D:NO:1序列)。
【具體實施方式】
[0042]下面將參照附圖詳細(xì)地描述本發(fā)明的示例性實施方式，以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠容易地實施本發(fā)明。盡管將結(jié)合示例性實施方式描述本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解，本說明書無意將本發(fā)明局限于這些示例性實施方式。相反，本發(fā)明不僅要涵蓋這些示例性實施方式，還要涵蓋由權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種替代形式、修改、等效形式和其它實施方式。
[0043]在本發(fā)明的上下文中`，除非明確有相反說明，術(shù)語“包括”和例如“包含”的變形可理解為表示包含了所述的組分或成分，但是并非不排除任何其它的組分或成分。并且該術(shù)語是開放式的，允許有列舉之外的對象存在，只要所述的基本的或新的特征沒有被所列舉之外的對象的存在而改變，但排除現(xiàn)有技術(shù)的實施方式。
[0044]在本發(fā)明的上下文中，只要是術(shù)語“菌株”涉及酵母菌，其包括種類潛在的遺傳變體或亞型；例如，從特定地點及時采集的菌種分離株，或被確證為在核苷酸水平上與同種其他成員不一致的分離株。
[0045]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“發(fā)酵”是涉及微生物的生命活動的過程。進(jìn)一步地，“發(fā)酵”是指利用微生物生產(chǎn)代謝產(chǎn)物或分解有機(jī)物的過程。微生物是包括細(xì)菌、病毒、真菌以及一些小型的原生動物等在內(nèi)的一大類生物群體。本發(fā)明中的發(fā)酵主要是指利用酵母菌的發(fā)酵過程。
[0046]本文中，術(shù)語“可發(fā)酵底物”是指能為微生物所利用，比如作為能源物質(zhì)為微生物所利用或者其中含有可被微生物轉(zhuǎn)化的物質(zhì)。概括而言，參與微生物的代謝活動的各種物質(zhì)或其與其它物質(zhì)的組合物均可稱為可發(fā)酵底物?？砂l(fā)酵底物可以是，比如含有棉籽糖和/或水蘇糖的物質(zhì)，比如大豆糖蜜或豆柏，但不限于此。在一個具體的實施方式中，可發(fā)酵底物可以是大豆糖蜜。
[0047]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“發(fā)酵產(chǎn)物”包括發(fā)酵工藝中的任何產(chǎn)物，包括固體、液體或氣體產(chǎn)物。
[0048]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“培養(yǎng)基”是指適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基可包括天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基?？梢愿鶕?jù)需要配置不同的培養(yǎng)基來培養(yǎng)微生物。例如，在具體的發(fā)酵過程中使用的大豆糖蜜是適合本發(fā)明的釀酒酵母菌WBRD2.12052301生長的一種天然培養(yǎng)基。在菌種的活化中，又可配置如下成分的斜面培養(yǎng)基來培養(yǎng)本發(fā)明的釀酒酵母菌(單位1L):麥芽汁粉130g，瓊脂粉10-20g，用蒸餾水定容至1L，其中不對PH進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0049]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“工程菌”是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達(dá)的菌類細(xì)胞株。所述的菌類細(xì)胞株可稱為受體菌。在本發(fā)明中，受體菌可以是本發(fā)明的釀酒酵母菌而外源基因是從本發(fā)明的釀酒酵母菌以外的微生物中提取的基因?；蛘?，受體菌可以是本發(fā)明的釀酒酵母菌以外的微生物而外源基因來源于本發(fā)明的釀酒酵母菌。制備工程菌的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)，因此在本發(fā)明中并不具體敘述。
[0050]以下示例說明利用本發(fā)明的釀酒酵母菌進(jìn)行發(fā)酵的方法。
[0051]菌種的分離:
[0052]本發(fā)明的釀酒酵母菌是通過如下常規(guī)的過程獲得:將采集自益海(防城港)大豆工業(yè)有限公司存儲的大豆糖蜜樣品進(jìn)行菌種分離，篩分得到一株表面光滑、有白色脊?fàn)钔黄?、顯微鏡觀察菌體呈卵圓形的釀酒酵母菌，其18S rRNA堿基序列(SEQ:1D: NO:1序列，1716bp)見圖4所示。篩分方法參照文獻(xiàn)(高玉榮，劉洋等人報道了大豆糖蜜高產(chǎn)單細(xì)胞蛋白菌株的篩選及其生長條件[J].中國釀造，2010，8:33-36)
[0053]菌種的活化:
[0054]將分離得到的釀酒酵母菌WBRD2.12052301接種到斜面培養(yǎng)基上，于28°C恒溫培養(yǎng)1-2天，待菌體布滿斜面為宜，斜面培養(yǎng)基組成包括(單位1L):麥芽汁粉130g (OXOID有限責(zé)任公司)，瓊脂粉10-20g (阿拉丁工業(yè)有限公司)，用蒸餾水定容至1L，PH值不作調(diào)整。
[0055]種子液的制備:
[0056]從上述斜面中挑取一大環(huán)`菌絲體接種至滅菌后的液體種子培養(yǎng)基中，于28°C、220r/min恒溫培養(yǎng)20-24小時，菌濃度可以達(dá)到1~3X 108cfu/ml ;液體種子培養(yǎng)基組成包括(單位1L):蔗糖25g (上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，AR級)，葡萄糖25g (國藥集團(tuán)化學(xué)試齊陏限公司，AR級)，蛋白胨IOg (0X0ID有限責(zé)任公司)，魚蛋白胨5g (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，BR級)，玉米漿膏Ig (上?？犰`精細(xì)化學(xué)品有限公司，USP級)，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂0.5g，PH不作調(diào)整；將液體種子培養(yǎng)基于121°C滅菌20min后冷卻。
[0057]發(fā)酵階段:
[0058]將大豆糖蜜不做稀釋、也不做添加任務(wù)額外的物質(zhì)，按照糖蜜重量的20%接種上述種子液，在28°C恒溫發(fā)酵培養(yǎng)24小時。
[0059]實施例1:利用釀酒酵母菌WBRD2.12052301分解大豆糖蜜中的抗?fàn)I養(yǎng)因子
[0060]如上所述進(jìn)行菌種活化，制備種子液，并進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，對大豆糖蜜不做稀釋，也不添加任何額外的物質(zhì)，按照糖蜜重量的20%接種上述種子液，在28°C恒溫靜置發(fā)酵培養(yǎng)24小時。
[0061]結(jié)果，大豆糖蜜中的棉籽糖由初始質(zhì)量百分濃度2.52%降解到0.52%，降解率79.36% ;水蘇糖由初始質(zhì)量百分濃度8.64%降解到3.32%，降解率61.57%。將發(fā)酵液真空抽濾，得到的菌體在60°C以下干燥處理可以得到蛋白質(zhì)含量由初始的質(zhì)量百分比9.18%提高到15.6% (以干基計)的高蛋白飼料，蛋白含量的測定方法采用常規(guī)的凱氏定氮法。
[0062]根據(jù)以上結(jié)果，經(jīng)過24小時的發(fā)酵過程，大豆糖蜜中的水蘇糖和棉籽糖得到有效降解，解決了傳統(tǒng)中棉籽糖和水蘇糖難利用的問題，從而可以替代傳統(tǒng)用α-半乳糖苷酶來水解棉籽糖、水蘇糖的方法。此外，由于不需要對底物進(jìn)行滅菌，也不需要調(diào)節(jié)底物的ΡΗ，且不需要用水稀釋底物，因此大大簡化了生產(chǎn)工序并降低了成本。發(fā)酵過程中，菌體生長速度快，單細(xì)胞蛋白飼料中的蛋白含量高，經(jīng)短時間的發(fā)酵即可得到高蛋白飼料。
[0063]實施例2:不接種進(jìn)行發(fā)酵
[0064]如實施例1所述進(jìn)行菌種活化，制備種子液，并進(jìn)行發(fā)酵。不同之處在于，在發(fā)酵階段對原始糖蜜不接種本發(fā)明的酵母菌，進(jìn)行空白培養(yǎng)作為對照。
[0065]結(jié)果，在與實施例1相同的條件下進(jìn)行處理但不接種本發(fā)明酵母菌的對照例中，大豆糖蜜中的棉籽糖由初始質(zhì)量百分濃度2.52%降解到2.51% ;水蘇糖由初始質(zhì)量百分濃度8.64%降解到8.61%，基本上沒有降解效果。
[0066]實施例3:利用釀酒酵母菌WBRD2.12052301生產(chǎn)乙醇
[0067]如實施例1所述進(jìn)行菌種活化，制備種子液，并進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，對大豆糖蜜不做稀釋，也不添加任何額外的物質(zhì)，按照糖蜜重量的20%接種上述種子液，在28°C恒溫靜置發(fā)酵培養(yǎng)24小時。
[0068]在發(fā)酵過程中Oh和24h各取樣5ml，通過GC頂空的方法測試，發(fā)酵結(jié)束時組合物中的乙醇百分含量由發(fā)酵前的質(zhì)量百分比0.296%增加到3.168%。該結(jié)果說明，利用本發(fā)明的酒酵母菌WBRD2.12052301，可產(chǎn)生乙醇。
[0069]因此，本發(fā)明具有以下有益效果:
[0070]本發(fā)明的優(yōu)點在于釀酒酵母菌WBRD2.12052301可以以大豆糖蜜為唯一的發(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵，原料不需要稀釋、不需要滅菌，不需要成分調(diào)整，可直接利用其有效成分。而目前已報道的利用大豆糖蜜的菌株專利都是不能直接以大豆糖蜜為唯一的發(fā)酵原料，需要對大豆糖蜜做5~10倍的稀釋處理，并需輔配一些氮源及營養(yǎng)因子來滿足菌株的發(fā)酵需求。相比之下，本發(fā)明工藝簡單、成本低廉，利于操作處理。
[0071]本發(fā)明的另一優(yōu)點在于釀酒酵母菌WBRD2.12052301解決了大豆糖蜜在飼料應(yīng)用中由于抗?fàn)I養(yǎng)因子導(dǎo)致的添加量受限問題。釀酒酵母菌WBRD2.12052301可以快速降低大豆糖蜜中的低聚糖(棉籽糖、水蘇糖)的含量，高效快速的降解大豆糖蜜中的棉籽糖、水蘇糖，降解率可達(dá)到60%以上?？捎行У靥岣叽蠖固敲墼陲暳现械奶砑颖壤⑶野l(fā)酵過程中產(chǎn)生的芳香類物質(zhì)又可以提高其在飼料中的適口性和誘食性。
[0072]本發(fā)明為大豆糖蜜充分的利用開辟了一種新方法，解決了以往大豆糖蜜在飼料中添加量受限、難利用、利用慢的問題。
[0073]本發(fā)明的優(yōu)點還在于釀酒酵母菌WBRD2.12052301直接發(fā)酵大豆糖蜜可以得到15%以上的單細(xì)胞蛋白。應(yīng)用到飼料中可以提高飼料中蛋白含量。
[0074]已經(jīng)參考本發(fā)明的示例性實施方式對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，可以在不偏離本發(fā)明的原理和精神的情況下對這些實施方式進(jìn)行改變。
[0075]參考引入
[0076]本申請通篇引用的所有參考資料(包括參考文獻(xiàn)、已授權(quán)專利、公開的專利申請和共同未決的專利申請等)的內(nèi)容特意整體地引入本文以供參考。
【權(quán)利要求】
1.一種釀酒酵母菌，保藏號為=CGMCC N0.6183。
2.一種蛋白組合物，其中所述蛋白組合物包含由權(quán)利要求1所述的釀酒酵母菌所產(chǎn)生的蛋白。
3.一種分解水蘇糖和/或棉籽糖的方法，所述方法利用權(quán)利要求1所述的釀酒酵母菌或權(quán)利要求2所述的蛋白組合物來分解底物中的水蘇糖和/或棉籽糖。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述方法以大豆糖蜜為底物。
5.一種發(fā)酵方法，所述方法使用權(quán)利要求1所述的釀酒酵母菌進(jìn)行發(fā)酵。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中發(fā)酵底物中含有低聚糖。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中發(fā)酵底物中含有棉籽糖、水蘇糖或其二者。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述發(fā)酵底物含有大豆糖蜜。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述發(fā)酵底物為大豆糖蜜。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物用于飼料。
11.如權(quán)利要求1所述的釀酒酵母菌在制備飼料中的用途。
12.一種發(fā)酵組合物，所述發(fā)酵組合物在使用酵母菌對可發(fā)酵底物進(jìn)行發(fā)酵的過程中產(chǎn)生，其中所述酵母菌包括權(quán)利要求1所述的釀酒酵母菌。
13.如權(quán)利要求12所述的發(fā)酵組合物，其中所述發(fā)酵組合物中包括乙醇。
14.一種飼料，其中所述 飼料包含權(quán)利要求12所述的發(fā)酵組合物。
15.一種生產(chǎn)乙醇的方法，其中所述方法包括利用權(quán)利要求1所述的釀酒酵母菌進(jìn)行發(fā)酵。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述方法利用大豆糖蜜作為發(fā)酵底物。
【文檔編號】C12P7/08GK103805525SQ201210448425
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月9日
【發(fā)明者】石興利, 吳學(xué)智, 關(guān)慧琴 申請人:豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司