專利名稱：細(xì)菌素誘導(dǎo)者肽的制作方法
細(xì)菌素誘導(dǎo)者肽
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在誘導(dǎo)者細(xì)菌存在下刺激由生產(chǎn)者細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌素的新型的肽以及 使用所述肽用于細(xì)菌素產(chǎn)生的方法。正常的腸道細(xì)菌對(duì)于任何宿主動(dòng)物的健康都是重要的。宿主通過(guò)由天然細(xì)菌生物 相介導(dǎo)的消化代謝過(guò)程而受益。從腸道細(xì)菌來(lái)看，競(jìng)爭(zhēng)和隨之發(fā)生的進(jìn)化提供營(yíng)養(yǎng)素和生 存空間并增加繁殖潛能，使得某些菌株和菌種獲得生存優(yōu)勢(shì)。在細(xì)菌進(jìn)化期間，細(xì)菌素的 產(chǎn)生已經(jīng)發(fā)生。在給定的競(jìng)爭(zhēng)利基(competitive niche)中，細(xì)菌素對(duì)于其他生物體是拮 抗的并因此提供生態(tài)優(yōu)勢(shì)。這些生物素一般是低分子量的多肽，并被基于分子量的差異分 類(Klaenhammer，F(xiàn)EMS Microbiol. Rev.，1993 年 12-39-85 卷)。這些化合物可以容易地 被宿主蛋白酶消化成其組成氨基酸。細(xì)菌素可能代表得自競(jìng)爭(zhēng)性排斥的益處中的重要部分 (Nurmi 和 Rantala，Nature (自然)，倫敦，1973 年，第 241 卷，210-211)。Nurmi和Rantala(1973，同上)最早描述了通過(guò)使用得自健康的成年禽糞便的未 確定的細(xì)菌菌群控制沙門氏菌在新孵化的雛雞中的定殖中的競(jìng)爭(zhēng)性排斥的優(yōu)點(diǎn)。該途徑對(duì) 于目前涉及合成抗生素的耕作方法而言是有吸引力的備選方案。得自粘膜的競(jìng)爭(zhēng)性排斥 菌群被描述為得自健康的成年母雞的腸粘膜內(nèi)膜刮屑的厭氧培養(yǎng)物(Stern等，美國(guó)專利 5，451，400，公布于1995年9月)。此未確定的菌群在雞中提供良好的對(duì)于沙門氏菌的定 殖防護(hù)，但是僅提供不穩(wěn)定的彎曲桿菌(Campylobacter)的定殖控制(Stern，Poult. Sci, 1994年，第73卷，402-407)。競(jìng)爭(zhēng)性排斥出現(xiàn)在野生禽類腸道中并有助于健康的腸道生態(tài)。微生物產(chǎn)生各種顯示抗菌性質(zhì)的化合物。一類這樣化合物，細(xì)菌素，由具有類似于 離子載體抗生素的作用機(jī)制的殺菌蛋白質(zhì)組成。細(xì)菌素常具有抵抗與該細(xì)菌素的生產(chǎn)者密 切相關(guān)的菌種的活性。它們?cè)趶膹?fù)雜的微生物群落(例如腸道、口腔或其他的上皮表面)分 離出來(lái)的細(xì)菌菌種中的廣泛存在，表明細(xì)菌素在細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)中的種群動(dòng)態(tài)方面可能具有 調(diào)節(jié)作用。細(xì)菌素被定義為由細(xì)菌產(chǎn)生的具有生物活性的蛋白部分以及殺菌作用的化合物 (Tagg 等，細(xì)菌學(xué)評(píng)論(Bacteriological Reviews)，1976 年，第 40 卷，722-256)。其他的特 征可以包括(1)窄譜抑制活性，集中于密切相關(guān)的菌種；(2)與特定細(xì)胞受體附著；(3)質(zhì) 粒攜帶的細(xì)菌素產(chǎn)生和具有宿主細(xì)胞細(xì)菌素免疫性的遺傳定子。未完全確定的拮抗物質(zhì)被 稱為“細(xì)菌素樣物質(zhì)”。一些有效抵抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，相反不抵抗革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)菌 素，具有較廣譜的活性。已有建議術(shù)語(yǔ)細(xì)菌素，當(dāng)被用于描述由革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)生的抑制 劑時(shí)，應(yīng)該符合⑴是一種肽，⑵具有殺菌活性(Tagg等人，同上)的最低標(biāo)準(zhǔn)。為了經(jīng)濟(jì)上可行地在商業(yè)上利用細(xì)菌素，在產(chǎn)生期間將產(chǎn)量最優(yōu)化是必要的 (Chen 和 Hoover，食品科學(xué)和食品安全綜述(Comprehensive Reviews in Food Science andFood Safety)，2003年，第2卷，82-100)。Chen和Hoover宣稱發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)介質(zhì)中，針對(duì) 尼生素(nisin)生產(chǎn)的關(guān)鍵因素是維持最優(yōu)化的pH以及針對(duì)每種產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株或多 種菌株補(bǔ)充具有特定的營(yíng)養(yǎng)物的介質(zhì)。
Knutsen 等人(細(xì)菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology)，2004 年，第 186 卷 (10), 3078-3085)公開了一種27個(gè)氨基酸的細(xì)菌素誘導(dǎo)肽(BIP)，其誘導(dǎo)肺炎鏈球菌 (Streptococcus Pneumoniae)中細(xì)菌素的產(chǎn)生。Di印等人(分子生物學(xué)(Molecular Biology) 2003年第47 (2)卷，483-494)公開了許多革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，所述細(xì)菌已被報(bào)道 為應(yīng)用所謂的基于肽信息素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)節(jié)來(lái)自為數(shù)眾多的乳酸菌的，稱為細(xì)菌 素的抗微生物肽的產(chǎn)生。其還公開了誘導(dǎo)細(xì)菌素產(chǎn)生的肽信息素，PInA。Van Belkum和 Stiles (Nat. Prod. Rep.，2000年，第17卷，323-335)公開了一些細(xì)菌素需要調(diào)節(jié)基因的產(chǎn) 物來(lái)產(chǎn)生它們。他們宣稱這些基因編碼一種分泌的誘導(dǎo)肽以及與組氨酸激酶和響應(yīng)調(diào)節(jié)因 子同源的蛋白質(zhì)。該參考文獻(xiàn)進(jìn)一步公開了一些由誘導(dǎo)肽誘導(dǎo)的II類細(xì)菌素，而其他的例 如肉食桿菌素B2(Carnobacteriocin B2)和乳桿菌素P (Sakacin P)是由誘導(dǎo)肽誘導(dǎo)或者 由所合成細(xì)菌素自誘導(dǎo)的。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)各種在細(xì)菌中誘導(dǎo)細(xì)菌素產(chǎn)生的肽，本領(lǐng)域中仍存在對(duì)于采用在體 外增加細(xì)菌素產(chǎn)生的量的肽的細(xì)菌素商業(yè)化生產(chǎn)的需要。本發(fā)明提供與現(xiàn)有技術(shù)中的肽不 同的肽并提供大量生產(chǎn)用于商業(yè)化用途的細(xì)菌素的方法。
發(fā)明簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在體外刺激細(xì)菌素產(chǎn)生的肽。本發(fā)明的又一目的是提供在體外刺激體外細(xì)菌素產(chǎn)生，并且具有VKGLT (SEQID N0 1)的羧基端序列的肽。本發(fā)明的另一目的是提供具有氨基酸序列MVTKSLVLAWVVALLACGMVKGLT (SEQ ID NO 3)的肽。 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供具有氨基酸序列TNVTKSWWVLAGCNQVVASNCNCGNVKGLT (SE Q ID NO 5)的肽。本發(fā)明再一個(gè)目的是提供具有氨基酸序列WNKYKTNWVLSVCNTGCACAAVKGLT (SEQ ID NO 7)的肽。本發(fā)明的另一目的是提供體外增加細(xì)菌素產(chǎn)生的方法，其中具有VKGLT(SEQID NO 1)的羧基端序列的肽被加至產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞的培養(yǎng)物中。本發(fā)明又一個(gè)目的是提供用于體外增加細(xì)菌素0R-7的產(chǎn)生的方法，其中具有SEQ ID NO 3 的肽被加至唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius) PVD-32 (NRRL B-30514)細(xì)胞 的培養(yǎng)物中。本發(fā)明的另一目的是提供用于體外增加細(xì)菌素50-52的產(chǎn)生的方法，其中具有 SEQ ID NO 5 的肽被加至屎腸球菌(Enterococcus faecium)LWP 50-52 細(xì)胞(NRRLB-30746) 的培養(yǎng)物中。本發(fā)明再一個(gè)目的是提供用于體外增加細(xì)菌素760的產(chǎn)生的方法，其中具有 SEQID N0 7 的肽被加至倉(cāng)鼠鏈球菌(Str印tococcus cricetus)LWP 760 細(xì)胞(NRRL B-30745)的培養(yǎng)物中。本發(fā)明的另一目的是提供通過(guò)進(jìn)一步包括誘導(dǎo)者細(xì)胞系而增加由生產(chǎn)者細(xì)胞系 產(chǎn)生細(xì)菌素的方法。本發(fā)明再一個(gè)目的是提供通過(guò)進(jìn)一步包括誘導(dǎo)者細(xì)胞系卷曲乳桿菌
4(Lactobacillus crispatus) LWP 252 (NRRL B-30884)而增加由生產(chǎn)者細(xì)胞系唾液乳桿菌 (Lactobacillus salivarius)PVD-32 產(chǎn)生細(xì)菌素 0R-7 的方法。
本發(fā)明再一個(gè)目的是提供通過(guò)進(jìn)一步包括誘導(dǎo)者細(xì)胞系嗜酸乳酸桿菌 (Lactobacillus acidophilus) LWP 320 (NRRL B-30510)而增加經(jīng)生產(chǎn)者細(xì)胞系屎腸球菌 (Enterococcus faecium)LWP 50-52 產(chǎn)生細(xì)菌素 50-52 的方法。本發(fā)明再一個(gè)目的是提供通過(guò)進(jìn)一步包括誘導(dǎo)者細(xì)胞系嗜酸乳酸桿 菌(Lactobacillus acidophilus)LWP 320而增加經(jīng)生產(chǎn)者細(xì)胞系倉(cāng)鼠鏈球菌 (Streptococcuscricetus) LWP-760 產(chǎn)生細(xì)菌素 760 的方法。 本發(fā)明其他的目的和優(yōu)勢(shì)從下述說(shuō)明中將會(huì)變得明顯。
微生物的保藏唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius),標(biāo)明為 NRRL B_30514(菌株 PVD32)，于2001年8月3日保藏；倉(cāng)鼠鏈球菌(Str印tococcus cricetus)，標(biāo)明為 NRRL B-30745 (菌株 LWP 760)，以及屎腸球菌(Enterococcus faecium)標(biāo)明為 NRRL B-30746(菌株LWP-50-52)于2004年5月3日保藏；而嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)，標(biāo)明為NRRL B-30510 (菌株LWP 320)于2001年8月3日保藏。卷曲乳 桿菌(Lactobacilluscrispatus)，標(biāo)明為 NRRL B_30884(菌株 LWP 252)于 2005 年 11 月 4日保藏。所有上述菌株已按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定保藏于美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)中 心專利培養(yǎng)物保藏中心(國(guó)家農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research),1815N. University Street, Peoria,Illinois 61604)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A和IB是顯示SDS-PAGE (A)和等電聚焦⑶后對(duì)信號(hào)肽和細(xì)菌素0R-7直接 檢測(cè)的照片。凝膠用空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)覆蓋以確定哪個(gè)或哪幾個(gè)條 帶與抗微生物活性對(duì)應(yīng)，并確定分子量和等電點(diǎn)。在圖1A中第1道——2，100-12, 500范 圍的 LMW分子量標(biāo)記(Amersham Pharmacia Biotech) :2，100 ；5，780 ；8，400 ；12，500Da。包 含純的細(xì)菌素0R-7的第2道的條帶對(duì)應(yīng)抗菌活性，生長(zhǎng)抑制的區(qū)域具有約5. 5kDa的質(zhì)量。 包含純的來(lái)自PVD-32的信號(hào)肽的第3道的條帶具有約2. 5kDa的質(zhì)量。在圖1B中，包含純 的細(xì)菌素0R-7的第1道對(duì)應(yīng)抗菌活性；生長(zhǎng)抑制的區(qū)域具有約8. 4的pi。包含純的來(lái)自 PVD-32的信號(hào)肽的第2道的條帶具有約7. 9的pi。第3道包含pi標(biāo)準(zhǔn)物(蛋白質(zhì)測(cè)試混 合物，I 標(biāo)記蛋白，Serva) 10. 0,9. 2,8. 1,6. 9,5. 5,4. 3。圖2A和2B是顯示SDS-PAGE (A)和等電聚焦⑶后對(duì)信號(hào)肽和細(xì)菌素50_52直接 檢測(cè)的照片。凝膠用空腸彎曲桿菌覆蓋以確定哪個(gè)或哪幾個(gè)條帶對(duì)應(yīng)抗菌活性，并確定分 子量和等電點(diǎn)。在圖1A中第1道——約2，100-12, 500范圍的LMW分子量標(biāo)記(Amersham Pharmacia Biotech) :2，100 ；5，780 ；8，400 ； 12，500Da。包含純的細(xì)菌素 50-52 的第 2 道的 條帶對(duì)應(yīng)抗菌活性，生長(zhǎng)抑制的區(qū)域具有約3. 9kDa的質(zhì)量。包含純的針對(duì)LWP-50-52的 信號(hào)肽的第3道的條帶具有約3. lkDa的質(zhì)量。在圖2B中，包含純的細(xì)菌素50-52的第1 道對(duì)應(yīng)抗菌活性；生長(zhǎng)抑制的區(qū)域具有約8. 4的pi。包含純的來(lái)自LWP-50-52的信號(hào)肽的 第2道的條帶具有約8. 1的pi。第3道包含pi標(biāo)準(zhǔn)物(蛋白質(zhì)測(cè)試混合物，I標(biāo)記蛋白，
5Serva) :10· 0、8· 1、7· 9、6· 4、5· 5、4· 3、4· 1 以及 3. 8。圖3Α和3Β是顯示SDS-PAGE (A)和等電聚焦⑶后對(duì)信號(hào)肽和細(xì)菌素760直接檢 測(cè)的照片。凝膠用空腸彎曲桿菌覆蓋以確定哪個(gè)或哪幾個(gè)條帶對(duì)應(yīng)抗菌活性，并確定分子 量和等電點(diǎn)。在圖3A中，第3道顯示約2，100-12, 500范圍的LMW分子量標(biāo)記(Amersham Pharmacia Biotech) :2，100 ；5，780 ；8，400 ； 12，500Da。包含純的細(xì)菌素 760 的第 1 道的條 帶對(duì)應(yīng)抗菌活性，生長(zhǎng)抑制的區(qū)域具有約5. 5kDa的質(zhì)量。包含純的來(lái)自LWP760的信號(hào)肽的 第3道的條帶具有約2. IkDa的質(zhì)量。在圖3B中，包含純的細(xì)菌素760的第1道的條帶對(duì) 應(yīng)抗菌活性；生長(zhǎng)抑制的區(qū)域具有約9. 5的pi。包含純的來(lái)自LWP-760的信號(hào)肽的第2道 的條帶具有約8.9的pi。第3道包含pi標(biāo)準(zhǔn)物(蛋白質(zhì)測(cè)試混合物，I標(biāo)記蛋白，Serva) 10.0,8. 1,7. 9,6. 4,5. 5,4. 3,4. 1 以及 3. 8。
發(fā)明詳述腸感染在人中的重要性已經(jīng)被日益充分地認(rèn)識(shí)到，家禽污染和人感染之間的關(guān)系 也有詳盡記載。通過(guò)干預(yù)家禽加工廠消除這種健康危險(xiǎn)的能力也是眾所周知的。在肉仔雞 產(chǎn)生和加工過(guò)程中，含有病原體的糞便物轉(zhuǎn)移到肉上，并繼續(xù)存在于加工食品的廚房中。競(jìng)爭(zhēng)性生物的代謝物可能有助于控制病原體例如空腸彎曲桿菌和沙門氏菌。唾 液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)，標(biāo)明為 NRRL B-30514 (菌株 PVD32)，倉(cāng)鼠鏈球 菌(Sti^ptococcus cricetus)，標(biāo)明為 NRRL B-30745 (菌株 LWP 760)，以及屎腸球菌 (Enterococcus faecium)，標(biāo)明為 NRRL B-30746 (菌株 LWP-50-52)產(chǎn)生新細(xì)菌素，所述新 細(xì)菌素是2003年8月21日遞交的待決美國(guó)專利申請(qǐng)10/644，927以及2003年5月1日遞 交的待決美國(guó)專利申請(qǐng)10/426，688的主題，所述專利均通過(guò)引用整體包括在本文中。這些 菌株還產(chǎn)生體外刺激所述菌株產(chǎn)生更高量的細(xì)菌素的新肽。本發(fā)明提供新信號(hào)肽以及產(chǎn)生所述肽的菌株，新誘導(dǎo)者菌株、氨基酸序列以及使 用所述的新肽和誘導(dǎo)者菌株的方法。唾液乳桿菌，PVD-32 (NRRL B-30514)產(chǎn)生信號(hào)肽SEQ ID NO 3。它是一種好氧且 革蘭氏陽(yáng)性的桿菌，并且能夠在約37°C生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂(Plate Count Agar)上生長(zhǎng)產(chǎn)生不規(guī)則形狀的邊緣。在約37°C需氧培養(yǎng)約24小時(shí)后，所述的菌落 是白色的且直徑約3mm。屎腸球菌，LWP 50-52 (NRRL B-30746)產(chǎn)生信號(hào)肽SEQ ID NO 5。它是一種兼性好 氧菌和革蘭氏陽(yáng)性球菌，并且能夠在約37°C生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂上 生長(zhǎng)產(chǎn)生不規(guī)則形狀的邊緣。在約37°C微需氧培養(yǎng)約24小時(shí)后，所述的菌落是灰色的且直 徑約2mmο倉(cāng)鼠鏈球菌，LWP-760 (NRRL B-30745)產(chǎn)生信號(hào)肽SEQ ID NO 7。它是一種兼性好 氧菌和革蘭氏陽(yáng)性球菌，并且能夠在約37°C生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂上 生長(zhǎng)產(chǎn)生規(guī)則形狀的邊緣。在約37°C微需氧培養(yǎng)約24小時(shí)后，所述的菌落是灰色的且直徑 約 Imm0嗜酸乳酸桿菌，LWP 320 (NRRL B-30510)，是這樣的誘導(dǎo)者菌株，它是兼性好氧菌 和革蘭氏陽(yáng)性球菌，并且能夠在約37°C生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng) 產(chǎn)生不規(guī)則形狀的邊緣。在約37°C微需氧培養(yǎng)約24小時(shí)后，所述的菌落是白色的且直徑約3mm ο卷曲乳桿菌LWP 252 (NRRL B-30884)是這樣的誘導(dǎo)者菌株，它是好氧菌和革蘭氏 陽(yáng)性球菌，并且能夠在約37°C生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)產(chǎn)生規(guī)則 形狀的邊緣。在約37°C需氧培養(yǎng)約24小時(shí)后，所述的菌落是灰色的且直徑約1mm。來(lái)自產(chǎn)細(xì)菌素菌株的信號(hào)肽被分離并純化。生產(chǎn)者細(xì)胞主要通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 分泌 II 類細(xì)菌素(Haverstein 等，Mol. Microbiol.，第 16 卷，229-240，1995 ；Gajic 等， J.Biol. Chem.，第36卷，34291-34298，2003)。這類細(xì)菌素中的一些的分泌是由于由位于 細(xì)胞質(zhì)膜上的Sec轉(zhuǎn)位酶激活的信號(hào)肽發(fā)生的(Cintas等，Appl. Environ. Microbiol.， 第 63 卷，4321-4330，1997 ；Doi 等，J. Biosci. Bioeng.，第 93 卷，434-436，2002 ；Leer 等， 微生物學(xué)(Microbiology)，第 141 卷，1629-1635，1995 ；Martinez 等，微生物學(xué)，第 145 卷，3155-3161，1999 ；Tomita 等，J. Bacteriol.，第 178 卷，3585-3593，1999 ；Worobo 等， J. Bacteriol.，第 177 卷，3143-3149，1995 ；以及Herranz 等，J. Appl. Environ. Microbiol.， 第71卷(4) ,1959-1963，2005)。信號(hào)肽的另一功能可能與細(xì)菌現(xiàn)象“群體感應(yīng)(quorum sensing) ” 有關(guān)(De Kievit 等，感染與免疫(Infection and Immunity)，第 68 卷(9)， 4839-4849，2000 ；Dunny 等，在微生物信號(hào)傳遞與通信(Microbial Signaling and Communication)中，England 等編，英國(guó)劍橋大學(xué)出版社(University Press, Cambridge, United Kingdom), 117-138,1999 ；Dunning 禾口 Leonard, Annu. Rev. Microbiol.,第 51 卷， 527-564，1997 ；以及 Kleerebezem 等，Mol. Microbiol.，第 24 卷，895-904，1997)。信號(hào)肽單 獨(dú)或與誘導(dǎo)菌株的代謝物一起激活生產(chǎn)者中的組氨酸蛋白，由此增加細(xì)菌素的產(chǎn)生。為了 獲得最大化的肽產(chǎn)生，產(chǎn)生信號(hào)肽的細(xì)胞，例如PVD 32，LWP 50-52以及LWP 760，在選自由 苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸及其混合物所組成的組的氨基酸所補(bǔ)充的M9肉湯中培養(yǎng)約2-10 小時(shí)。對(duì)于包括在所述組合物中的每種氨基酸，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案包括在約0. 01%到 約0. 范圍內(nèi)的氨基酸的量。約10%的布氏肉湯介質(zhì)導(dǎo)致產(chǎn)生較低濃度的信號(hào)肽。采用硫酸銨沉淀，隨后(1)采用Superose 12的高分辨色譜的凝膠過(guò)濾；和(2)辛 基-瓊脂糖凝膠6B Fast Flow (快速流動(dòng))疏水作用色譜而將信號(hào)肽從培養(yǎng)物上清液中分 罔出來(lái)。本發(fā)明的信號(hào)肽被用于在誘導(dǎo)者細(xì)菌存在時(shí)體外增加由生產(chǎn)者細(xì)胞的細(xì)菌素產(chǎn)生。所述的信號(hào)肽可以在誘導(dǎo)者和生產(chǎn)者細(xì)菌的培養(yǎng)期間的任何時(shí)刻添加。若給予本文的 發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地確定何時(shí)添加所述信號(hào)肽以獲得與僅 含所述的肽和生產(chǎn)者、或僅含生產(chǎn)者和誘導(dǎo)者細(xì)菌的培養(yǎng)物的細(xì)菌素產(chǎn)生相比高水平的細(xì) 菌素產(chǎn)生。當(dāng)使用信號(hào)肽和抵抗空腸彎曲桿菌(C. jejuni)和腸炎沙門氏菌 (S. enteritidis)的誘導(dǎo)者細(xì)菌菌株時(shí)產(chǎn)生的細(xì)菌素的拮抗活性采用斑點(diǎn)試驗(yàn)來(lái)評(píng)定。所 述步驟包括取約10微升體積的各種濃度(yg/ml)的平板接種在預(yù)先接種有靶細(xì)菌細(xì)胞 的血補(bǔ)給彎曲菌瓊脂(Campylobacter Agar )或營(yíng)養(yǎng)瓊脂(MPA或后蛋白胨瓊脂(Meta Peptone Agar))上的純細(xì)菌素制備物。含空腸彎曲桿菌培養(yǎng)物的平板于約42°C在微需氧條 件下生長(zhǎng)。含腸炎沙門氏菌的平板于約37°C在需氧條件下生長(zhǎng)。細(xì)菌素的活性以每1毫升 制備物任意單位(AU)在其上出現(xiàn)可見的培養(yǎng)物生長(zhǎng)抑制區(qū)域表示(Henderson等，生物化 學(xué)和生物物理存檔(Archives of Biochemistry and Biophysics)，第 295 卷，5-12，1992，通過(guò)引用并入本文)。比活也可以以每毫克純細(xì)菌素任意單位表示。本發(fā)明的信號(hào)肽包括由細(xì)菌素分泌細(xì)菌產(chǎn)生的任何具有VKGLT(SEQ ID NO 1)的羧基端序列的肽，當(dāng)被加至包括生產(chǎn)者細(xì)菌或生產(chǎn)者細(xì)菌和誘導(dǎo)者細(xì)菌的培養(yǎng)物時(shí)，所述 肽增加細(xì)菌素的產(chǎn)生。為了本發(fā)明的目的，誘導(dǎo)者細(xì)菌被定義為任何這樣的細(xì)菌，所述細(xì)菌當(dāng)與產(chǎn)細(xì)菌 素細(xì)菌——生產(chǎn)者細(xì)菌一起——連同與生產(chǎn)者的信號(hào)肽一起培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)菌素的產(chǎn)生增加 到超過(guò)僅含所述生產(chǎn)者細(xì)菌和其信號(hào)肽的培養(yǎng)物的細(xì)菌素的產(chǎn)生。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“肽”意為至少兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸或氨基酸類似物的化 合物。所述氨基酸或氨基酸類似物可以通過(guò)肽鍵相連。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸可以通 過(guò)其他鍵，例如酯，醚等相連。肽可以是任何結(jié)構(gòu)構(gòu)型，包括線性，分支，或環(huán)狀構(gòu)型。本文所 用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然或合成的氨基酸，包括D或L光學(xué)異構(gòu)體，以及氨基酸類似物兩者。
本發(fā)明的肽衍生物和類似物包括但不限于包含作為一級(jí)氨基酸序列的的那些，所 述肽的所述氨基酸序列的全部或部分包括改變的序列，其中，功能上等同的氨基酸殘基替 代所述序列中的殘基導(dǎo)致保守氨基酸替代。例如，序列中的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基可以由具有相似極性的另外的氨基酸替 代，所述具有相似極性的另外的氨基酸起功能等同物的作用，導(dǎo)致沉默改變。序列中氨基酸 的替代物可以選自該氨基酸所屬類別的其他成員。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨 酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的 氨基酸是苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨 酸，酪氨酸，天門冬酰胺，和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸，賴氨酸，和組 氨酸。帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。預(yù)期這種改變不會(huì)顯著影響聚 丙酰胺凝膠電泳確定的分子量或等電點(diǎn)。非保守氨基酸替代也可以被引入以替換氨基酸， 使之具有特別偏好的性質(zhì)。例如，Cys可以被引入到可能的位置以與另一個(gè)Cys形成二硫 橋。Pro可以因其特別平面的結(jié)構(gòu)而被引入。本發(fā)明的肽可以被化學(xué)合成。合成肽可以用熟知的固相、液相，或肽縮合 (peptidecondensation)技術(shù)，或任何其組合制備，并且可以包括天然的和/或合成的氨基 酸。用于肽合成的氨基酸可以是使用Merrifield的原創(chuàng)的固相程序的標(biāo)準(zhǔn)去保護(hù)、中和、 耦聯(lián)和洗滌方法(J. Am. Chem. Soc，第85卷，2149-2154，1963)的標(biāo)準(zhǔn)Boc (N°-氨基保護(hù)
丁基氧羰基)氨基酸樹脂，或堿敏感的Na-氨基保護(hù)的9-芴基甲氧羰基(Fmoc) 氨基酸(Carpino 和 Han，J. Org. Chem.，第 37 卷，3403-3409，1972)。此外，本發(fā)明的方法 可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他Na-保護(hù)的基團(tuán)。固相肽合成可以用本領(lǐng)域的普通 技術(shù)(參見例如 Stewart 和 Young，Solid Phase Synthesis (固相合成)，第二版，Pierce ChemicalCompany, Rockford, 111. , 1984 ；Fields 禾口 Noble, Int. J. Pept. Protein Res.,第 35卷，161-214，1990)，或用自動(dòng)合成儀完成。下述實(shí)施例僅僅是為了進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明，并非要限制由權(quán)利要求確定的本 發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1屎腸球菌LWP50-52、倉(cāng)鼠鏈球菌LWP-760以及唾液乳桿菌PVD-32菌株的細(xì)胞被平板接種在含有約300mL下列介質(zhì)的燒瓶中布氏肉湯，10 %布氏肉湯或如下表1所示的由 氨基酸補(bǔ)充的M9。在約37°C振蕩培養(yǎng)約2、4、6和8小時(shí)。旋轉(zhuǎn)速度約為120rpm。約_4°C 下將培養(yǎng)液的等分試樣在約6000Xg離心約15分鐘。通過(guò)用約40%的(NH4)2SO4溶液在 約4°C沉降蛋白大約24小時(shí)，隨后通過(guò)使用Superose-12高分辨色譜凝膠過(guò)濾并選擇低分 子量級(jí)份而將蛋白分離。這些級(jí)份被施于辛基-瓊脂糖凝膠6B Fast Flow(快速流動(dòng))疏 水作用色譜柱并用約0. IM Tris緩沖液中，pH 5. 1的0. 4-0. 9M的K2HPO梯度洗脫。結(jié)果 在下面示于表1中。從表1可見，從生產(chǎn)者PVD 32,LffP 50-52以及LWP 760分離的肽是低 分子量的并且主要在含饑餓法介質(zhì)的培養(yǎng)物中積累(M9+指明的氨基酸)。表1來(lái)自菌株 PVD-32.LffP-50-52以及LWP-760的誘導(dǎo)者肽的分離和純化 如斑點(diǎn)試驗(yàn)所確定的，對(duì)于PVD-32的分離的信號(hào)肽具有微弱的抵抗空腸彎曲桿 菌和腸炎沙門氏菌的拮抗活性。其活性是約200AU/ml，并且如SDS-PAGE電泳所確定的，其 分子量是約2. 5kDa。其等電點(diǎn)(pi)是約7. 9 (圖IA和1B)。如斑點(diǎn)試驗(yàn)所確定的，針對(duì)LWP50-52的分離的信號(hào)肽不具有抵抗空腸彎曲桿菌 和腸炎沙門氏菌的拮抗活性。如由SDS-PAGE電泳所確定的，其分子量是約3. lkDa，其等電 點(diǎn)是約8. 1 (圖2A和2B)如斑點(diǎn)試驗(yàn)所確定的，針對(duì)LWP-760的分離的信號(hào)肽不具有對(duì)空腸彎曲桿菌和腸 炎沙門氏菌的拮抗活性。如由SDS-PAGE電泳所確定的，其分子量是約2. lkDa，其等電點(diǎn)是 約 8. 9 (圖 3A 和 3B)。
實(shí)施例2為了確定從PVD-32細(xì)胞中分離的信號(hào)肽對(duì)細(xì)菌素0R-7產(chǎn)生的效力，PVD-32細(xì)胞在燒瓶中用約300ml大約10%的布氏肉湯培養(yǎng)。將約Iml含有大約109CFU/ml的PVD-32 細(xì)胞懸浮液加至所述的肉湯，并添加大約Iml含有約109CFU/ml的LWP 252細(xì)胞懸浮液，還 有約0. 10mg/ml,0. 01mg/ml或0. 001mg/ml的PVD 32信號(hào)肽。對(duì)照樣品不含所述信號(hào)肽。 一些樣品含不同濃度的信號(hào)肽和生產(chǎn)者菌株，不含誘導(dǎo)者菌株。兩個(gè)樣品含0. lmg/ml來(lái)自 LffP 760的信號(hào)肽或0. lmg/ml來(lái)自LWP-50-52的信號(hào)肽之一，以及誘導(dǎo)者和生產(chǎn)者菌株兩 者。所述燒瓶采用大約120rpm的攪拌速度在約37°C培養(yǎng)大約14小時(shí)。結(jié)果總結(jié)在以下的 表2中。
在14小時(shí)結(jié)束時(shí)，來(lái)自培養(yǎng)物的上清液和1毫升再生瓊脂糖凝膠SP FastFlow 一 起放入500ml (ν/ν 500 1)離心燒瓶中。在攪拌下將其在室溫溫育大約1小時(shí)。然后用 約IOOml ρΗ約6. 4的0. 2Μ TRIS-HCl緩沖液洗滌懸浮物。通過(guò)用約IOOml ρΗ約5. 8的約 0. 2Μ的K2HPO4在約7，000 X g離心約10分鐘洗提細(xì)菌素。細(xì)菌素級(jí)份抵抗空腸彎曲桿菌和 腸炎沙門氏菌的拮抗活性用上面描述的斑點(diǎn)試驗(yàn)評(píng)定。細(xì)菌素級(jí)份的純度水平用SDS-PAGE 確定。級(jí)份的等電點(diǎn)用等電聚焦確定。對(duì)于所有細(xì)菌素級(jí)份的蛋白質(zhì)濃度用分光光度計(jì)在 215nm確定。結(jié)果表示在下面的表2中。如表2中所見，與LWP-252 (誘導(dǎo)者)在約0. Olmg純化的來(lái)自PVD-32的信號(hào)肽一 起培養(yǎng)PVD-32(生產(chǎn)者)將細(xì)菌素0R-7的產(chǎn)量增加到達(dá)到1升培養(yǎng)液約214. 5mg。添加分 離自菌株LWP 50-52和LWP 760的信號(hào)肽不增加相對(duì)對(duì)照的細(xì)菌素0R-7的產(chǎn)量。這表明 這樣的事實(shí)，即信號(hào)肽對(duì)生產(chǎn)者是強(qiáng)烈特異性的。當(dāng)所述信號(hào)肽、生產(chǎn)者和誘導(dǎo)者同時(shí)引入 培養(yǎng)液時(shí)，細(xì)菌素的合成增加。為評(píng)定所述信號(hào)肽在按比例放大的培養(yǎng)下對(duì)于細(xì)菌素產(chǎn)生的作用，在含大約6 升培養(yǎng)液的生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)生產(chǎn)菌株和誘導(dǎo)菌株。培養(yǎng)物和所述信號(hào)肽的濃度比例是 109CFU/ml 的 PVD-32 (生產(chǎn)者菌株)、109CFU/ml 的 LWP-252 (誘導(dǎo)者菌株)以及 0. Olmg/ml 的純化的來(lái)自PVD-32的信號(hào)肽。在約8、10、12和14小時(shí)的培養(yǎng)后分離細(xì)菌素0R-7。見表 3。純化方案如上所述。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。表2從PVD-32分離的信號(hào)肽對(duì)細(xì)菌素0R-7產(chǎn)生 的影響
表3 桉比例放大條件下牛產(chǎn)者菌株P(guān)VD-32和誘導(dǎo)者菌株LWP 50-52在PVD-32信號(hào)肽存 在下的培養(yǎng)
對(duì)照V-61 生物反應(yīng)器，10%布氏肉湯，PVD-32，LWP252，在 pH 6. 9，37°C，150r. p. m.下， 培養(yǎng)14小時(shí)。信號(hào)肽V-61生物反應(yīng)器，10%布氏肉湯，PVD-32，LffP 252，PVD-32信號(hào) 肽-0.2mg在pH 6. 9，37°C，150r.p.m.下，培養(yǎng)14小時(shí)。在從PVD-32分離出的特定信號(hào) 肽的存在下PVD-32 (生產(chǎn)菌株)和LWP 252 (誘導(dǎo)菌株)的共同培養(yǎng)物允許每升培養(yǎng)液約 214-225毫克的細(xì)菌素0R-7的產(chǎn)生。
實(shí)施例3為了確定從LWP 50-52中分離的信號(hào)肽對(duì)細(xì)菌素50_52產(chǎn)生的效力，如實(shí)施例2 所描述的在37°C培養(yǎng)LWP 50-52。將約Iml含有約109CFU/ml的LWP 50-52細(xì)胞懸浮液加 至10%的布氏肉湯，將約109CFU/ml的誘導(dǎo)者菌株LWP-320加至所述肉湯，并且還添加約 0. 10mg/ml,0. 01mg/ml，或0. 001mg/ml的LWP 50-52信號(hào)肽。對(duì)照樣品不含所述信號(hào)肽。一 些樣品含不同濃度的信號(hào)肽和生產(chǎn)者菌株，不含誘導(dǎo)者菌株。兩個(gè)樣品含0. 10mg/ml來(lái)自 LffP 760的信號(hào)肽或0. 10mg/ml來(lái)自PVD-32的信號(hào)肽之一，以及誘導(dǎo)者和生產(chǎn)者菌株兩者。 所述燒瓶采用約120rpm的攪拌速度在約37°C培養(yǎng)約14小時(shí)。結(jié)果總結(jié)在以下的表4中。細(xì)菌素50-52的分離包括兩步(1)從培養(yǎng)液的上清液中分離細(xì)菌素，以及(2)從 誘導(dǎo)菌株和生產(chǎn)菌株兩者的細(xì)胞沉淀中分離細(xì)菌素。在步驟1中，收獲所述培養(yǎng)物并通過(guò) 在約10，OOOXg離心約15min以沉淀所述細(xì)胞來(lái)分離。上清液被施于辛基-瓊脂糖凝膠 4FastFl0W(快速流動(dòng))柱，采用約20mM pH約7. O的K2HPO4的洗脫緩沖液以重新獲得所 述細(xì)菌素。來(lái)自步驟2的細(xì)胞沉淀被懸浮在pH約5. 6的具有約0.7%的NaCl的磷酸鹽緩 沖液(洗脫緩沖液)中，并將所述的懸浮液混合并溫育約20分鐘。溫育后，將懸浮液在約 10，OOOXg離心約15分鐘。采用含約IOmM的Tris-HCl和約125mM的NaCl，pH約7. 5的 洗脫緩沖液，用在Superose SP Fast Flow上的離子交換色譜，從所述的上清液中分離細(xì)菌 素。所述細(xì)菌素級(jí)份抵抗空腸彎曲桿菌和腸炎沙門氏菌的拮抗活性在斑點(diǎn)試驗(yàn)中評(píng)定。細(xì) 菌素的純度水平用SDS-PAGE確定。所述級(jí)份的等電點(diǎn)用等電聚焦確定。對(duì)于所有細(xì)菌素 級(jí)份的蛋白質(zhì)濃度用分光光度法在約215nm確定。表4從LWP 50-52分離的信號(hào)肽對(duì)細(xì)菌 素50-52產(chǎn)牛的影響
如從表4可見，在約0. Olmg/mL來(lái)自LWP 50-52的信號(hào)肽的存在下同時(shí)培養(yǎng)LWP50-52 (生產(chǎn) 者菌株)和LWP 50-52 (誘導(dǎo)者菌株)約8小時(shí)將細(xì)菌素50-52的產(chǎn)量增加到直到1升培 養(yǎng)液約353. Img0添加分離自PVD-32和LWP 760的信號(hào)肽相對(duì)于對(duì)照不增加細(xì)菌素50-52 的產(chǎn)量。應(yīng)該注意到如果信號(hào)肽在培養(yǎng)開始大約2小時(shí)后引入培養(yǎng)液，總的培養(yǎng)時(shí)間為約 12小時(shí)，細(xì)菌素的合成被最大化地增加。 為評(píng)定所述信號(hào)肽在按比例放大的培養(yǎng)下對(duì)于細(xì)菌素生產(chǎn)的影響，在含有約6升 介質(zhì)的V-6升生物反應(yīng)器中培養(yǎng)液的生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)生產(chǎn)菌株和誘導(dǎo)菌株。對(duì)于10%的 布氏肉湯、LWP 50-52,LffP 320，維持如表5的培養(yǎng)物和所述信號(hào)肽的濃度比例，在培養(yǎng)約2 小時(shí)后添加0. 01mg/ml的LWP 50-52信號(hào)肽。如上所述，細(xì)菌素50-52的分離在按如上所述 培養(yǎng)約8、10、12和14小時(shí)后進(jìn)行。對(duì)照含有pH約6. 9，在約37°C，以及約150rpm的10% 的布氏肉湯、LffP 50-52、LffP 320。在培養(yǎng)約12小時(shí)后分離細(xì)菌素50-52。對(duì)于第二個(gè)條 件，除在培養(yǎng)2小時(shí)后添加大約0.22mg的LWP 50-52信號(hào)肽之外，所述條件是相同的。結(jié) 果下面示于表5。每個(gè)條件重復(fù)3次。^t 5. LffP 50-52信號(hào)肽的存在下牛產(chǎn)者LWP 50-52 和誘導(dǎo)者菌株LWP-320的培養(yǎng)
在LWP 50-52信號(hào)肽的存在下與LWP-320 —起培養(yǎng)LWP 50-52，所述的LWP 50-52信號(hào)肽在 培養(yǎng)開始約2小時(shí)后引入，在大約12小時(shí)的培養(yǎng)后導(dǎo)致約360mg/升的細(xì)菌素50-52的產(chǎn)生。
實(shí)施例4為了確定從LWP-760中分離的信號(hào)肽對(duì)細(xì)菌素760產(chǎn)生的效力，如實(shí)施例2所描 述的在約37°C培養(yǎng)LWP-760。將約Iml含有大約109CFU/ml的LWP-760細(xì)胞懸浮液加至 約10%的布氏肉湯，并在培養(yǎng)時(shí)或在培養(yǎng)開始約2，4，6小時(shí)后添加大約Iml的0. lmg/ml, 0.01mg/ml，或0.001mg/ml的LWP-760信號(hào)肽制備物。對(duì)于另一系列變量，將約Iml含有約 109CFU/ml的LWP-760細(xì)胞懸浮液加至約10%的布氏肉湯，將大約Iml含有大約109CFU/ml 的誘導(dǎo)者菌株LWP-320細(xì)胞懸浮液加至所述肉湯，并在培養(yǎng)時(shí)或在開始培養(yǎng)約2，4或6小 時(shí)后添加大約Iml的大約0. lmg/ml, 0. Olmg/ml，或0. 00lmg/ml的LWP-760信號(hào)肽制備物。 下一系列條件包括含有大約109CFU/ml的約Iml的LWP-760細(xì)胞懸浮液被加至約10%的布 氏肉湯，將大約Iml含有大約109CFU/ml的誘導(dǎo)者菌株LWP-320細(xì)胞懸浮液加至所述肉湯， 并在培養(yǎng)開始時(shí)添加約Iml大約0. lmg/ml的純化的LWP-50-52信號(hào)肽或純化的PVD-32信 號(hào)肽的制備物。對(duì)照在約10%布氏肉湯中含有約Iml含大約109CFU/ml的LWP-760細(xì)胞懸 浮液以及含大約109CFU/ml的誘導(dǎo)者菌株LWP-320細(xì)胞懸浮液。采用在約10，OOOXg下離心約15分鐘分開細(xì)胞和培養(yǎng)液來(lái)分離細(xì)菌素760。上 清液被施于辛基瓊脂糖凝膠4Fast Flow(快速流動(dòng))柱以重新獲得所述細(xì)菌素，并采用 約15mM的pH約6. 3的K2HPO4洗脫緩沖液洗脫。細(xì)胞小團(tuán)被懸浮在pH約5. 6的約0. 7% 的NaCl的磷酸鹽緩沖液(洗脫緩沖液)中，并將所述的懸浮液混合并溫育約20分鐘。溫 育階段后，將懸浮液在約10，OOOXg下離心約15分鐘。上清液被施于Superose SP Fast Flow (快速流動(dòng))柱以分離所述細(xì)菌素，采用約25mM的Tris-HCl以及約90mMNaCl的pH約 6.4的洗脫緩沖液。所述細(xì)菌素級(jí)份抵抗空腸彎曲桿菌和腸炎沙門氏菌的拮抗活性在如上 所述的斑點(diǎn)試驗(yàn)中評(píng)定。細(xì)菌素760的純度水平用SDS-PAGE確定。等電點(diǎn)用等電聚焦確 定。蛋白質(zhì)濃度用分光光度法在約215nm確定。結(jié)果在下面的表6中展示。表6LWP 760 信號(hào)肽對(duì)細(xì)菌素760產(chǎn)牛的影響
如從表6可見，誘導(dǎo)者菌株LWP 760和誘導(dǎo)者菌株320與約0. Olmg來(lái)自LWP 760的信號(hào)肽 的培養(yǎng)在4小時(shí)的培養(yǎng)中將細(xì)菌素760的產(chǎn)量增加到達(dá)到1升培養(yǎng)液大約693mg。引入來(lái) 自PVD 32和LWP 50-52的信號(hào)肽相對(duì)于對(duì)照不增加細(xì)菌素760的細(xì)菌素生產(chǎn)的產(chǎn)量。
為評(píng)定所述信號(hào)肽在按比例放大的培養(yǎng)下對(duì)于產(chǎn)生細(xì)菌素的作用，在有6升10% 的布氏肉湯的V-6升生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)LWP 760和LWP 320。維持如上表7中的產(chǎn)生510 毫克/升的細(xì)菌素760的條件的培養(yǎng)物和所述信號(hào)肽的濃度比例。在培養(yǎng)約8、10、12和14 小時(shí)后分離細(xì)菌素760。最大的細(xì)菌素產(chǎn)生發(fā)生在培養(yǎng)12小時(shí)之后(下表7)。表7.桉比 例放大的條件下在LffP信號(hào)flt的存在下牛產(chǎn)者菌株LffP 760和i秀導(dǎo)者菌株LWP-320的培養(yǎng)
對(duì)照V-61 生物反應(yīng)器，10%布氏肉湯，LWP 760, LffP 320，在 pH 6. 9，37°C，150r. p. m.下， 培養(yǎng)12小時(shí)。信號(hào)肽V-61反應(yīng)器，10%布氏肉湯，LWP 760, LffP 320, LffP 760信號(hào)肽-在 培養(yǎng)2小時(shí)后添加0. 22mg, pH 6. 9，37°C，150r. p. m.，培養(yǎng)12小時(shí)。
實(shí)施例5針對(duì)所述信號(hào)肽的氨基酸序列由Edman降解確定，按產(chǎn)生商的說(shuō)明使用491cLC自 動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems, La Jolla, Calif.)。每種信號(hào)肽的分子量的確定是通過(guò) 具有電噴霧離子化質(zhì)譜(API IIITAGA 6000E，CJEX，Mumbai，印度)的基質(zhì)輔助基質(zhì)解吸和 電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-T0FMS)按產(chǎn)生商的說(shuō)明進(jìn)行的。結(jié)果示于下表8中。激 8. Mmm 0R-7, LWP50-52以及LWP760的氨某酸序歹U及其相應(yīng)的信號(hào)月太
氨基酸序列分子量
(Da)a
細(xì)菌素KTYYGTNGVHCTKNSLWGKVR1KNMKYDQNTTYMGRLQDIL
LGWATGAFGKTH5， 123
0R-7SEQ ID NO 2
PVD 32MVTKSLVLAWVVALLACGMVKGLT2，347
信號(hào)肽SEQ ID NO 3
細(xì)菌素TTKNYGNGVCNSVNWCQCGNVWASCNLATGCAAWLCKLA3，932
50-52SEQ ID NO 4
LWP 50-52 TNVTKSWWVLAGCNQVVASNCNCGNVKGLT3，065
信號(hào)肽SEQ ID NO 5 前述詳細(xì)描述是為了舉例說(shuō)明的目的。這些細(xì)節(jié)僅僅是為了該目的，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以做出變化而不會(huì)背離本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
一種具有SEQ ID NO 1的羧基端氨基酸序列的肽。
2.一種具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的肽。
3.一種具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列的肽。
4.一種具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列的肽。
5.一種用于增加細(xì)菌素產(chǎn)生的方法，包括a.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌和誘導(dǎo)者細(xì)菌，b.添加具有SEQID NO 1的羧基端氨基酸序列的肽，以及c.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
6.一種用于刺激具有SEQ ID NO 2的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括a.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRL-B-30514和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRL30884，b.添加具有SEQID NO 3的肽，以及c.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
7.一種用于刺激具有SEQ ID NO 4的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括a.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRLB-30746和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRLB-30510，b.向所述體系添加具有SEQIDNO 5的肽，以及c.培養(yǎng)所述細(xì)菌和肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
8.一種用于刺激具有SEQ ID NO 6的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括d.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRLB-30745和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRLB-30510，e.添加具有SEQID NO 7的肽，以及f.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
9.一種用于刺激具有SEQ ID NO 2的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括a.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRL-B-30514和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRL30884，b.添加具有SEQID NO 1的羧基端氨基酸序列的肽，以及c.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
10.一種用于刺激具有SEQ ID NO 4的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括g.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRLB-30746和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRLB-30510，h.向所述體系添加具有SEQID NO 1的羧基端氨基酸序列的肽，以及i.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
11.一種用于刺激具有SEQ ID NO 6的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括j.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRL B-30745和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRL B-30510,k.添加具有SEQ ID NO 1的羧基端氨基酸序列的肽，以及l(fā).培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
全文摘要
由產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌產(chǎn)生的新型的肽在體外刺激細(xì)菌素的產(chǎn)生。為了實(shí)現(xiàn)細(xì)菌肽產(chǎn)生的增加，在新的誘導(dǎo)者細(xì)菌和具有VKGLT的羧基端序列的肽的存在下培養(yǎng)所述生產(chǎn)者細(xì)菌。
文檔編號(hào)A61K38/04GK101848723SQ200680051931
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日
發(fā)明者B·V·葉魯斯拉諾夫, E·A·斯韋托奇, N·J·斯特恩, V·P·列夫查克, V·V·佩雷列金 申請(qǐng)人:由農(nóng)業(yè)部部長(zhǎng)代表的美利堅(jiān)合眾國(guó);國(guó)家應(yīng)用微生物和生物技術(shù)研究中心