1,3-專一性脂肪酶、其編碼基因序列及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種1,3-專一性脂肪酶、其編碼基因序列及其用途。具體而言，本發(fā)明涉及一種1,3-專一性脂肪酶基因序列，其編碼(i)具有SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或具有1,3-專一性脂肪酶活性的(i)的衍生蛋白。本發(fā)明還涉及具有SEQ?ID?NO:2所示氨基酸序列的1,3-專一性脂肪酶或其具有1,3-專一性脂肪酶活性的衍生蛋白。本發(fā)明的重組脂肪酶具有良好的1,3-專一性，可廣泛應(yīng)用于糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、油脂化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、造紙工業(yè)或藥物合成等。
【專利說明】1,3-專一性脂肪酶、其編碼基因序列及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程和酶工業(yè)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及一種1，3-專一性脂肪酶、其編碼基因序列及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(E.C.3.1.1.3)，亦稱酰基甘油水解酶，是一類具有多種催化能力的酶，其可催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯類的水解，還可以催化酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)，以及生物表面活性劑的合成、催化旋光異構(gòu)體的拆分和手性藥物的合成等。
[0003]在產(chǎn)業(yè)中，脂肪酶被廣泛應(yīng)用于糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、油脂化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、以及藥物合成等許多領(lǐng)域，是重要的工業(yè)酶制劑
之一 O
[0004]脂肪酶催化反應(yīng)位置專一性是指反應(yīng)底物甘油三酯中的Sn-1 (或Sn-3)和Sn_2位酯鍵的識別和水解的反應(yīng)性。微生物脂肪酶作用于底物三脂酰甘油的方式因酶的類型而異，具有1,3位置專一'丨生的脂肪酶如米黑根毛霉(Mucor miehei)、戴爾根霉(Rhizopusdelemar)等產(chǎn)生的脂肪酶。具有1，3_位置專一性脂肪酶可用于結(jié)構(gòu)油脂生產(chǎn)、特殊脂肪酸、單甘酯的合成以及立體選擇性化學(xué)合成和拆分，在工業(yè)生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用潛力。
[0005]在加快對微生物脂肪酶研究與開發(fā)的同時，積極拓展微生物脂肪酶應(yīng)用領(lǐng)域具有一定的迫切性。然而，現(xiàn)有技術(shù)中也只有涉及緊密枝頂胞霉脂肪酶發(fā)酵生產(chǎn)的研究、培養(yǎng)基的改良等方面，未見緊密枝頂孢霉脂肪酶基因的研究。
[0006]因此，獲得新型1，3專一`性脂肪酶基因，并利用基因工程技術(shù)進行重組表達，開發(fā)相應(yīng)脂肪酶，具有重要的工業(yè)價值和意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的:提供一種新型脂肪酶的基因序列，該基因在黑曲霉中重組表達，所得的重組脂肪酶具有較好的1，3-專一性，可廣泛應(yīng)用于糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、油脂化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、造紙工業(yè)或藥物合成等。
[0008]在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種1，3-專一性脂肪酶基因序列，所述序列編碼:
[0009]⑴具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或
[0010](ii)在(i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有1，3-專一性脂肪酶活性的由(i)衍生的蛋白質(zhì)。
[0011]在一些優(yōu)選例中，所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的序列相同性。
[0012]在另一些優(yōu)選例中，所述基因源自保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC、保藏號為CGMCC4420的緊密枝頂孢霉菌株。[0013]在本發(fā)明的一些實施方式中，所述基因序列選自:
[0014](i’)具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的序列；和
[0015](ii’)在嚴格條件下與(a)限定的序列雜交、且編碼具有1，3-專一性脂肪酶活性的多肽或蛋白質(zhì)的序列。
[0016]在一些優(yōu)選例中，所述核苷酸序列與SEQ ID NO:1的序列有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的序列相同性。
[0017]在本發(fā)明的另一些實施方式中，所述序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0018]在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種1，3-專一性脂肪酶，所述脂肪酶的序列選自:
[0019](a)具有SEQ ID NO:2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)；
[0020](b) (a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸、且具有1，3-專一性脂肪酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；和
[0021](c) (a)或(b)中蛋白質(zhì)的活性片段或其保守性變異蛋白。
[0022]在本發(fā)明的一些實施方式中，所述脂肪酶的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0023]在一些優(yōu)選例中，所述(b)中包含I~10個、I~8個、I~6個、I~4個、I~2個或I個氨基酸殘基的取代、缺失或添加。
[0024]在另一些優(yōu)選例中，所述1，3-專一性脂肪酶源自保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC、保藏號為CGMCC4420的緊密枝頂孢霉菌株。
`[0025]在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種包含本發(fā)明的基因序列或脂肪酶的載體。
[0026]在一些優(yōu)選例中，所述載體選自一29、卩("0丨(1'\ pETk、pPic9k或pMA5。
[0027]在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種宿主細胞，其包含本發(fā)明的基因序列、脂肪酶或體。
[0028]在一些優(yōu)選例中，所述宿主細胞選自:曲霉、里氏木霉、大腸桿菌、枯草桿菌、酵母(例如畢赤酵母、啤酒酵母)。
[0029]在另一些優(yōu)選例中，所述宿主細胞是用權(quán)利要求6所述的載體轉(zhuǎn)化的黑曲霉細胞。
[0030]在本發(fā)明的第五方面中，提供了一種生產(chǎn)1，3-專一性脂肪酶的方法，所述方法包括:在適合本發(fā)明的宿主細胞產(chǎn)生本發(fā)明的脂肪酶的條件下，培養(yǎng)所述宿主細胞；以及，分離由所述宿主細胞產(chǎn)生的所述脂肪酶。
[0031]在一些優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)的過程是發(fā)酵生產(chǎn)過程。
[0032]在另一些優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)的溫度為20~60°C、25~50°C或30~40°C。
[0033]在另一些優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)的pH為7~9、7.5~8.5或7.8~8.2。
[0034]在另一些優(yōu)選例中，所述方法還進一步包括對分離的脂肪酶進行純化、凍干、包裝和/或儲存的步驟。在另一些優(yōu)選例中，所述儲存的溫度為10~55°C、15~50°C或20~40°C。在另一些優(yōu)選例中，所述儲存的pH為6~9.5、7~9或7.5~8.5。
[0035]在本發(fā)明的第六方面中，提供了一種進行脂肪酶催化反應(yīng)的方法，所述方法包括:
[0036](A)使本發(fā)明的脂肪酶、宿主細胞、或用本發(fā)明所述方法生產(chǎn)的1，3-專一性脂肪酶與反應(yīng)體系接觸；以及[0037](B)在適宜所述脂肪酶進行催化的條件下，進行催化反應(yīng)。
[0038]在另一些優(yōu)選例中，所述脂肪酶或宿主細胞是分散的、或固定化的。
[0039]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系用于選自下組的反應(yīng):水解反應(yīng)、酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)、酯類的逆向合成反應(yīng)、生物表面活性劑的合成反應(yīng)、催化旋光異構(gòu)體的拆分反應(yīng)、手性藥物的合成反應(yīng)。
[0040]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)用于糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、油脂化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、造紙工業(yè)或藥物合成。
[0041]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)的溫度為20~60°C、25~50°C或30~40°C。
[0042]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)的溫度為20°C、2TC、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 °C >32 °C >33 °C >34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 °C >41 °C >42 °C >43 °C >44 °C >45 V、46 °C >47 °C >48 °C >49 °C >50 °C >51 °C >52 °C >53 °C >54 °C >55 °C >56 V、57。。、58。。、59。。、60。。。
[0043]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)的pH為7~9、7.5~8.5或7.8~8.2。
[0044]在本方面的第七方面中，提供了本發(fā)明的基因序列、脂肪酶、載體、宿主細胞在脂肪酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0045]在另一些優(yōu)選例中，所述脂肪酶或宿主細胞是分散的、或固定化的。
[0046]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)體系用于選自下組的反應(yīng):水解反應(yīng)、酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)、酯類的逆向合成反應(yīng)、生物表面活性劑的合成反應(yīng)、催化旋光異構(gòu)體的拆分反應(yīng)、手性藥物的合成反應(yīng)。
[0047]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)用于糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、油脂化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、造紙工業(yè)或藥物合成。
[0048]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)的溫度為20~60°C、25~50°C或30~40°C。
[0049]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)的溫度為20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 °C >32 °C >33 °C >34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 °C >41 °C >42 °C >43 °C >44 °C >45 °C >46 °C >47 °C >48 °C >49 °C >50 °C >51 °C >52 °C >53 °C >54 °C >55 °C >56 V、57。。、58。。、59。。、60。。。
[0050]在另一些優(yōu)選例中，所述反應(yīng)的pH為7~9、7.5~8.5或7.8~8.2。
[0051]在本發(fā)明的第八方面中，提供了一種脂肪酶制劑，其包含:
[0052]a)本發(fā)明的脂肪酶或用本發(fā)明的方法制備的脂肪酶；
[0053]b)包裝物；和
[0054]c)任選的，可接受的輔料。
[0055]在一些優(yōu)選例中，所述脂肪酶以粉末、溶液、顆粒、酶片、分散體、膠體、固定化酶、膠囊、或膜反應(yīng)器形式存在。
[0056]在另一些優(yōu)選例中，所述可接受的輔料選自:緩沖劑、填料、固定化載體、溶劑或分散基質(zhì)、賦形劑。
[0057]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。并且，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可對本文中所述的各種特征和方面進行有效的組合，這些組合仍然在本申請所要求保護的范圍之內(nèi)?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0058]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明，其中以下附圖顯示僅為了圖示說明本發(fā)明的實施方案，而不是為了局限本發(fā)明的范圍。
[0059]圖1:PCR擴增保守區(qū)間片段；
[0060]圖2 =RACE擴增結(jié)果:泳道1:3’ -RACE結(jié)果；泳道M:DL2000分子量標(biāo)記；泳道2:5' -RACE 結(jié)果；
[0061 ] 圖3:黑曲霉表達載體pAZ9 ；
[0062]圖4:以黑曲霉轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，PCR擴增緊密枝頂孢霉脂肪酶基因的檢測:泳道I:DL2000分子量標(biāo)記；泳道2: λ HindIII標(biāo)記；泳道3 =PCR驗證結(jié)果(1.2kb)；
[0063]圖5:緊密枝頂孢霉重組脂肪酶純酶活性與反應(yīng)溫度的關(guān)系曲線；
[0064]圖6:緊密枝頂孢霉重組脂肪酶純酶活性與反應(yīng)pH值的關(guān)系曲線；
[0065]圖7:緊密枝頂孢霉重組脂肪酶純酶穩(wěn)定性與溫度的關(guān)系曲線；
[0066]圖8:緊密枝頂孢霉重組脂肪酶純酶穩(wěn)定性與pH值的關(guān)系曲線；
[0067]圖9:水解物中1，3-DAG的相對含量隨時間變化；
[0068]圖10:水解產(chǎn)物中1，2 (2，3) -DAG的相對含量隨時間變化；
[0069]圖11:水解產(chǎn)物中2-MAG的相對含量隨時間變化。
[0070]菌種保藏
[0071]本發(fā)明中所使用的緊密枝頂孢霉(Acremonium strictum)菌株2823于2010年12月9日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC4420。關(guān)于該菌株的詳情可參見中國專利申請?zhí)?01110446326.3。
【具體實施方式】
[0072]本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，從緊密枝頂孢霉菌株CGMCC4420中獲得了緊密枝頂孢霉脂肪酶基因序列，并采用基因工程方法使得該基因序列在合適的宿主細胞(如黑曲霉)中重組表達，并獲得了相應(yīng)的重組脂肪酶。本發(fā)明人進一步對該重組脂肪酶的性質(zhì)進行了鑒定，結(jié)果表明該重組脂肪酶具有1，3-專一性，且在常規(guī)溫度和pH下具有高活性和高穩(wěn)定性，適于工業(yè)應(yīng)用。在此擠出上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0073]發(fā)明人進一步在patentLens、DDBJ, EMBL和NCBI等數(shù)據(jù)庫中展開檢索，在專利US20090325240和DDBJ中檢索到與本發(fā)明SEQ ID NO: 2的氨基酸序列同源性最高的序列，即編碼玉蜀黍赤霉脂肪酶氨基酸序列，但其同源性也僅為63%，而其核苷酸片段與本發(fā)明SEQ ID NO:1的核苷酸序列同源性更低，僅為6.4%。EMBL中的結(jié)果也來源于玉蜀黍赤霉的序列，但該序列為染色體上的序列，沒有具體功能說明；在從^1等數(shù)據(jù)庫文獻檢索中，未發(fā)現(xiàn)與緊密枝頂孢霉脂肪酶有顯著同源性的相關(guān)核酸序列的報道。由此，進一步證明了本發(fā)明基因和脂肪酶序列的獨特性。
[0074]如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上
由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”；“主要由......構(gòu)成”、“基本上由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”
屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0075]可對本發(fā)明提到的 特征或?qū)嵤├岬降奶卣鬟M行組合。本說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
[0076]本發(fā)明的脂肪酶編碼基因
[0077]如本文所用，術(shù)語“脂肪酶基因”、“1，3-專一性脂肪酶基因”或“脂肪酶編碼序列”可互換使用，均是指編碼本發(fā)明所述的脂肪酶或其衍生蛋白或活性片段的核苷酸序列。所述基因可為具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的序列、在嚴格條件下與SEQ ID N0:1序列雜交的分子、或與上述分子高度同源的基因分子，所述基因表達本發(fā)明的具有1，3-專一性的脂肪酶。
[0078]如本文所用，術(shù)語“嚴格條件”是指:(I)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2 X SSC, 0.1%SDS, 600C ;或⑵雜交時加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上時才發(fā)生雜交。例如，所述序列可為具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的序列的互補序列，例如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的互補序列。
[0079]本發(fā)明的脂肪酶基因核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0080]應(yīng)理解，本發(fā)明的 脂肪酶基因最初獲自保藏號為CGMCC4420的緊密枝頂孢霉菌株。與初始基因具有高度同源(如具有50%以上，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更優(yōu)選85%以上如85%、90%、95%、甚至98%、99%以上序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明優(yōu)選考慮的等同范圍之內(nèi)。比對序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，如BLAST。
[0081]本發(fā)明的脂肪酶
[0082]如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明的脂肪酶”、"1,3-專一性脂肪酶”、“本發(fā)明的重組脂肪酶”可互換使用，是指具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其同源蛋白，或這些蛋白質(zhì)具有脂肪酶活性的變異或修飾形式、活性片段等。例如，所述脂肪酶可選自:(a)SEQ IDNO:2的氨基酸序列；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有1，3-專一性脂肪酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)或多肽。
[0083]本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、曲霉、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞等)中產(chǎn)生。
[0084]本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的變異形式包括(但并不限于):一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)或多肽的功能，例如本發(fā)明的脂肪酶或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有1，3-專一性脂肪酶活性。
[0085]可采用輻射或暴露于誘變劑下來產(chǎn)生隨機誘變，也可通過定點誘變法或其它已知的分子生物學(xué)技術(shù)來獲得上述(b)中的蛋白質(zhì)或多肽。可利用編碼所述蛋白質(zhì)或多肽的編碼序列來構(gòu)建轉(zhuǎn)基因生物。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。該術(shù)語還包括脂肪酶的活性片段和活性衍生物。
[0086]該多肽的變異形式包括:同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與脂肪酶編碼序列雜交的序列所編碼的蛋白、以及利用抗脂肪酶的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還可使用其它多肽，如包含脂肪酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的蛋白質(zhì)外，本發(fā)明還包括了脂肪酶的可溶性片段。通常，該片段具有脂肪酶序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸,更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸,最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
[0087]載體和宿豐
[0088]本發(fā)明還涉及包含脂肪酶基因的載體以及用該載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞。
[0089]通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(例如Science，1984 ；224:1431)，可利用本發(fā)明的編碼序列可用來表達或生產(chǎn)重組的脂肪酶。一般來說有以下步驟:
[0090](I)用本發(fā)明的編碼脂肪酶的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細胞；
[0091](2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；和
[0092](3)從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)或多肽。
[0093]本發(fā)明中，術(shù)語“載體”與“重組表達載體”可互換使用，指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、動物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其它載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可`以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
[0094]本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含脂肪酶編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明中可使用pAZ^pColif、pET\pPic9k或pMA5等載體。
[0095]此外，表達載體可任選包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如綠色熒光蛋白(GFP)或四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
[0096]包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)或多肽。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如動物細胞。代表性例子有:黑曲霉、大腸桿菌、鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌等；真菌細胞如酵母，如畢赤酵母、啤酒酵母等。在本發(fā)明中，優(yōu)選采用黑曲霉細胞作為宿主細胞。
[0097]在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)或在細胞膜上表達或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
口 ο
[0098]酶制劑
[0099]本發(fā)明還提供了一種酶制劑，所述制劑含有有效量的本發(fā)明的脂肪酶或其編碼序列、包裝物、和任選的可接受的輔料。
[0100]如本文所用，術(shù)語“可接受的”是指適用于脂肪酶的保存和使用，不會過分影響酶促反應(yīng)及其產(chǎn)物的物質(zhì)，即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“有效量”是指可產(chǎn)生所需功能或活性的、且可在酶促反應(yīng)中被接受的量。
[0101]本發(fā)明的輔料是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，包括但不限于:緩沖劑、填料、固定化載體、溶劑或分散基質(zhì)、賦形劑、助流劑。
[0102]本發(fā)明酶制劑中的脂肪酶可為粉末、溶液、顆粒、酶片、分散體、膠體、固定化酶、膠囊或膜反應(yīng)器形式。如果本發(fā)明的酶制劑是固體制劑，則可在使用前，根據(jù)需要將所需量的本發(fā)明酶制劑分散或溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┗蚍磻?yīng)體系中。
[0103]本發(fā)明酶制劑的保存溫度通常為10~55°C、15~50°C或20~40°C，保存的pH通常為6~9.5、7~9或7.5~8.5。如果本發(fā)明的酶制劑是固體形式，則其對溫度和pH的要求通常低于相應(yīng)的液體制劑。使用本發(fā)明酶制劑的反應(yīng)的溫度可為20~60°C、25~50°C或30~40°C ;反應(yīng)體系的pH可為7~9、7.5~8.5或7.8~8.2。
[0104]本發(fā)明的酶制劑中脂肪酶或其編碼序列有效成分占組合物總重量的0.001~99.9wt% ;優(yōu)選為組合物總重量的I~95wt%，較優(yōu)選為5~90wt%，更優(yōu)選10~80wt%。余量為輔料等物質(zhì)。
[0105]應(yīng)理解，所用脂肪酶或其編碼序列的有效量可隨待施用的反應(yīng)體系、反應(yīng)效果、反應(yīng)速度等而變化。可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)具體情況來檢測、判斷和/或決定所述有效量。
[0106]本發(fā)明脂肪酶的應(yīng)用
[0107]本發(fā)明的脂肪酶可用于需要其進行催化的各種反應(yīng)中，這些反應(yīng)包括但不限于:水解反應(yīng)、酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)、酯類的逆向合成反應(yīng)、生物表面活性劑的合成反應(yīng)、催化旋光異構(gòu)體的拆分反應(yīng)、手性藥物的合成反應(yīng)等。由于本發(fā)明的脂肪酶具有1，3-專一性，其尤為適用于需要1，3-專一性的反應(yīng)中，例如在定向酯交換中，將廉價的油脂經(jīng)過改性變成高利用價值的油脂。
[0108]本發(fā)明的脂肪酶可用于糧油生產(chǎn)、食品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)、油脂化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)化學(xué)工業(yè)、造紙工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、造紙工業(yè)或藥物合成等，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0109]本發(fā)明的優(yōu)點
[0110]1.本發(fā)明揭示了一種1，3_專一性脂肪酶及其編碼序列，為本領(lǐng)域提供了的新的可供選擇的材料；
[0111]2.應(yīng)用分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)可提高脂肪酶的產(chǎn)量，降低脂肪酶的生產(chǎn)成本，簡化下游的加工； [0112]3.本發(fā)明的脂肪酶可廣泛應(yīng)用于多種催化反應(yīng)中，且具有高專一性、穩(wěn)定性，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。
[0113]實施例[0114]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本發(fā)明做出適當(dāng)?shù)男薷?、變動，這些修改和變動都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0115]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，可采用本領(lǐng)域中的常規(guī)方法，例如參考《分子克隆實驗指南》(第三版，紐約，冷泉港實驗室出版社，New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)或按照供應(yīng)商所建議的條件。DNA的測序方法為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，也可由商業(yè)公司提供測試。以下實施例中所有試劑都可來源于市售，例如，本發(fā)明所用的培養(yǎng)基成分均可購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。
[0116]除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0117]出發(fā)菌株來源、選育、鑒定和保藏
[0118]1.采樣:
[0119]分別在煙臺和青島海岸采集83個樣品，包括沙灘土樣、沙灘沙、朽木、海洋動物尸體、海邊腐朽的海草、海帶、海菜、海岸巖石表層、海岸邊的溝泥以及飯店前的溝泥等。
[0120]2.培養(yǎng)基配制:
[0121]平板分離培養(yǎng)基(%，以重量百分數(shù)計算):豆粉0.5、蛋白胨0.5、KH2PO40.1、Na2HPO40.1、MgSO40.01，pH6.5，蒸餾水配制)121°C滅菌30分鐘后，在上述成分中再加0.4%
的甘油丁酸三酯，制備成平板分離培養(yǎng)基。
[0122]脂肪酶篩選發(fā)酵培養(yǎng)基(％，以重量百分數(shù)計算):豆粉2.0、魚油2.0、KH2PO40.2、Na2HPO40.2、MgSO40.01、CaCl20.2，蒸餾水配制)。每IOOmL三角瓶中加發(fā)酵培養(yǎng)基20mL(pH6.0)，121°C 滅菌 30 分鐘。
[0123]營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基(%，以重量百分數(shù)計算):蛋白胨1.0、牛肉浸取物0.3、NaCl0.5、瓊脂1.5、ρΗ7.0，蒸餾水配制。
[0124]PDA培養(yǎng)基(％，以重量百分數(shù)計算):葡萄糖2.0、瓊脂1.5、余量為馬鈴薯浸出液，自然pH。其中馬鈴薯浸出液配制:取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加水1.0升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液用水補足至1.0升。
[0125]3.菌種平板初篩:
[0126]在IOmL試管中，加入2mL液體分離培養(yǎng)基，0.2g采集的樣品，28° C搖床震蕩培養(yǎng)24-48小時。取發(fā)酵液少許，劃線接種在平板分離培養(yǎng)基)上，28° C培養(yǎng)，隨時觀察，生長2-3天后，挑選產(chǎn)透明圈的菌落。接種到營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基中，其中細菌接到營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基斜面，霉菌接到PDA培養(yǎng)基斜面。菌種再進行平板劃線分離，挑選菌落小透明圈大的菌落，接種到斜面培養(yǎng)基。
[0127]4.菌種搖瓶發(fā)酵復(fù)篩:
[0128]對于細菌，從營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基斜面取半耳環(huán)菌體，對于霉菌，從PDA培養(yǎng)基斜面切3毫米左右大小的菌塊，分別接種于250ml搖瓶中，搖瓶中含有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基，28° C培養(yǎng)，在接種后24小時、48小時、72小時取樣，常規(guī)氫氧化鈉堿滴定法(QB/T1803-1993脂肪酶測定方法)測定脂肪酶活力，獲得初篩活力達10-50U/mL菌種，并將菌種保存在試管斜面。
[0129]5.菌種初步編號和鑒定:
[0130]依據(jù)上述方法，在青島海岸曾長有海蠣子的巖石上的第28號樣品中，分離出第23個菌落，經(jīng)檢測在平板上具有明顯的水解透明圈，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩檢測，具有較強的脂肪酶水解活力，故編號2823，命名為緊密枝頂孢霉2823。
[0131]委托中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏管理委員會普通微生物中心(即中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC，北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)對該菌種進行鑒定，鑒定結(jié)果為緊密枝頂孢霉，拉丁學(xué)名為=Acremoniumstrictum。
[0132]將緊密枝頂孢霉菌株2823于2010年12月9日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC4420。關(guān)于該菌株的詳情可參見中國專利申請?zhí)?201110446326.3。
[0133]實施例1.1 緊密枝頂孢霉脂肪酶基因的克隆
[0134]通過分子生物學(xué)方法從緊密枝頂孢霉菌株CGMCC4420中克隆出1，3_專一性脂肪酶基因lipAS，具體步驟如下:
[0135]1.脂肪酶基因保守序列的獲得
[0136]設(shè)計并合成用于擴增脂肪酶基因保守序列的PCR引物Blip-1和Blip-2，其序列分別如下:
[0137]Blip-KSEQ ID NO:3):5，-GTS(C/G)GTS(C/G)CTCGCCTTCCGCGG-3’
[0138]Blip-2(SEQ ID NO:4)`:5' -GCCGCACCAGR(A/G)CTR(A/G)TGR(A/G)CC-3'
[0139]序列中的S(C/G)及R(A/G)，括號中的內(nèi)容是指括號外的簡并堿基的可能情況。
[0140]米用Promega 公司 SV 總 RNA 分離系統(tǒng)試劑盒(SV Total RNA IsolationSystemKit, Cat#Z3100)提取緊密枝頂孢霉總RNA,并使用Fermentas公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒第一鏈cDNA 合成試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit, Cat#K1611)對緊密枝頂抱霉總 RNA進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以引物Blip-1和Blip-2為引物對，進行PCR擴增，具體條件如下:
[0141]反應(yīng)體系(總體積為50 μ I):EasyTaq DNA聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)1μ 1，緩沖液 5μ 1，模板 1μ 1，(1ΝΤΡ4μ 1，上、下游引物各 1μ 1，(ΜΗ2037 μ I。
[0142]反應(yīng)過程:95°C5min ；95°C 30s, 53°C 30s, 72°C 60s, 30 個循環(huán)；72°C IOmin0
[0143]對獲得的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測(圖1)，回收后測序，測序結(jié)果顯示獲得的PCR產(chǎn)物符合預(yù)期，為IipAS基因保守區(qū)間的序列。
[0144]2.全長脂肪酶基因IipAS的獲得
[0145]根據(jù)獲得的IipAS基因保守區(qū)間的序列，設(shè)計并合成用于擴增全長基因的PCR引物up-1、up-2和down-1、down-2,其中，up-1與up_2用于擴增保守區(qū)間序列的上游片段，down-Ι與down-2用于擴增保守區(qū)間序列的下游片段，其序列分別如下所示:
[0146]up-1 (SEQ ID NO:5):5’-GTGACAATTGCGCAGTGCAT-3’
[0147]up-2 (SEQ ID NO:6):5’-GCTCAAGTCCACGACCGTAT-3’
[0148]down-1(SEQ ID NO:7):5’-CGCAACGAGTTTCCCACGCT-3’
[0149]down-2(SEQ ID NO:8):5’-GATGTTCCGCCGAGTGAGGT-3’[0150]按照Ambion公司提供的FirstChoiceS RLM-RACE試劑盒(AM1700)所示的方法，分別進行3' -RACE與5’ -RACE以得到IipAS的側(cè)翼序列(圖2)。將側(cè)翼序列與保守區(qū)間的序列拼接后得到全長脂肪酶基因lipAS，其核苷酸序列如SEQ IDN0:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
[0151]將緊密枝頂孢霉脂肪酶IipAS的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列在DDBJ中檢索，與本發(fā)明SEQ ID N0:2的氨基酸序列同源性最高的序列，即編碼玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)的三?；视椭久?triacylglycerol lipase)氨基酸序列，但其同源性僅為63%，而其核苷酸片段與本發(fā)明SEQ ID N0:1的核苷酸序列同源性更低，僅為6.4%。在NCBI等數(shù)據(jù)庫文獻檢索中，未發(fā)現(xiàn)與緊密枝頂孢霉脂肪酶有顯著同源性的相關(guān)核酸序列的報道。
[0152]實施例2.1 緊密枝頂孢霉脂肪酶基因在黑曲霉中重組表達
[0153]1.基因lipAS的克降
[0154]根據(jù)lipAS全長基因序列，設(shè)計并合成擴增引物qh-lipl與qh_lip2,其序列如下所示:
[0155]上游qh-lipl (SEQ ID NO:9):
[0156]5’-AAActgcagATGCGGCATCCGCAGTCTCT-3’
[0157]下游qh_lip2(SEQ ID NO: 10):
[0158]5’-CCaagcttTTAATGGTGGTGATGATGGTGTAACTCATCGCCATTCACG-3’
[0159]其中，在引物qh-lipl與qh_lip2上分別引入PstI和HindIII酶切位點(如下劃線所示)。下游qh-lip2引入6XHis-tag標(biāo)簽(ATGGTGGTGATGATGGTG，如黑體所示)。
[0160]從緊密枝頂孢霉菌中提取總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，以引物qh-lipl與qh_lip2為引物對，進行PCR擴增，具體條件如下:
[0161]反應(yīng)體系(總體積50 μ I):NEB Phusion?高保真 DNA 聚合酶(Cat#M0530S) I μ I,緩沖液5μ 1，模板1μ 1，(1ΝΤΡ4μ 1，上、下游引物各1μ 1，純水37μ I。
[0162]反應(yīng)過程:95°C5min ；95°C 30s，56°C 30s，72°C 90s，30 個循環(huán)；72°C IOmin0
[0163]2.重組表達載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
[0164]將米曲霉烯醇化酶啟動子(GenBank:D63941.1，起始密碼子前520bp序列)中的順式作用兀件(cis-acting element) regionIII 序列(gtcgtgtcgggcatttatcgggggatggaccaatcagcgtagg)進行12個重復(fù)串聯(lián),從而構(gòu)建enoA-cis啟動子。
[0165]以pSP72 (Promega, Catalog#P2191)為骨架，把 enoA-cis 啟動子插入 BamHI 和PstI酶切位點中，glaA終止子插入HindIII和XhoI酶切位點中，獲得表達載體為pAZ9，載體見圖3。
[0166]PCR擴增LipAS基因片段后經(jīng)PstI和HindIII酶切，然后與同樣經(jīng)PstI和Hindi 11酶切的黑曲霉表達載體pAZ9進行連接構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pAZ_l ipAS與p3SR2按原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法共轉(zhuǎn)化黑曲霉3.795 (CGMCC，編號:3.795)，獲得黑曲霉重組表達菌株。
[0167]3.重組菌株表達產(chǎn)物的鑒定與性質(zhì)分析
[0168]3.1表達產(chǎn)物鑒定
[0169]用獲得的重組菌株所產(chǎn)生的表達產(chǎn)物脂肪酶，命名為LipaseAS，催化對硝基苯棕櫚酸酯(PNPP)進行水解反應(yīng)，以鑒定表達產(chǎn)物的脂肪酶活性。[0170]pNPP比色法檢測脂肪酶酶活，其原理是:脂肪酶在一定溫度和pH條件下，水解底物pNPP，生成黃顏色的對硝基苯酚。在一定的濃度范圍內(nèi)，生成對硝基苯酚的量和反應(yīng)液的410nm處吸光值，呈線性關(guān)系。據(jù)此可以通過測定反應(yīng)液的410nm吸光值計算脂肪酶活力。
[0171]測定方法具體如下:
[0172]溶液A:將0.03g pNPP溶于IOml異丙醇，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0173]溶液B:pH8.0，50mM磷酸鈉緩沖液(其中另添加2.3g/L的脫氧膽酸鈉，1.lg/L的阿拉伯樹膠粉)。
[0174]使用時將溶液A與溶液B按1:9的體積比混合，配成底物反應(yīng)液，每2mL離心管加Λ 600 μ L底物反應(yīng)液，40°C預(yù)熱5min。每離心管加入25 μ L粗酶液，混勻，在40°C水浴鍋內(nèi)反應(yīng)15min,立即加入無水乙醇500 μ L終止反應(yīng)。12000rpm離心2min,在410nm測吸光值。以硝基苯酚系列濃度測定的吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0175]脂肪酶I個酶活單位的定義:每分鐘釋放I μ mol對硝基苯酚所需的酶量。在催化反應(yīng)過程中有明顯的黃綠色產(chǎn)物生成，表明重組菌株所產(chǎn)生的表達產(chǎn)物可以催化對硝基苯酚酯生成對硝基苯酚。
[0176]同時，以重組菌株基因組DNA為模板，以qh-lipl與qh_lip2為引物對，可以擴增出緊密枝頂孢霉脂肪酶基因，測序結(jié)果表明此基因序列與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列一致，表明目的基因已成功轉(zhuǎn)化入黑曲霉中(見圖4)。
[0177]3.2重組脂肪酶的 發(fā)酵及純化
[0178]按照如下配方配制所需試劑:
[0179]黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):葡萄糖2%，淀粉10%，TSB (胰酪胨大豆肉湯)4%，檸檬酸鈉 7%, (NH4)2SO4L 5%, NaH2PO4.H2O0.1%，MgSO4.7Η200.1%，Tween800.07%, *1000 X 微量元素液 0.1%(ν/ν)，**100 X 鐵鹽 1%(ν/ν)；
[0180]*1000X 微量元素液(w/v):ΚΙ0.83%，H3BO30.62%，MnSO4.4Η202.23%，ZnSO4.7Η200.86%, Na2MoO4.2Η200.025%, CuSO4.5Η200.0025%, CoCl2.6Η200.0025% ；
[0181]**100 X 鐵鹽(w/v) =FeSO4.7Η200.278%, Na2.EDTA0.373%。
[0182]接種IO7個的黑曲霉孢子到50mL黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C，200rpm發(fā)酵培養(yǎng)144h后取樣。離心收集的發(fā)酵液上清經(jīng)過Miradoth? (Calbiochem, Cat#475885)過濾后即獲得粗酶液。粗酶液經(jīng)過鎳柱HisTrap HP (GE，CodeN0.17-5247-01)純化與脫咪唑后得到了純化的脂肪酶。以純化后的脂肪酶進行以下實施例中的酶學(xué)性質(zhì)分析。
[0183]實施例3.重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)分析
[0184]1.反應(yīng)溫度對緊密枝頂孢霉重組脂肪酶純酶酶活的影響
[0185]分別在20°C、30°C、40°C、5(rC、6(rC下按實施例2中所述的pNPP方法測定純酶脂肪酶活力，以最高酶活為相對酶活，計算其它溫度下純酶的相對活力。
[0186]實驗結(jié)果如圖5所示。該結(jié)果表明LipaseAS在25_45°C范圍內(nèi)有較高的酶活，最適反應(yīng)溫度為40 °C。
_7] 2.反應(yīng)pH值對'緊密枝頂孢霉重組脂肪酶純酶酶活的影響
[0188]分別在pH值為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液中按實施例2中所述的pNPP法測定脂肪酶純酶活力，以最高酶活為相對酶活，計算其它pH值下純酶的相對活力(pH值
6.0-9.0為磷酸氫二鈉-磷酸氫二鉀緩沖液；pH值9.0-10.0為甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)。[0189]實驗結(jié)果如圖6所示。該結(jié)果表明LipaseAS對反應(yīng)pH值的變化具有一定敏感性，pH為7.0-9.0，優(yōu)選7.5-8.5范圍內(nèi)有較高的酶活，而最適pH值為8.0。
[0190]3.保存溫度對緊密枝頂孢霉重組脂肪酶純酶穩(wěn)定性的影響
[0191]將純酶液分裝于不同的反應(yīng)管中，于20°C、30°C、40°C、50 V、60 V保溫一小時后按實施例2中所述的pNPP方法測定脂肪酶純酶活力，以不經(jīng)保溫處理所測的脂肪酶純酶酶活為相對酶活，酶活測定反應(yīng)溫度均為40°C。
[0192]實驗結(jié)果如圖7所示。該結(jié)果表明LipaseAS在50°C以下相對穩(wěn)定，只在高于50°C時酶活才表現(xiàn)出較大損失。
[0193]4.保存PH值對緊密枝頂孢霉重組脂肪酶純酶穩(wěn)定性的影響
[0194]將純酶液分別在不同pH值(pH值6.0-10.0)的緩沖液體系中4°C保溫24h后按實施例2中所述的pNPP方法測定脂肪酶純酶活力，以不經(jīng)保溫處理所測的脂肪酶純酶酶活為相對酶活。
[0195]實驗結(jié)果如圖8所示。該結(jié)果表明LipaseAS的最佳保存pH值是8.0,當(dāng)保存在PH值6.0-9.0范圍內(nèi)時，酶活穩(wěn)定性較好。
[0196]5.HPLC分析緊密枝頂孢霉重組脂肪酶純酶一一 LipaseAS水解反應(yīng)的1，3專一性
[0197]取0.1U的脂肪酶與乳化后的橄欖油底物(橄欖油:4%聚乙烯醇=1:3，高剪切乳化機乳化3min，靜止lmin，再乳化3min)進行水解反應(yīng)，精確控制反應(yīng)時間X (X=0.25,0.5、
1、2、5、10、20、35分鐘)，反`應(yīng)結(jié)束時用乙醇終止反應(yīng)，并用正己烷萃取反應(yīng)產(chǎn)物，最后通過HPLC-ELSD檢測水解產(chǎn)物。
[0198]HPLC檢測條件如下:
[0199]儀器:AgilentllOO，配Grace3300ELSD ；
[0200]色譜柱:Alltimasilica250mmX 4.6mmX 5 μ m ;
[0201]柱溫:30O;
[0202]進樣量:20yL;
[0203]Grace3300ELSD參數(shù):漂移管溫度90°C，霧化器流量:2L/min ；
[0204]增益因子:2 ；
[0205]流動相梯度洗脫程序:見表1
[0206]流動相A:正己烷
[0207]流動相B:正己烷:異丙醇:乙酸乙酯:10%甲酸(V/V)=80:10:10:1
[0208]表1流動相梯度洗脫程序
[0209]
時間(min)流速(mL/min)流動相A 流動相B
O2982
826535
8?52298
Τδ2298
【權(quán)利要求】
1.一種1，3-專一性脂肪酶基因序列，所述序列編碼: (i)具有SEQ ID NO:2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)；或 (?)在(i)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有1，3-專一性脂肪酶活性的由(i)衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的基因序列，其中，所述基因序列選自: (i，)具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的序列；和 (ii’)在嚴格條件下與(a)限定的序列雜交、且編碼具有1，3-專一性脂肪酶活性的多肽或蛋白質(zhì)的序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的基因序列，其特征在于，所述序列為SEQID N0:1所示的核苷酸序列。
4.一種1，3-專一性脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶的序列選自: (a)具有SEQID NO:2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)； (b)(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸、且具有1,3-專一性脂肪酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；和 (c)(a)或(b)中蛋白質(zhì)的活性片段或其保守性變異蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶的序列如SEQID N0:2所示。
6.一種包含權(quán)利要求1 ~3中任一項所述的基因序列或權(quán)利要求4~5中任一項所述的脂肪酶的載體。
7.—種宿主細胞，其包含權(quán)利要求1~3中任一項所述的基因序列、權(quán)利要求4~5中任一項所述的脂肪酶或權(quán)利要求6中所述的載體。
8.—種生產(chǎn)1，3-專一性脂肪酶的方法，所述方法包括:在適合權(quán)利要求7所述的宿主細胞產(chǎn)生如權(quán)利要求4~5中任一項所述的脂肪酶的條件下，培養(yǎng)所述宿主細胞；以及，分離由所述宿主細胞產(chǎn)生的所述脂肪酶。
9.一種進行脂肪酶催化反應(yīng)的方法，其特征在于，所述方法包括: (A)使權(quán)利要求4~5中任一項所述的脂肪酶、權(quán)利要求7中所述的宿主細胞、或用權(quán)利要求8所述方法生產(chǎn)1，3-專一性脂肪酶與反應(yīng)體系接觸；以及 (B)在適宜所述脂肪酶進行催化的條件下，進行催化反應(yīng)。
10.權(quán)利要求1~3中任一項所述的基因序列、權(quán)利要求4~5中任一項所述的脂肪酶、權(quán)利要求6中所述的載體、權(quán)利要求7所述的宿主細胞在脂肪酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用。
11.一種脂肪酶制劑，其包含: a)權(quán)利要求4~5中任一項所述的脂肪酶或用權(quán)利要求8所述的方法制備的脂肪酶； b)包裝物；和 c)任選的，可接受的輔料。
【文檔編號】C12N1/21GK103805617SQ201210448438
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月9日
【發(fā)明者】佟小雪, 毛愛軍 申請人:豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司