專利名稱：一種殺蟲(chóng)綠僵菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)天牛幼蟲(chóng)具有高毒力的殺蟲(chóng)綠僵菌菌株，屬于生物 農(nóng)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
真菌是植物害蟲(chóng)，病菌和害草的主要天敵，在植物病蟲(chóng)草害防治中起 著重要作用。對(duì)真菌類生物農(nóng)藥的研發(fā)國(guó)際上已有許多成功的事例。在蟲(chóng)
生真菌制劑方面，僅綠僵菌和白僵菌制劑國(guó)際上已經(jīng)登記的產(chǎn)品有20多 個(gè)，如澳大利亞Biogreen (2003)注冊(cè)登記的"Green Guard"，用于防治 草地蝗蟲(chóng)；美國(guó)(2003)公布完成防治蠐螬，薊馬，蜱等的綠僵菌F52顆 粒劑等三種制劑以及孢子母藥(1999)登記注冊(cè)；重慶重大生物技術(shù)發(fā)展 有限公司(2004， 2008)完成殺蝗綠僵菌母藥與油懸浮劑的農(nóng)藥正式登記 注冊(cè)，用于防治東亞飛蝗和草原蝗蟲(chóng)。
國(guó)內(nèi)對(duì)真菌生防制劑的研究始于50年代，其中一些己具有了相當(dāng)?shù)囊?guī)
模，如白僵菌防治松毛蟲(chóng)在我國(guó)每年應(yīng)用面積達(dá)幾千萬(wàn)畝，我國(guó)研制的液 固兩相真菌孢子生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)得到國(guó)內(nèi)外同行的認(rèn)可。國(guó)內(nèi)已形成一批真 菌殺蟲(chóng)劑研制單位和龍頭企業(yè)，掌握了真菌生物制劑研發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)方 面成熟技術(shù)，可以勝任各種類型的真菌農(nóng)藥的研制與生產(chǎn)，為我國(guó)農(nóng)林害 蟲(chóng)的綠色防控提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和應(yīng)用技術(shù)。天牛屬鞘翅目天?？评ハx(chóng)，其生命周期較長(zhǎng)，1至3年才能完成1世代; 生活史隱蔽，自然控制作用較弱；寄主范圍很廣，危害多種農(nóng)作物或林木 花卉，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。如我國(guó)南方地區(qū)的蔗根土天牛，對(duì)甘蔗的危害 曰趨嚴(yán)重，受害甘蔗一般減產(chǎn)12%—20%，重則達(dá)到50%以上，嚴(yán)重影響我 國(guó)甘蔗生產(chǎn)及制糖業(yè)的發(fā)展。蔗根土天牛還可危害柑桔木薯，可造成整株 死亡。雙條杉天牛、星天牛、桑天牛等幼蟲(chóng)則鉆蛀樹(shù)干，引起樹(shù)勢(shì)衰弱， 枝條折斷，危害森林及經(jīng)濟(jì)林木。由于天牛幼蟲(chóng)蛀食樹(shù)干活動(dòng)隱蔽的特點(diǎn) 或在地下根圍活動(dòng)的習(xí)性，天牛幼蟲(chóng)的防治難度非常大，至今未找到有效 的防治方法。傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法是有一定的效果，但其長(zhǎng)期大量使用既 嚴(yán)重污染環(huán)境，危害人體健康，還大量殺傷害蟲(chóng)天敵，破壞生態(tài)環(huán)境。因 此天牛防治需要安全有效，不殺傷非目標(biāo)生物的生物農(nóng)藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)自然感染的僵蟲(chóng)直接分離和土壤誘集法分離篩選的方法， 獲得了一種抗逆性強(qiáng)的高效殺蟲(chóng)綠僵菌菌株，利用該菌株生產(chǎn)的殺蟲(chóng)真菌 制劑，能夠大幅度提高對(duì)天牛類害蟲(chóng)的防治效果。
本發(fā)明所述的綠僵菌菌株已在北京中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏日期是2007年12月14日，保藏號(hào)是 CGMCCN0,2291;具體內(nèi)容是金龜子綠僵菌大孢變種CQMall7ifeter力^j'咖 ,'卿h'se var.鵬J肌CQMal17， CGMCC NO. 2291。
本發(fā)明技術(shù)方案是經(jīng)過(guò)采集自然感病天牛僵蟲(chóng)(或用天牛在寄 根圍土壤誘集感染天牛形成僵蟲(chóng))一分離純化菌株一毒力測(cè)定獲得高毒力菌株 —鑒定菌株的分類地位一確定菌株的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)特性一固體發(fā)酵配方 優(yōu)化一菌株發(fā)酵，干孢子粉收集純化獲得。
本發(fā)明通過(guò)采集自然感染僵蟲(chóng)和寄主根圍土壤誘集法分離并篩選出一
株對(duì)蔗根土天牛幼蟲(chóng)具有高毒力的金龜子綠僵菌大孢變種(i/e&rh'幻'腿 s/7is，7ise var.鵬》s)菌株CQMal17。室內(nèi)多批生物活性的測(cè)定結(jié)果表 明該菌株對(duì)鱗翅目的菜青蟲(chóng)、鞘翅目的蔗根土天牛、雙條杉天牛、桔褐天 牛等天牛幼蟲(chóng)都有良好的侵染控制作用。該菌株具有生物活性高、生長(zhǎng)迅 速、抗雜菌污染、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良特性。進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化液固兩相培養(yǎng)基 配方和菌株生長(zhǎng)產(chǎn)孢條件，大大提高菌株產(chǎn)孢能力。 一、菌株的鑒定
1.形態(tài)鑒定將分離到的CQMall7菌株接種在l/4SDAY平板培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)特征，產(chǎn)孢特性等。結(jié)果顯示在1/4SDA培養(yǎng)基上培養(yǎng) 7d菌落初期白色茸狀，產(chǎn)孢時(shí)橄欖綠色，自菌落中心由里向外長(zhǎng)出成叢的 綠色分生孢子。分生孢子梗單生或聚集或緊密排列，帚狀分枝或輪生體。 后期培養(yǎng)物菌落呈殼狀。菌株可以在1/4SDA上28 GC生長(zhǎng)一周，直徑達(dá) 3.5cm; 25 28。C菌落初期白色鶯狀，菌落產(chǎn)孢后暗綠色至深綠色，分生孢 子梗單生或聚集或緊密排列，帚狀分支。由里向外生出中間密集，四周稀 疏的叢狀的暗綠色分生孢子。
菌株形態(tài)特征在1/4SDA培養(yǎng)基上，菌絲具分枝分隔，粗1.4-2.lHm。 瓶梗型產(chǎn)孢細(xì)胞，大小幅度為2.1-2.9x7.1-7.5 Mm;從瓶梗頂端產(chǎn)生向基成熟的分生孢子鏈；孢子鏈連接點(diǎn)傾斜度?。环稚咦訛殚L(zhǎng)橢圓形，單細(xì)胞， 兩端鈍圓， 一端較膨大，尺寸在4.3 5.2umX10.9 12.6um。其孢子著生 于分生孢子梗頂端，呈分生孢子鏈排列。分生孢子梗單生或聚集或緊密排 列，帚狀分支，在生長(zhǎng)期間，有水珠分散于菌絲間。從以上特征看，菌株 CQMal17應(yīng)該為金龜子綠僵菌大孢變種Mflm'w;7//ae var.附q/wo 2. CQMall7菌株的ITS序列擴(kuò)增與序列測(cè)定
將CQMal17在1/4 SDAY液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)3天(180rpm， 28°C)，過(guò) 濾收集菌絲體，加液氮研磨破碎，以氯化芐法提取菌株CQMall7的總 DNA[lO-ll]。以總DNA為模板，參照Curran擴(kuò)增綠僵菌ITS1-5. 8S-工TS2 rDNA 區(qū)域。所用弓l物為T(mén)W81: 5， -gtttccgtagctgaacctgc-3禾口 AB28:5， atatgcUaagUcagcgggt-3，，產(chǎn)生552 bP擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)體 系(25 u L)為:2. 5 u L 10 XTaq酶緩沖液，dNTP各200 u mol. L-1， MgC12 1. 5 畫(huà)1丄-1，引物O. 12 ng， Taq酶1.5 U，模板DNA 10 ng lug。擴(kuò)增反應(yīng) 在PCR儀上的反應(yīng)程序95°C 3min， l個(gè)循環(huán)；94°C 0. 5min， 52°C 0. 5min， 72°C0. 5min， 30個(gè)循環(huán)；最后72。C5 min。將凝膠電泳產(chǎn)物用凝膠回收試 劑盒純化回收，由上海生工進(jìn)行雙向脫氧法測(cè)序。序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中己 知序列比對(duì)，經(jīng)提取菌絲總DNA擴(kuò)增，獲得了552 bp的擴(kuò)增片段，符合預(yù)期 長(zhǎng)度。回收該片段以雙脫氧測(cè)序法測(cè)定了CQMall7菌株的ITS序列及 5.8SrRNA基因的序列如下。該序列5'端包含部分18S rRNA基因序列 (1-49)， 3'端包含部分28SrRNA基因序列(520-552)，其余的分別為ITS1 區(qū)(50-195) 5. 8S rRNA基因全序列(196-342)以及ITS2區(qū)域全序列(343-519)。
TTTTATGCTTTAJCTTCAGCGGGTAGTCCTACCTGArTCGAGGTCAACnAAA^ AGTTGGGGGTTTTTACGGCAGTGGACCGCGCCGGGCTCCTGTTGCGAGTGTTTTACTA CTGCGCAGAGG AGGGC CACGGCG AG AC CGCC A^C AATTTAAGGGACG GCTGTGCTG GAAAACC AG CCTCG CCGATC CCCAAC ACC AAGTCC AC AGGGG ACTTGAGGGGCGTAA
T丁CGjTGjTTCACTGAArTCTGCAArTCACATTACTOCGCAnTCGCTGCGTTCTTCiff C G ATG CC AG AAC C AJ=iG W AT CC GTTGTT GAAAGTTTT GATT C AnTTTTTTTAAC C ACT CAG AAGATACTTA[TAAAAAATTCAG AAGGTTTGGG丁CCCCGG CGGGCGCG AAGTC CC
TGATCC CTCCG CAGGTTCACTAAj^CGGAAACA
對(duì)所測(cè)得的ITS序列與GenBank中已知序列比對(duì)，結(jié)果表明，與該菌株 ITS序列最為接近的為金龜子綠僵菌大孢變種，其ITS序列同源性為95X， 結(jié)合CQMall7菌株的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，將該菌株鑒定為金龜子綠僵菌大孢變種
(#etar/lz.2^z'膽var.鵬j'〃51)。 二、 CQMall7菌株對(duì)天牛幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性
收集在1/4SDA上培養(yǎng)的成熟分生孢子，用色拉油分散，添加4%的與真 菌活力兼容的乳化劑，配置成終濃度為1X108個(gè)孢子/mL的油孢子懸浮液， 接種在蔗根土天牛、雙條杉天牛和桔褐天牛大齡幼蟲(chóng)。按點(diǎn)滴法每頭試蟲(chóng) 用微量點(diǎn)滴器點(diǎn)滴藥劑10ul，每組接種30頭，接種后在室溫28t:，濕度
30-50%的條件下飼養(yǎng)，各處理設(shè)一空白對(duì)照，對(duì)照實(shí)驗(yàn)由同濃度的色拉 油和乳化劑代替油孢子懸液接種。每天定時(shí)觀察，記錄死亡蟲(chóng)數(shù)，經(jīng)DPS2000 軟件統(tǒng)計(jì)分析得到LT50 (致死中時(shí))，LT90 (致死終時(shí))。
從表1中可以看出CQMal17菌株對(duì)蔗根土天牛、桑天牛、雙條杉天牛和 桔褐天牛等幼蟲(chóng)有明顯的防治效果，6-7d為死亡的高峰期，天牛幼蟲(chóng)感染真菌致死后蟲(chóng)體變白并出現(xiàn)鈹紋，3d后長(zhǎng)出白色菌絲體，6d后蟲(chóng)體長(zhǎng)滿灰
_ 表1 CQMal17菌株對(duì)不同天牛幼蟲(chóng)的毒力 _
;牛種類 "~ LT50 (P=0.05) LT90 (P=0.05)
蔗根土天4 4.25±0.22
雙條杉天牛 4.45±0.11 6.72±0.24
桔褐天牛 5.02±0.15 7,03±0.13
桑天牛 4.32±0.16 6.56士0.20
綠色孢子，成熟后變?yōu)楹诤稚咦佣选?br> 三、CQMall7菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢情況
以CQMal17菌株在各個(gè)基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周生長(zhǎng)速率和單位面積 上的產(chǎn)孢量為標(biāo)準(zhǔn)，采用打孔器轉(zhuǎn)接固定大小的菌絲塊在各個(gè)固體培養(yǎng)基 上生長(zhǎng)的方法，測(cè)定了CQMall7菌株在l/4SDA， PSA，察氏瓊脂培養(yǎng)基等
_6一
表2 CQMall7菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)孢量
培養(yǎng)基生長(zhǎng)速率(cm/天)產(chǎn)孢量(孢子/mm2)
1/4SDA2.29±0.012(0.95±0.014)*105
PSA2.42±0.011(0.87土0.013"105
察氏瓊脂培養(yǎng)基2.32±0.005(0.34士0.022) *105
基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢情況。
由表2可知，察氏瓊脂培養(yǎng)基上CQMall7菌株能夠正常生長(zhǎng)，但是在 2周后其白色菌絲仍占其生長(zhǎng)總量的1/2左右，較PSA和1/4SDA上產(chǎn)孢量 少。而后兩者相比，選用產(chǎn)孢量最高的1/4SDA為CQMal17菌株的菌種培養(yǎng) 基。四、 CQMall7菌株培養(yǎng)特性
同樣以CQMall7菌株在變化固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周時(shí)的生長(zhǎng)速率和單位 面積上的產(chǎn)孢量為標(biāo)準(zhǔn)，以1/4SDA為基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基，通過(guò)變換其培養(yǎng)時(shí) 的溫度(15°C， 22°C， 25°C， 28°C， 3CTC， 37°C),培養(yǎng)基的pH (4.0， 5.0， 6.0， 7.0， 8.0， 9.0， 10.0)，得出CQMal17菌株在25。C和pH6. 0條件下 生長(zhǎng)和產(chǎn)孢最佳。測(cè)定CQMall7菌株的最佳培養(yǎng)條件。在此基礎(chǔ)上，分別 變換碳源(同量的D-山梨醇，葡萄糖，乳糖，麥芽糖，淀粉代替蔗糖)， 氮源(同量的硝酸銨，尿素，L-精氨酸，L-甘氨酸代替蛋白胨)和添加0. 1% (質(zhì) 量/體積)的微量元素(K+、 Fe3+、 Cu2+、 Zn2+、 Mn2+、 Mg2+或Ca"的單因素水 平，測(cè)定CQMall7培養(yǎng)最適合的單因子營(yíng)養(yǎng)條件；并進(jìn)行3因素3水平的 正交實(shí)驗(yàn)，得出以可溶性淀粉10g，蛋白胨2.5g，酵母膏5g， 1g的K+，瓊 脂粉18g，溶入1L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至6.0的固體培養(yǎng)基為最佳固體培 養(yǎng)基，可以使CQMa117菌株在生長(zhǎng)速率基本不變的情況下，單位面積的產(chǎn) 孢量提高40%左右。
五、 CQMall7菌株固體發(fā)酵物料的優(yōu)化
液體培養(yǎng)CQMa117菌絲體作為發(fā)酵種子，接種到不同的物料培養(yǎng)基中， 各個(gè)物料配方為..麥麩+米粉，麥麩+面粉，麥麩+玉米粉的混合物(每個(gè)混
合物的比例分別為99: 1; 97: 3; 95: 5的質(zhì)量比)，并進(jìn)行添加各種液體
培養(yǎng)基(1/2SDA， 1/4SDA， 1/8SDA液體培養(yǎng)基，同量的無(wú)菌水)，以及分 別加入K+， Ca2+， Fe3+的無(wú)機(jī)鹽溶液(濃度分別為0.1%， 0.5%， 0.01%)， 并對(duì)篩選出的各個(gè)較好培養(yǎng)條件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以產(chǎn)孢量為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，最后確定CQMal17的固體物料發(fā)酵的優(yōu)化條件是97%的麥麩+3%的面粉為基 礎(chǔ)物料配方，添加0. 05-0. 1%的IT或Fe+3無(wú)機(jī)鹽的減量SDA為營(yíng)養(yǎng)液。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一、CQMal17菌株的殺蟲(chóng)譜
將在1/4SDA平板上28。C條件下培養(yǎng)10天的綠僵菌CQMal17孢子收集 后，放入干燥器中干燥至含水量5%，用色拉油分散CQMall7孢子，使其終 濃度為lX107spOreS/ml，分別接種大小基本一致的菜青蟲(chóng)、甘蔗土天牛、 桑天牛、玉米螟幼蟲(chóng)，用細(xì)毛刷蘸取一定量的油劑孢子接種于蟲(chóng)體胸部， 每種蟲(chóng)接種30頭，
接種后放入20cmX20cmX10cm的飼養(yǎng)磁盤(pán)中添加其天然飼料正常詞 養(yǎng)，調(diào)節(jié)室溫至3(TC、濕度40 50%，光暗周期16h/8h。各種蟲(chóng)設(shè)一用食 用油代替綠僵菌孢子接種的空白對(duì)照。每天定時(shí)觀察，更換各蟲(chóng)新鮮飼料， 記錄死亡蟲(chóng)數(shù)，經(jīng)DPS2000軟件統(tǒng)計(jì)分析得到LT50、 LT90。
表3 CQMal02對(duì)不同昆蟲(chóng)的毒力
蟲(chóng)名LT50 (P=0.05)LT90 (P=0. 05)
菜青蟲(chóng)3, 66±0. 124. 88±0. 19
蔗根土天牛4. 25±0. 225. 87±0, 27
桑天牛3. 32±0. 154. 23±0. 13
玉米螟3. 45±0. 114. 72 ±0. 24
從表3可以看出CQMall7對(duì)菜青蟲(chóng)、甘蔗土天牛、桑天牛、玉米螟等 幾種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)都具有侵染活性，具有明顯的防治效果。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)二、 CQMall7菌株固體發(fā)酵產(chǎn)孢率
將大米在含有1-10% NaN03、 0.01-0. 1% F"、 2_10%微量元素溶液、1-10% 酵母粉的液體中浸泡2h后裝入兩頭透氣的聚丙烯袋中(大米第二次利用 時(shí)，按大米營(yíng)養(yǎng)液為2: 1的比例加入l-10%NaN03、 0.01-0. l%Fe3+、 2-10%微量元素溶液、1_10%酵母粉的營(yíng)養(yǎng)液，拌勻后裝袋)，121°C、0. IO—O. 15MPa 濕熱滅菌30min，自然冷卻后按10-15: 1比例接入在2/4 SDA液體基中培 養(yǎng)3天的綠僵菌CQMal17菌液并拌勻，置于27士rC的發(fā)酵室中發(fā)酵10-12 天后出袋干燥(30°C-34°C)至濕度《5%。干燥后隨機(jī)抽取IO袋培養(yǎng)料， 每袋混勻后各取5g左右的樣品，放入裝有20mL 0. 05°/QTween-80的50ml三 角瓶中，充分混勻后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定濃度。按iooxios個(gè)/g與大米第一 次用后損失15%換算出固體發(fā)酵產(chǎn)孢率。設(shè)用清水處理(不加營(yíng)養(yǎng)液)的 大米為對(duì)照。表4 CQMall7菌株固體發(fā)酵產(chǎn)孢率大米第-一次利用產(chǎn)孢率(％)大米第二次利用產(chǎn)孢率(％)大米總產(chǎn)孢率(％)處理2. 09 ±0. 461. 42±0. 333.45 ±0.76對(duì)照0. 46* ±0. 05o氺氺0.鄰±0. 05*:菌絲生長(zhǎng)旺盛不能進(jìn)入微循環(huán)產(chǎn)孢；**:大米未進(jìn)行第二次利用從上表4可以看出大米第一次利用時(shí)，CQMall7在經(jīng)過(guò)處理的大米 上發(fā)酵能進(jìn)入微循環(huán)產(chǎn)孢，產(chǎn)孢率為2.09%左右，而在未處理的大米上菌 絲生長(zhǎng)旺盛不能進(jìn)入微循環(huán)產(chǎn)孢，產(chǎn)孢率僅為0. 46%，比對(duì)照提高4.5倍;大米經(jīng)第二次利用總產(chǎn)孢率達(dá)到3%以上，比不加營(yíng)養(yǎng)液的產(chǎn)孢量提 高了 7. 5倍，比大米利用一次的產(chǎn)孢率提高了 60%左右。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:田間采集自然感病天牛僵蟲(chóng)一直接分離純化菌株一接種天牛幼蟲(chóng)測(cè)定殺蟲(chóng)毒力一獲得高毒力菌株CQMal17—菌株形態(tài)、孢子形態(tài)、 鑒定一提取菌株DNA，以真菌ITS序列通用引物擴(kuò)增菌株DNA，將獲得的擴(kuò)增序列測(cè)序并在GENEBANK中比對(duì)一確定菌株CQMA117為金龜子綠僵菌大孢 變種。設(shè)置不同溫度，培養(yǎng)基pH，在不同條件下培養(yǎng)菌株CQMA117確定最佳 培養(yǎng)條件25"C和p朋.0，加入可溶性淀粉10g，蛋白胨2.5g，酵母膏5g， lg的K+，瓊脂粉18g，溶入1L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至6.0的固體培養(yǎng)基為 最佳固體培養(yǎng)基。以麥麩為主要培養(yǎng)物料，按97%的麥麩+3%的面粉為基礎(chǔ) 物料配方，添加0. 05-0. 1°/。的IT或Fe+3無(wú)機(jī)鹽的1/4SDA為營(yíng)養(yǎng)液對(duì)菌株進(jìn) 行固體發(fā)酵，其一次產(chǎn)孢量可達(dá)3%以上。
權(quán)利要求
1.一種殺蟲(chóng)綠僵菌菌株，其特征是該菌株是金龜子綠僵菌大孢變種(Metarizium anisopliae var.major)CQMa117株，其保藏號(hào)為CGMCC NO.2291。
全文摘要
本發(fā)明是一種殺蟲(chóng)綠僵菌菌株，屬于綠僵菌屬，種名為金龜子綠僵菌大孢變種Metarhizium anisopliae CQMa117，保藏號(hào)CGMCC NO.2291。在優(yōu)化的液固兩相培養(yǎng)條件下與同類菌株相比具有抗污染力強(qiáng)、生長(zhǎng)勢(shì)旺、殺蟲(chóng)毒力高、對(duì)土天牛、蠐螬等地下害蟲(chóng)具有侵染力、對(duì)非靶標(biāo)生物無(wú)害等優(yōu)良特性。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101654658SQ200910103950
公開(kāi)日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2009年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日
發(fā)明者彭國(guó)雄, 殷幼平, 王中康, 寧 謝 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)