專利名稱：：包括ppar激動(dòng)劑的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：0001本發(fā)明涉及促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞或角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑，包括PPAR(過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體)a或S作為活性成分。
背景技術(shù)：
：0002瞼板腺為包括在上和下眼瞼內(nèi)的產(chǎn)生脂質(zhì)的腺體，通過(guò)位于眼瞼睫毛的結(jié)膜側(cè)的開(kāi)口分泌脂質(zhì)。構(gòu)成淚液的脂質(zhì)層含有瞼板腺提供的液體作為組分，防止淚液從眼表面蒸發(fā)。已知，在瞼板腺功能異常或瞼板炎患者中，瞼板腺的功能惡化，并且脂質(zhì)分泌量減少，引起蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼、角膜結(jié)膜上皮病癥、角膜上皮糜爛和角膜潰瘍(它們與干眼有關(guān))，等等。此外，角膜由外胚層上皮和中胚層前界層(Bowman膜)/基質(zhì)/后界層(Descemet膜)/內(nèi)皮構(gòu)成。由于角膜是眼球的最前部，其容易受到外界環(huán)境的影響，結(jié)果出現(xiàn)多種病癥。與角膜上皮細(xì)胞的損傷或缺陷有關(guān)的疾病的實(shí)例包括干眼綜合征、角膜潰瘍、淺層點(diǎn)狀角膜炎、角膜上皮糜爛、與角膜損害有關(guān)的眼變應(yīng)性疾病如春季結(jié)膜炎和特應(yīng)性角膜結(jié)膜炎，等等。0003另一方面，PPAR為核內(nèi)受體之一，其在幾乎所有的脊推動(dòng)物中表達(dá)，據(jù)稱是與細(xì)胞內(nèi)糖-脂代謝和細(xì)胞分化緊密相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子族。作為亞型，a、5和y是已知的。一些情況下PPAR5被稱為PPARP(非專利文獻(xiàn)1)。作為PPAR在眼組織中的分布，已知PPARa和(3在兔的角膜上皮細(xì)胞中表達(dá)(非專利文獻(xiàn)2)以前，有報(bào)道稱具有PPAR激活作用的5-[4-(6-曱氧基-l-甲基-lH-苯并咪唑-2-基甲氧基)苯曱基]噻唑烷-2，4-二酮可被用作治療角膜結(jié)膜病癥的試劑(專利文獻(xiàn)1和2),以及在治療眼病(結(jié)膜炎、干眼綜合征、角膜炎等)中給予PPARot、S或Y激動(dòng)劑(專利文獻(xiàn)3)。此外，已知PPARoc在肝、腎等中有分布，并且影響脂代謝/運(yùn)輸，進(jìn)一步地，有報(bào)告稱其激動(dòng)劑可被用作治療角膜疾病的試劑(專利文獻(xiàn)4)。關(guān)于PPAR5激動(dòng)劑，之前已有報(bào)告稱該激動(dòng)劑促進(jìn)大鼠皮脂腺上皮細(xì)胞的增殖和分化(非專利文獻(xiàn)3)，并促進(jìn)皮膚損傷的愈合(非專利文獻(xiàn)4)。另外，已知通過(guò)給予非蓬唑烷二酮PPAR配體和GLP-1衍生物刺激P-細(xì)胞增殖(專利文獻(xiàn)5)和通過(guò)PPARY激動(dòng)劑匹格列酮抑制白血病細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的增殖(專利文獻(xiàn)6)的方法。0004但是，PPARa、5和y在每種動(dòng)物種類和每種組織或細(xì)胞中的表達(dá)和功能包括4艮多待回答的問(wèn)題，并且哪種PPAR激動(dòng)劑可用于人眼疾病是未知的。[專利文獻(xiàn)1]WO2005/039574[專利文獻(xiàn)2]日本專利申請(qǐng)公開(kāi)(JP-A)號(hào)2001-39976[專利文獻(xiàn)3]WO2002/076177[專利文獻(xiàn)4]JP-ANo.2005-008570[專利文獻(xiàn)5]WO2002/69994[專利文獻(xiàn)6]WO1998/25598[非專利文獻(xiàn)1]JMedChem2000,43:527-550[非專利文獻(xiàn)2]JBiolChem2000,275:2837[非專利文獻(xiàn)3]MolecularGeneticandMetabolism2001，74:362-369[非專利文獻(xiàn)4]AmJClinDermatol2003，4(8):523-530
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問(wèn)題0005本發(fā)明的目的是提供能夠促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑，其可為對(duì)諸如干眼等的眼病的基礎(chǔ)治療，以及用于諸如瞼板腺功能異常、蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼等的眼病的治療劑，其含有所述的促進(jìn)劑。實(shí)現(xiàn)目的的手段0006鑒于上述問(wèn)題，本發(fā)明人進(jìn)行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPARa或S激動(dòng)劑具有促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞增殖的活性，最終完成本發(fā)明。相應(yīng)地，本發(fā)明包括至少以下內(nèi)容(1)促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的試劑，包括PPARa或S激動(dòng)劑作為活性成分。(2)促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑，包括PPARa或S激動(dòng)劑作為活性成分。(3)治療瞼板腺功能異常(meibomianglanddysfunction)的試劑，包括PPARoc或S激動(dòng)劑作為活性成分。(4)治療角膜上皮病癥的試劑(anagentfortreatingacornealepithelialdisorder),包括PPARa或5激動(dòng)劑作為活性成分。(5)治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼(hyperevaporativedryeye)的試劑，包4舌PPARa或5激動(dòng)劑作為活性成分。(6)促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的試劑，包括PPARS激動(dòng)劑作為活性成分。(7)促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑，包括PPAR5激動(dòng)劑作為活性成分。(8)治療瞼板腺功能異常的試劑，包括PPARS激動(dòng)劑作為活性成分。(9)治療角膜上皮病癥的試劑，包括PPAR5激動(dòng)劑作為活性成分。(10)治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的試劑，包括PPARS激動(dòng)劑作為活性成分。(11)根據(jù)(1)至(5)任一項(xiàng)的試劑，其中PPARa或5激動(dòng)劑為式(I)表示的化合物或其藥理學(xué)可接受的鹽10007[化學(xué)式1]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>0008其中A為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)，B為選自畫(huà)CO-、-NH-、-(CH2)n-S-、醒(CH2)n-0-和-0-(CH2)n-0-的連接物，其中n為1至3的整數(shù)，X和Y相同或不同，各為碳原子或氮原子，Z為氧原子、硫原子或-CH2-，Ar!為5至6元芳環(huán)基團(tuán)，任選地具有1至3個(gè)取代基，Rj和R2相同或不同，各為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)，以及R3為氬、鹵素原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)。(l2)根據(jù)(6)至(10)任一項(xiàng)的試劑，其中PPARS激動(dòng)劑為式(II)表示的化合物或其藥理學(xué)可接受的鹽[化學(xué)式2]0010<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中A為氬原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)，B為選自-(CH2)n-S-和-0-(CH2)n-0-的連接物，其中n為1至3的整數(shù)，X和Y相同或不同，各為碳原子或氮原子，Z為氧原子、硫原子或-CH2-，An為5至6元芳環(huán)基團(tuán)，任選地具有1至3個(gè)取代基，和R2相同或不同，各為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)，以及R3為氫、卣素原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)。(13)根據(jù)(11)或(12)的試劑，其中PPARS激動(dòng)劑為(4-(3-(4-乙酰基-3-羥基-2-丙基)苯氧基)丙氧基苯氧基)乙酸、(2-曱基-4-(((4-甲基-2-(4-(三氟曱基)苯基)-5_噻唑基)曱基)硫基)苯氧基)乙酸或(4-(((2-(3-氟-(4-(三氟曱基)苯基)-4-曱基-5-噻唑基)甲基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸，或其藥理學(xué)上可接受的鹽。(14)根據(jù)(ll)的試劑，其中PPARa激動(dòng)劑為2-(4-(4-氯苯曱?；?苯氧基)-2-曱基丙酸l-甲基乙脂或((4-氯-6-((2,3-二曱基苯基)氨基)-2-嘧啶基)硫基)乙酸，或其藥理學(xué)上可接受的鹽。的用途。5一&、工(16)PPARa或5激動(dòng)劑在生產(chǎn)促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑中的用途。(17)PPARa或S激動(dòng)劑在生產(chǎn)治療瞼板腺功能異常的試劑中的用途。(18)PPARa或5激動(dòng)劑在生產(chǎn)治療角膜上皮病癥的試劑中的用途。(19)PPARa或S激動(dòng)劑在生產(chǎn)治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的試劑中的用途。(20)PPARS激動(dòng)劑在生產(chǎn)促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的試劑中的用途。(21)PPAR5激動(dòng)劑在生產(chǎn)促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑中的用途。(22)PPARS激動(dòng)劑在生產(chǎn)治療瞼板腺功能異常的試劑中的用途。(23)PPAR5激動(dòng)劑在生產(chǎn)治療角膜上皮病癥的試劑中的用途。(24)PPARS激動(dòng)劑在生產(chǎn)治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的試劑中的用途。(25)促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的方法，包括向需要促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的個(gè)體給予有效量的PPARa或S激動(dòng)劑。(26)促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的方法，包括向需要促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的個(gè)體給予有效量的PPARa或S激動(dòng)劑。(27)根據(jù)(25)的方法，其被執(zhí)行以治療瞼板腺功能異常。(28)根據(jù)(26)的方法，其被執(zhí)行以治療角膜上皮病癥。(29)治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的方法，包括向患有蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的患者給予有效量的PPARa或S激動(dòng)劑。(30)促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的方法，包括向需要促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的個(gè)體給予有效量的PPAR5激動(dòng)劑。(31)促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的方法，包括向需要促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的個(gè)體給予有效量的PPARS激動(dòng)劑。(32)根據(jù)(30)的方法，其被執(zhí)行以治療瞼板腺功能異常。(33)根據(jù)(31)的方法，其被執(zhí)行以治療角膜上皮病癥。(34)治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型千眼的方法，包括向患有蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的患者給予有效量的PPARS激動(dòng)劑。發(fā)明效果0011根據(jù)本發(fā)明，提供了促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的新試劑或促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的新試劑，并且該促進(jìn)劑促進(jìn)了瞼板腺上皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞的增殖。此外，本發(fā)明的治療可有效地用于治療或改善疾病，如瞼板腺功能異常、角膜上皮病癥和蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明0012圖1顯示了培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞(上列)、培養(yǎng)的兔角膜上皮細(xì)胞(中列)、以及培養(yǎng)的猴瞼板腺上皮細(xì)胞(下歹'j)中PPARa、S或ymRNA的表達(dá)。實(shí)施本發(fā)明的最佳方式0013本發(fā)明提供了促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的試劑，包括PPARot或5激動(dòng)劑作為活性成分。該促進(jìn)劑促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞的增殖。本發(fā)明還提供了促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑，包括PPARa或S激動(dòng)劑作為活性成分。該促進(jìn)劑促進(jìn)了角膜上皮細(xì)胞的增殖。本發(fā)明中，促進(jìn)細(xì)胞增殖的試劑意味著具有促進(jìn)細(xì)胞分裂以增加細(xì)胞數(shù)量作用的試劑和具有抑制細(xì)胞死亡以增加細(xì)胞數(shù)量作用的試劑。0014本發(fā)明的促進(jìn)劑包括PPARa或5激動(dòng)劑作為活性成分。PPARa激動(dòng)劑指具有結(jié)合并激活PPARa的作用的物質(zhì)。另外，PPARS激動(dòng)劑指具有結(jié)合并激活PPAR5的作用的物質(zhì)。0015作為PPARa或S激動(dòng)劑，可纟是及各種已知的PPARa或S激動(dòng)劑。PPARa或S激動(dòng)劑的特定實(shí)例包括例如WO2001/00603、W099/62872、WO2002/100813、W097/28149、WO2004/022551、WO2001/79197、WO2003/099793、W02005/105736、WO2005/105726、WO2005/085235、WO2005/113600、W02005/105754、WO2005/049606、WO2004/111020、WO2006/055187、WO2006/084176、WO2005/060958、WO2005/097786、W02004/092117、WO2005/037763、WO2005/030694、WO2005/016335、WO2003/074495、WO2004/058174、JP2003-171275A、JP2005-179281A、WO2006/031969、WO2005/097763、WO2004/063165、WO2002/050048、WO2005/090966、WO2003/099793、WO2002/076959、WO2002/053547、WO2001/00603、W097/28149、WO2004/063184、WO2006/090920、WO2006/059744、WO2006/041197、WO2003/033493、WO2003/016291、WO2002/076957、WO2002/046176、WO2002/046154、WO2002/014291、WO2001/079197等等中描述的物質(zhì)。0016PPARa或S激動(dòng)劑化合物的特定實(shí)例包括2-(4-(4-氯苯甲?；?苯氧基)-2-甲基丙酸l畫(huà)曱基乙酉旨(非諾貝特;CAS登記號(hào)49562-28-9)、((4國(guó)氯-6-((2，3-二曱基苯基)氨基)-2-嘧啶基)硫基)乙酸(WY-14643;CAS登記號(hào)50892-23-4)、(4-(3-(4-乙?；?3-羥基-2-丙基)苯氧基)丙氧基苯氧基)乙酸(L畫(huà)165041;CAS登記號(hào)79558-09-1)、(2-曱基-4-(((4-甲基-2-(4-(三氟甲基)苯基)-5-(噻唑基)甲基)硫基)苯氧基)乙酸(0\￥-501516;CAS登記號(hào)317318-70-0)、(4-(((2-(3-氟-4-(三氟曱基)苯基)-4-曱基-5-噻唑基)曱基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸(GW-0742;CAS登記號(hào)317318-84-6)、2-曱基-4-((2R)-2-(3-曱基-5-(4-(三氟曱基)苯基)-2-噻吩基)丙氧基)-苯丙酸(CAS登記號(hào)728038-95-7)、2-乙基-2-(4-(4-(4-(4-曱氧基苯基)-哌。秦-1-基)-2-(4-三氟曱基-苯基)-噻唑-5-基曱基磺?；?-苯氧基)丁酸(GSK-677954;CAS登記號(hào)884324-15-6)、(4-(3-(3-苯基-7-丙基-苯并呋喃-6-基氧基)-丙基磺酰基)-苯基)乙酸(L-796449;CAS登記號(hào)194608-80-5)、以及2-(4-(3-(1-(2-(2-氯-6-氟-苯基)-乙基)-3-(2,3-二氯-苯基)-脲基)-丙基)-苯氧基)-2-曱基丙酸(GW-2433;CAS登記號(hào)227941-61-9)。0017知是否是PPARoc或S激動(dòng)劑的物質(zhì)組^中篩選得、到，并且J種物質(zhì)(化合物.)可以被用作本發(fā)明的活性成分。已知PPARa或S激動(dòng)劑分別結(jié)合PPARot或5的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)，以活化該受體，并調(diào)節(jié)PPAR靶基因的轉(zhuǎn)錄。為了利用這種性能并同時(shí)不影響存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的其它核受體，可通過(guò)釆用LBD和酵母GAL4嵌合受體以及報(bào)告基因的篩選方法選擇新的PPARoc或5激動(dòng)劑。0018作為篩選方法，以PPAR-GAL4測(cè)定舉例說(shuō)明(參考文獻(xiàn)，T.M.Willsonetal.,JournalofMedicinalChemistry，2000，vol.43，No.4,p.528-550和J.M.Lehmannetal.，TheJournalofBiologicalChemistry,1995，vol.270，No.22,p.12953-12956)。具體地，實(shí)例包括的方法包括(a)向細(xì)胞引入載體和報(bào)告質(zhì)粒的步驟，該載體用于表達(dá)酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)和PPARoc或5的LBD的融合蛋白，該質(zhì)粒含有GAL4的DNA結(jié)合元件和報(bào)告基因，(b)讓細(xì)胞與測(cè)試物接觸、測(cè)量細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)量并將該表達(dá)量與未與測(cè)試物接觸的對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)量進(jìn)行比較的步驟，以及0019土5,'、、'/在上述方法的步驟(a)中，所使用的細(xì)胞為不內(nèi)源表達(dá)GAL4的細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。報(bào)告基因可以為編碼可檢測(cè)的蛋白或酶的基因，其實(shí)例包括LUC(熒光素酶)基因、SPAP(分泌的胎盤堿性磷酸酶)基因、CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因等。'制備融合蛋白表達(dá)載體和報(bào)告質(zhì)粒以及將該載體和質(zhì)粒引入細(xì)胞可通過(guò)上述參考文獻(xiàn)或本身已知的方法進(jìn)行。0020J在上述方法的步驟(b)中，測(cè)試物可以為任何已知的化合物或新化合物，其實(shí)例包括核酸、糖、脂、蛋白、肽、有機(jī)低分子量化合物、采用組合化學(xué)技術(shù)制備的化合物庫(kù)、通過(guò)固相合成方法或噬菌體展示技術(shù)制備的隨機(jī)肽庫(kù)、以及源于微生物、動(dòng)物和植物、海洋生物等的天然組分。此外，在步驟(b)中，由于測(cè)試物存在或不存在導(dǎo)致的PPARot或5轉(zhuǎn)錄活性通過(guò)所謂的報(bào)告物測(cè)定進(jìn)行研究。取決于所使用的報(bào)告基因，凈艮告物測(cè)定可通過(guò)本身已知的方法進(jìn)行。在上述方法的步驟(c)中，當(dāng)存在測(cè)試物時(shí)的報(bào)告物活性顯著高于其不存在時(shí)的報(bào)告物活性時(shí)，則測(cè)試物可一皮確定為具有PPARoc或S激動(dòng)劑活性的化合物。當(dāng)通過(guò)ECso值表示時(shí)，用在本發(fā)明中的PPARa激動(dòng)劑對(duì)人PPARa的活性不超過(guò)50pM、優(yōu)選不超過(guò)10iaM、進(jìn)一步優(yōu)選不超過(guò)5fiM。當(dāng)通過(guò)ECso值表示時(shí)，用在本發(fā)明中的PPARS激動(dòng)劑對(duì)人PPARS的活性不超過(guò)10(iM、優(yōu)選不超過(guò)1jiM、進(jìn)一步優(yōu)選不超過(guò)0.1fiM。EC50值為采用人PPARa或5通過(guò)PPAR-GAL4測(cè)定測(cè)量的值(參見(jiàn)T.M.Willsonetal.，JournalofMedicinalChemistry,2000,vol.43,No.4,p.527-550)。PPARot或S激動(dòng)劑的優(yōu)選實(shí)例包括具有以下式(I)表示的結(jié)構(gòu)的化合物或其藥理學(xué)上可接受的鹽0021002200230024[化學(xué)式3]0025其中A為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)，B為選自畫(huà)CO-、-NH-、-(CH2)n-S-、隱(CH2)n-0畫(huà)和-0-(CH2)n-0-的連接物，其中n為1至3的整數(shù)，X和Y相同或不同，各為碳原子或氮原子，Z為氧原子、硫原子或-CH2-,An為5或6元芳環(huán)基團(tuán)，任選地具有1至3個(gè)取代基，Ri和R2相同或不同，各為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)，以及R3為氫、鹵素原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)。0026對(duì)于上式(I)中的A,"碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)"的實(shí)例包括曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、1,2-二曱基丙基、己基、l-甲基戊基、2-甲基戊基、3-曱基戊基、4-曱基戊基、1,1-二曱基丁基、1，2-二曱基丁基、1，3-二曱基丁基、2,2-二曱基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、l-乙基-2-曱基丙基、1，1，2-三甲基丙基等。碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)優(yōu)選異丙基。0027對(duì)于上述式(I)中的B,連接物優(yōu)選-CO-、-NH-、《H2-S-或-0-(CH2)3-0-,更優(yōu)選-CHrS-或-0-(CH2)3-0-。0028對(duì)于上述式(I)中的Ar,，5或6元芳環(huán)基團(tuán)的實(shí)例包括苯基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、嗯唑基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、咪唑基、吡唑基、1,2,3-嗯二唑基、1,2,4-P惡二唑基、1,3,4-嚼二唑基、呋咱基、1,2，3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、1,2，3-三唑基、1，2,4-三哇基、四唑基、p比咬基、噠。秦基、嘧啶基、p比。秦基、三漆基等。該芳族環(huán)基團(tuán)優(yōu)選苯基或噻唑基。0029上述式(I)中可以具有的取代基的實(shí)例包括卣素原子、羥基基團(tuán)、碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)、碳原子數(shù)1至6的卣代烷基基團(tuán)、碳原子數(shù)2至7的?；腿芜x具有碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)或碳原子數(shù)1至6的卣代烷基基團(tuán)的苯基基團(tuán)。優(yōu)選的取代基為氯原子、羥基基團(tuán)、甲基基團(tuán)、乙酰基基團(tuán)、4-三氟曱基苯基基團(tuán)和3-氟-4-曱基苯基基團(tuán)。0030對(duì)于上述式(I)中R,或R2，"碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)"的實(shí)例包括曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、l-甲基丁基、2-曱基丁基、1，2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-曱基戊基、3-甲基戊基、4-曱基戊基、1,1-二曱基丁基、1，2-二曱基丁基、1，3-二曱基丁基、2，2-二曱基丁基、2，3-二曱基丁基、3,3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1,2-三曱基丙基等。該碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)優(yōu)選曱基。0031對(duì)于上述式(I)中R3，"鹵素原子"的實(shí)例包括氟原子、氯原子、溴原子等。該卣素原子優(yōu)選為氯原子。0032對(duì)于上述式(I)中R3，"碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)"的實(shí)例包括曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、1,2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-甲基戊基、3-曱基戊基、4-曱基戊基、1,1-二曱基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2,3-二曱基丁基、3,3-二曱基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、l-乙基-2-曱基丙基、1,1,2-三甲基丙基等。該碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)優(yōu)選曱基。0033式(I)表示的化合物藥理學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例包括無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸和酸性氨基酸等的酸加合鹽，其中無(wú)機(jī)酸例如為鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等；有機(jī)酸例如為曱酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、馬來(lái)酸、蘋果酸、酒石酸、甲石黃酸、乙磺酸等；酸性氨基酸例如為天冬氨酸、谷氨酸等。這些鹽還包括其溶物可以含;光學(xué)異構(gòu)體或幾;異i勾體。、這類異構(gòu)體^包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并可根據(jù)本身已知的方法分離和純化。其任何混合物和分離形式都可用在本發(fā)明中。0034本發(fā)明中，式(I)表示的化合物中優(yōu)選的PPARa激動(dòng)劑包括2-(4-(4-氯苯曱酰基)苯氧基)-2-甲基丙酸l-甲基乙酯(非諾貝特；CAS登記號(hào)49562-28-9)、((4-氯-6-((2,3-二曱基苯基)氨基)-2-嘧啶基)硫基)乙酸(WY-14643;CAS登記號(hào)50892-23-4)等。優(yōu)選的PPAR5激動(dòng)劑包括4-(3-(4-乙酰基-3-羥基-2_丙基)苯氧基)丙氧基苯氧基乙酸(L-165041;CAS登記號(hào)79558-09-1)、(2-甲基-4-(((4-曱基-2-(4-(三氟曱基)苯基)-5-瘞唑基)曱基)硫基)苯氧基)乙酸(GW-501516、CAS登記號(hào)317318-70-0)、(4-(((2-(3-氟-4-(三氟曱基)苯基)-4-曱基-5-噻唑基)甲基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸(GW-0742;CAS登記號(hào)317318-84-6)等。0035優(yōu)選的PPARS激動(dòng)劑包括下式(II)表示的化合物和其藥理學(xué)上可接受的鹽0036[化學(xué)式4]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中A為氫原子或碳原子數(shù)l至6的烷基基團(tuán)，B為選自-(CH2)n-S-和-0-(CH2)n-0-的連接物，其中n為1至3的整數(shù)，X和Y相同或不同，各為碳原子或氮原子，Z為氧原子、硫原子或-CH2-,Ar!為5或6元芳環(huán)基團(tuán)，任選地具有1至3個(gè)取代基，R,和R2相同或不同，各為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)，以及R3為氫、卣素原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)。0037對(duì)于上述式(II)中的A，"碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)"的實(shí)例包括曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、1，2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-曱基戊基、3-曱基戊基、4-曱基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二曱基丁基、1,3-二曱基丁基、2，2-二曱基丁基、2,3-二甲基丁基、3，3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、l-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基等。0038對(duì)于上述式(II)中的B，連接物優(yōu)選-CH2-S-或-0-(CH2)3-0-。0039對(duì)于上述式(II)中的Ar,,5或6元芳環(huán)基團(tuán)包括苯基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、P惡唑基、異P惡唑基、噻唑基、異噻唑基、咪唑基、吡唑基、1，2,34惡二唑基、1,2,4-嗯二唑基、1,3,4-P惡二唑基、呋咱基、1,2，3畫(huà)蓬二唑基、1,2,4-漆二唑基、1，3,4-噻二唑基、1，2,3-三唑基、1,2,4-三哇基、四唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡。秦基、三嗪基等。該芳族環(huán)基團(tuán)優(yōu)選苯基或p塞唑基。0040上述式(n)中Ar!可以具有的取代基的實(shí)例包括鹵素原子、羥基基團(tuán)、碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)、碳原子數(shù)1至6的卣代烷基基團(tuán)、碳原子數(shù)2至7的?；鶊F(tuán)和任選具有碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)或碳原子數(shù)1至6的卣代烷基基團(tuán)的苯基基團(tuán)。優(yōu)選的取代基為氯原子、羥基基團(tuán)、曱基基團(tuán)、乙?；鶊F(tuán)、4-三氟曱基苯基基團(tuán)和3-氟-4-曱基苯基基團(tuán)。0041對(duì)于上述式(II)中R,或R2,"碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)"的實(shí)例包括曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、1,2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-曱基戊基、3-甲基戊基、4-曱基戊基、1,1-二曱基丁基、1，2-二曱基丁基、1,3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2,3-二曱基丁基、3，3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、1-乙基-2-曱基丙基、1,1，2-三曱基丙基等。該碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)優(yōu)選曱基。10042對(duì)于上述式(II)中R3，"卣素原子"的實(shí)例包括氟原子、氯原子、溴原子等。該囟素原子優(yōu)選為氯原子。0043對(duì)于上述式(II)中R3，"碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)"的實(shí)例包括曱基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、l-甲基丁基、2-甲基丁基、1,2-二曱基丙基、己基、l-曱基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-曱基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二曱基丁基、1，3-二甲基丁基、2,2-二曱基丁基、2，3-二曱基丁基、3,3-二曱基丁基、l-乙基丁基、2-乙基丁基、l-乙基-2-曱基丙基、1,1,2-三甲基丙基等。該碳原子數(shù)l至6的烷基基團(tuán)優(yōu)選曱基。00441式(II)表示的化合物藥理學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例包括無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸和酸性氨基酸等的酸加合鹽，其中無(wú)機(jī)酸例如為鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等；有機(jī)酸例如為曱酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、延胡索酸、馬來(lái)酸、蘋果酸、酒石酸、甲磺酸、乙磺酸等；酸性氨基酸例如為天冬氨酸、谷氨酸等。這些鹽還包括其溶劑化物。式(II)表示的化合物可以具有不對(duì)稱碳原子或雙鍵，這種化合物可以含有光學(xué)異構(gòu)體或幾何異構(gòu)體。這類異構(gòu)體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并可根據(jù)本身已知的方法分離和純化。其任何混合物和分離形式都可用在本發(fā)明中。0045本發(fā)明中，式(II)表示的化合物中，優(yōu)選的PPARa激動(dòng)劑包括4-(3-(2-丙基-3-羥基-4-乙?；?苯氧基)丙基氧基苯氧基乙酸(L-16S(Ml;CAS登記號(hào)79558-09-1)、(2-甲基-4-(((4-曱基-2-(4-(三氟曱基)苯基)曙5-噻唑基)曱基)硫基)苯氧基)乙酸(GW-501516;CAS登記號(hào)317318-70-0)、(4-(((2-(3-氟-4-(三氟曱基)苯基)-4-曱基-5-噻唑基)曱基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸(GW-0742;CAS登記號(hào)317318-84-6)等。0046在本發(fā)明的促進(jìn)劑中，PPARa或S激動(dòng)劑的含量通常為0.000001-1wt%，優(yōu)選0.00001-1wt%,最優(yōu)選0.0001-0.1wt%。0047除了上述活性成分，本發(fā)明的促進(jìn)劑還可含有任何載體。載體的實(shí)例包括溶劑(例如水、醇等)、緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、谷氨酸、s氨基己酸等)、防腐劑(例如，苯扎氯胺、芐索氯銨(benzethoniumchloride)、葡萄糖酸洗必泰、氯丁醇、苯曱醇、脫氫乙酸鈉、對(duì)羥基苯曱酸鹽、依地酸鈉、硼酸等)、等滲劑(例如，氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、葡萄糖、丙二醇等)等。10048本發(fā)明的促進(jìn)劑可在體外或體內(nèi)用作藥物或測(cè)試試劑。當(dāng)本發(fā)明的促進(jìn)劑被用作測(cè)試試劑時(shí)，其可在生理學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域在多個(gè)方面用作測(cè)試試劑。10049當(dāng)用作藥物時(shí)，由于本發(fā)明的促進(jìn)劑促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞的增殖，其可用做治療與瞼板腺上皮細(xì)胞的損傷或萎縮有關(guān)的疾病以及由于瞼板腺上皮細(xì)胞功能惡化產(chǎn)生的疾病。這種疾病的實(shí)例包括瞼板腺功能異常。此外，由于瞼板腺上皮細(xì)胞在淚液中分泌脂質(zhì)組分，并且這種脂質(zhì)防止了淚液蒸發(fā)并穩(wěn)定淚液層，所以本發(fā)明的治療劑可用于伴有淚液中脂質(zhì)異常(分泌量減少、組分變化)的疾病。這種疾病的實(shí)例包括蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼。此外，本發(fā)明的促進(jìn)劑還可用于治療干眼、角膜潰瘍、淺層點(diǎn)狀角膜炎、角膜上皮糜爛等。00501此外，由于本發(fā)明的促進(jìn)劑促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的增殖，所以其可用作治療與角膜上皮細(xì)胞損傷(即，創(chuàng)傷或缺陷)有關(guān)的疾病。本發(fā)明的促進(jìn)劑可用作治療角膜上皮病癥的試劑，具體地，與內(nèi)源疾病有關(guān)的角膜上皮病癥如Sjogren綜合征、Stevens-Johnsons綜合征或干性角膜結(jié)膜炎(干眼)；手術(shù)后、藥物使用、創(chuàng)傷或使用隱形眼鏡情況下伴隨外源疾病的角膜上皮病癥；或伴隨角膜潰瘍或與角膜損害有關(guān)的眼變應(yīng)性疾病的角膜上皮病癥、春季結(jié)膜炎(springcatarrh)或特應(yīng)性角膜結(jié)膜炎(atopickeratoconjunctivitis)。本發(fā)明的促進(jìn)劑也可用于治療淺層點(diǎn)狀角膜炎(superficialpunctatekeratitis)和角膜上皮潰瘍。此外，本發(fā)明的促進(jìn)劑還可用作促進(jìn)角膜傷口愈合的試劑。0051此外，由于本發(fā)明的促進(jìn)劑具有角膜上皮細(xì)胞增殖促進(jìn)活性和瞼板腺上皮細(xì)胞增殖活性，所以其顯示了直接作用于角膜組織的效果和通過(guò)作用于瞼板腺細(xì)胞而改善淚液功能的效果。結(jié)果，該試劑尤其可用作蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的治療劑。0052本發(fā)明的治療劑中，PPARa或5激動(dòng)劑的含量通常為0.000001至1%重量比，優(yōu)選0.00001至1%重量比，最優(yōu)選0.0001至0.1%重量比。0053以本發(fā)明的促進(jìn)劑或治療劑向其給藥的個(gè)體的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物(例如，人、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、兔、貓、狗、牛、綿羊、猴等)。0054本發(fā)明的治療劑可以諸如滴眼劑、粘性皮膚貼劑、軟膏、洗劑、乳膏、口服制劑等的劑型使用，并且除了上述活性成分外還可含有任意載體，例如藥物上可接受的載體。0055在本發(fā)明的治療劑中，其給藥途徑?jīng)]有特別限制，只要發(fā)揮了上述治療效果，但是該治療劑優(yōu)選局部給藥至眼。用于眼局部給藥的劑型的實(shí)例包括滴眼劑和眼軟膏。例如，當(dāng)本發(fā)明的治療劑被用作滴眼劑或眼軟膏時(shí)，穩(wěn)定劑(例如，亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、依地酸鈉、檸檬酸鈉、抗壞血酸、二丁基羥基甲苯等)、增溶劑(例如，丙三醇、丙二醇、聚乙二醇(macrogol)、聚環(huán)氧乙烷硬化的蓖麻油等)、助懸劑(例如聚乙烯吡咯烷酮、羥基丙基曱基纖維素、羥曱基纖維素、羧甲基纖維素鈉等)、乳化劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮、大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、聚環(huán)氧乙烷硬化的蓖麻油、聚山梨醇酯80等)、緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、谷氨酸、s-氨基己酸等)、增稠劑(例如，水溶性纖維素衍生物如曱基纖維素、羥乙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素或羧曱基纖維素，硫酸軟骨素鈉，透明質(zhì)酸鈉，羧基乙烯聚合物，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇等)、防腐劑(例如，苯扎氯胺、芐索氯銨、葡萄糖酸洗必泰、氯丁醇、苯甲醇、脫氫乙酸鈉、對(duì)羥基苯曱酸酯、依地酸鈉、硼酸等)、等滲劑(例如，氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、葡萄糖、丙二醇等)、pH調(diào)節(jié)劑(例如，鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、乙酸等)、清新劑(例如l-薄荷醇、d-樟腦、d-龍腦、薄荷油等)、軟膏基質(zhì)(白凡士林、純化的羊毛脂、液體石蠟、植物油(橄欖油、山茶油、花生油等)等)可作為添加劑被加入。盡管這些添加劑的量隨所添加的添加劑的種類、用途等而變化，但是添加劑可以以足以實(shí)現(xiàn)其目的的濃度加入。當(dāng)本發(fā)明的治療劑被配制為滴眼劑或眼軟膏時(shí)，它們可以根據(jù)藥學(xué)領(lǐng)域常用的方法產(chǎn)生，并且例如可基于JapanesePharmacopoeia14thedition,GeneralRulesforPreparation,itemofeyedropsanditemofocularointments(日本藥典第14版，一般配制規(guī)則，滴眼劑項(xiàng)和眼軟膏項(xiàng))生產(chǎn)。0056本發(fā)明提供了促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的方法，包括向需要促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的個(gè)體給予有效量的PPARa或S激動(dòng)劑。進(jìn)行該方法來(lái)治療瞼板腺功能異常是所期望的。0057本發(fā)明還提供了促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的方法，包括向需要促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的個(gè)體給予有效量的PPARa或S激動(dòng)劑。進(jìn)行該方法來(lái)治療角膜上皮病癥是所期望的。0058本發(fā)明還提供了治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的方法，包括向患有蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的患者給予有效量的PPARa或5激動(dòng)劑。0059PPARa或5激動(dòng)劑的有效量不能無(wú)條件地定義，其隨化合物的種類，給藥個(gè)體的年齡、體重和狀況，治療目的等而變化。當(dāng)本發(fā)明的促進(jìn)劑或治療劑向人給藥時(shí)，例如含有通常0.000001至1%重量比、優(yōu)選0.00001至1%重量比、最優(yōu)選0.0001至0.1%重量比濃度的PPARa或S激動(dòng)劑的溶液每次給藥向每只眼給藥1或2滴，即每次給藥約50至200|LiL，每天1至8次。具有以上范圍內(nèi)濃度和體積的溶液中含有的PPARa或S激動(dòng)劑的量可作為有效量的實(shí)例被給出。實(shí)施例0060下文中，參照以下測(cè)試實(shí)施例描述本發(fā)明，但是本發(fā)明絕不一皮它們所限制。0061(測(cè)試實(shí)施例1)PPAR激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞數(shù)量增加的作用，采用角膜上皮細(xì)胞1.使用的動(dòng)物使用雄性兔(日本白兔，KITAYAMALABESCo.，Ltd.)。根據(jù)InternationalGuidingPrinciplesforBiomedicalResearchInvolvingAnimals(關(guān)于使用動(dòng)物進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究的國(guó)際指導(dǎo)準(zhǔn)則)使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。2.制備角膜上皮細(xì)胞從兔眼球制備角膜上皮細(xì)胞。從分離的眼球切下角膜，保存在Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS;Invitrogen)中，并將其轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)。以下的細(xì)胞制備操作都是無(wú)菌進(jìn)行的。將分離的角膜片段用向其中加入了1%青霉素-鏈霉素(Invitrogen)的D-PBS洗滌三次，并將其轉(zhuǎn)移至最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM;Invitrogen)。用眼手術(shù)刀(Alcon)將浸泡在MEM中的角膜片段的角膜內(nèi)皮細(xì)胞和Descemet膜剝離，并將剝離后的角膜片段(角膜基質(zhì)和角膜上皮)轉(zhuǎn)移至加有2.4U/mL分散酶II(RocheDiagnostics)的MEM中。將其在37。C孵育1小時(shí)，之后，將該分散酶II處理的角膜片段轉(zhuǎn)移至MEM。采用眼手術(shù)刀將浸泡在MEM中的角膜片段的角膜上皮分離，并從MEM中去除角膜片段殘余(角膜基質(zhì))。將剝離的角膜上皮細(xì)胞和含有它們的MEM收集在50mL離心管中，在室溫下以1，500rpm離心5分鐘。棄去上清以得到角膜上皮細(xì)胞層。向該角膜上皮細(xì)胞層加入1mL胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen),充分混合后，讓細(xì)胞在37。C下孵育5分鐘以解開(kāi)細(xì)胞間的粘合。向其中加入含有100/()胎牛血清(FBS;Invitrogen)的9mLMEM以終止酶反應(yīng)，再次在室溫下以1,500rpm離心5分鐘以獲得角膜上皮細(xì)胞層。向得到的角膜上皮細(xì)胞層加入1mM的無(wú)血清液體培養(yǎng)基，用于正常兔角膜上皮細(xì)胞的增殖(RCGM^KuraboIndustriesLTD.)以懸浮細(xì)胞，將其接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿(IWAKI)以培養(yǎng)細(xì)胞，該培養(yǎng)皿中已加有9mL的RCGM2。接種的細(xì)胞培養(yǎng)在設(shè)置為37°C、5%C02、95%空氣、和100。/。濕度的培養(yǎng)箱(SANYO)中。培養(yǎng)基每48小時(shí)用新鮮培養(yǎng)基替換，直至測(cè)試曰。00623.測(cè)試物和制備方法以下的化合物一皮用作測(cè)試物。PPARa激動(dòng)劑WY-14643(Calbiochem)和非諾貝特(fenofibrate)(Sigma畫(huà)Aldrich)PPAR5激動(dòng)劑L-165041(Sigma國(guó)Aldrich)將每種測(cè)試物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，濃度為培養(yǎng)基中終濃度的200倍，并保存在-80。C，直至使用前不久。為了研究每種測(cè)試物促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，將從RCGM2中除去了附加至RCGM2的小鼠衍生表皮生長(zhǎng)因子(mEGF)的培養(yǎng)基用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，而作為證實(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)RCGM2制備方案的指導(dǎo)使用向其中添加了mEGF的培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10ng/mLmEGF)。00634.測(cè):汰方法1)培養(yǎng)皿的膠原處理作為測(cè)試促進(jìn)細(xì)胞增殖的培養(yǎng)亞，使用了96孔組織培養(yǎng)培養(yǎng)皿(Corning)。測(cè)試前一天，向培養(yǎng)皿的每孔加入50|iL的0.01%I型膠原(NittaGelatinInc.),在4。C進(jìn)行包一皮直至測(cè)試前不久。在測(cè)試當(dāng)天，在除去I型膠原溶液后，用D-PBS洗滌培養(yǎng)亞的底部3次，將此作為月交原處理的培養(yǎng)皿用在測(cè)試中。2)細(xì)胞培養(yǎng)和添加測(cè)試物測(cè)試中，使用在直徑10cm的培養(yǎng)亞中已經(jīng)培養(yǎng)至亞匯合(subconfluent)的兔角膜上皮細(xì)胞。在除去培養(yǎng)基后，采用D-PBS將培養(yǎng)皿底部洗滌兩次，向其中加入1mL的胰蛋白酶-EDTA,并在37。C下孵育5分鐘，由此讓細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部剝離。孵育后，將含有10%FBS的9mLMEM添加至培養(yǎng)皿以終止酶反應(yīng)，并將其在室溫下以1，500rpm離心5分鐘，以獲得角膜上皮細(xì)胞層。向得到的細(xì)胞加入適量的RCGM2,達(dá)到2xio5細(xì)胞/mL的細(xì)胞濃度以懸浮細(xì)胞。向每孔加入64faL的這種細(xì)胞懸浮液，使經(jīng)膠原處理的用于組織培養(yǎng)的96孔培養(yǎng)皿單位底面積(0.32cm"的細(xì)胞數(shù)量為4x104細(xì)胞/112。結(jié)束細(xì)胞接種后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至設(shè)定為37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞接種24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿的每孔新加入100fiL的以下培養(yǎng)基。[l]僅基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無(wú)添加物組)[2]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+mEGF(終濃度10ng/mL;陽(yáng)性對(duì)照組)[3]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+WY-14643(終濃度0.1pM和1pM)[4]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+非諾貝特(終濃度l!iM和10iLiM)[5]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+L-165041(終濃度0.1pM和1pM)為了讓所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%,分別向培養(yǎng)基[l]和[2]加入5|uL/lmL的乙醇。3)細(xì)胞數(shù)量的測(cè)量從培養(yǎng)基替換起48小時(shí)后，除去每孔的培養(yǎng)上清，接著向每孔加入100加有10%細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。加入后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至設(shè)定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育2小時(shí)。孵育2小時(shí)后，采用微孔板閱讀儀(Daini卯onPharmaceuticalCo.,Ltd.)測(cè)量450nm處的吸收值，并將此用作細(xì)胞數(shù)量增加的指標(biāo)。00645.統(tǒng)計(jì)分析假定無(wú)添加物組的吸收值均值為100%，計(jì)算無(wú)添加物組、每種測(cè)試物添加組和陽(yáng)性對(duì)照組每組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗(yàn)法(雙尾)比較無(wú)添加物組與每種測(cè)試物添加組和陽(yáng)性對(duì)照組。作為測(cè)試結(jié)果，小于5%的顯著性水平被確定為顯著的。00656.測(cè)試結(jié)果增加每組的細(xì)胞數(shù)量的作用顯示在表1中。-假定無(wú)添加物組的細(xì)胞增殖為100%,所有測(cè)試物添加組中的細(xì)胞增殖和陽(yáng)性對(duì)照組中的細(xì)胞增殖顯著高于無(wú)添加物組(p<0.01),并且其顯示細(xì)胞增殖被增強(qiáng)。從該測(cè)試結(jié)果顯然可知，PPARa激動(dòng)劑和PPARS激動(dòng)劑增加了角膜上皮細(xì)胞的數(shù)量。0066[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>0067PPARa激動(dòng)劑或PPAR5激動(dòng)劑或mEGF(陽(yáng)性對(duì)照)被添加到培養(yǎng)的兔角膜上皮細(xì)胞中時(shí)的細(xì)胞數(shù)量變化被顯示為無(wú)添加物組均值為100%時(shí)的值(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，N=5)。表中的**表示與無(wú)添加物組比較有顯著差異(p〈0.01)。0068(測(cè)試實(shí)施例2)PPARS激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞數(shù)量增加的作用，采用角膜上皮細(xì)胞1.使用的動(dòng)物使用雄性兔(日本白，重量約1.5kg,KITAYAMALABESCo.,Ltd.)。才艮才居InternationalGuidingPrinciplesforBiomedicalResearchInvolvingAnimals使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。2.制備角膜上皮細(xì)胞采用與(測(cè)試實(shí)施例1)中相同的方法制備兔角膜上皮細(xì)胞。00693.測(cè)試物和制備方法以下的化合物^皮用作測(cè)試化合物。PPAR5激動(dòng)劑L-165041(Sigma-Aldrich)和GW-501516(Alexis)將每種測(cè)試物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，濃度達(dá)到培養(yǎng)基中終濃度的200倍，將它們保存在-80。C,直至使用前不久。為了研究每種測(cè)試物促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，將從RCGM2中除去了附加至RCGM2的小鼠衍生表皮生長(zhǎng)因子(mEGF)的培養(yǎng)基用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，而作為證實(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)RCGM2制備方案的指導(dǎo)使用向其中添加了mEGF的培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10ng/mLmEGF)。00704.測(cè)-試方法1)培養(yǎng)皿的膠原處理采用與(測(cè)試實(shí)施例1)中相同的方法進(jìn)行培養(yǎng)皿的膠原處理。2)細(xì)力包培養(yǎng)和測(cè)試物的添加測(cè)試中，使用在直徑10cm的培養(yǎng)皿中已經(jīng)培養(yǎng)至亞匯合的兔角膜上皮細(xì)胞。在除去培養(yǎng)基后，采用D-PBS將培養(yǎng)皿底部洗滌兩次，向其中加入lmL的胰蛋白酶-EDTA,并在37°C下孵育5分鐘，由此讓細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部剝離。孵育后，將含有10%FBS的9mLMEM添加至培養(yǎng)皿以終止酶反應(yīng)，并將其在室溫下以1，500rpm離心5分鐘，以獲得角膜上皮細(xì)胞層。向得到的細(xì)胞加入適量的RCGM2，達(dá)到1x105細(xì)胞/mL的細(xì)胞濃度以懸浮細(xì)胞。向每孔加入64pL的這種細(xì)胞懸浮液，使經(jīng)膠原處理的用于組織培養(yǎng)的96孔培養(yǎng)皿單位底面積(0.32cn^)的細(xì)胞數(shù)量為2x10S田胞/cm2。結(jié)束細(xì)胞接種后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至設(shè)定為37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞接種24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿的每孔新加入100|LiL的以下培養(yǎng)基。[1]僅基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無(wú)添加物組)[2]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+mEGF(終濃度10ng/mL;陽(yáng)性對(duì)照組)[3]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+L-165041(終濃度0.1和1pM)[4]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+GW-501516(終濃度0.01|aM和0.1pM)為了讓所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%，分別向培養(yǎng)基[l]和[2]加入5|aL/lmL的乙醇。3)細(xì)胞數(shù)量的測(cè)量從替換含有測(cè)試物的培養(yǎng)基起，每48小時(shí)除去每孔的培養(yǎng)上清，并且向每孔加入100pL新配制的培養(yǎng)基。從最初替換為含有測(cè)試物的培養(yǎng)基起120小時(shí)后，除去每孔的培養(yǎng)上清，接著向每孔加入IOO加有10%細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。加入后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至設(shè)定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育2小時(shí)。孵育2小時(shí)后，采用微孔板閱讀儀(DainipponPharmaceuticalCo.,Ltd.)測(cè)量450nm處的吸收值，并將此用作纟田月包凄史量增加的指標(biāo)。00715.統(tǒng)計(jì)分析假定無(wú)添加物組的吸收值均值為100%，計(jì)算無(wú)添加物組、每種測(cè)試物添加組和陽(yáng)性對(duì)照組每組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗(yàn)法(雙尾)比較無(wú)添加物組與每種測(cè)試物添加組和陽(yáng)性對(duì)照組。作為測(cè)試結(jié)果，小于5%的顯著性水平被確定為顯著的。00726.測(cè)試結(jié)果每組細(xì)胞數(shù)量增加的影響顯示在表2中。假定無(wú)添加物組的細(xì)胞增殖為100%，所有測(cè)試物添加組中和陽(yáng)性對(duì)照組中的細(xì)胞增殖顯著高于無(wú)添加物組(p<0.01),并且其顯示細(xì)胞增殖被增強(qiáng)。從該測(cè)試結(jié)果顯然可知，具有PPAR5激動(dòng)劑活性的化合物增加了角膜上皮細(xì)胞的數(shù)量。0073[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>0074PPAR5激動(dòng)劑或mEGF(陽(yáng)性對(duì)照)^皮添加到培養(yǎng)的兔角膜上皮細(xì)胞中時(shí)的細(xì)胞數(shù)量變化纟皮顯示為相對(duì)于無(wú)添加物組均值為100%時(shí)的值(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，N=5)。表中的**表示與無(wú)添加物組比較有顯著差異(p〈0.01)。0075(測(cè)試實(shí)施例3)PPAR激動(dòng)劑對(duì)增加細(xì)胞數(shù)量的作用，采用瞼板腺上皮細(xì)胞1.使用的動(dòng)物使用雄性食蟹猴(cynomolgusmonkey)(EnvironmentalBiologicalLifeScienceResearchCenter)。才艮據(jù)InternationalGuidingPrinciplesforBiomedicalResearchInvolvingAnimals使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。2.制備瞼板腺上皮細(xì)胞從猴眼瞼制備瞼板腺上皮細(xì)胞。分離眼瞼，并保存在Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS;Invitrogen)中，將其轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)。以下的細(xì)胞制備操作都無(wú)菌進(jìn)行。在分離的眼瞼被浸泡在80%乙醇中30秒后，將該眼瞼用向其中加有P/。青霉素-鏈霉素(Invitrogen)的D-PBS洗滌三次，并將其轉(zhuǎn)移至最^f氐基石出培養(yǎng)基(minimumessentialmedium)(MEM;Invitrogen)。在立體顯微鏡下除去圍繞瞼板腺組織的脂肪組織和肌肉組織，并將其轉(zhuǎn)移至含有0.475U/mL膠原酶A(RocheDiagnostics)和2.4U/mL分散酶II(RocheDiagnostics)的MEM中，在37°C孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后，將經(jīng)酶處理的組織再次置于立體顯^f鼓鏡下，除去睫毛和眼瞼結(jié)締組織，并分離出瞼板腺組織。向分離的腺體組織加入1mL胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)，在37。C下孵育5分鐘。孵育后，添加9mL含有10%FBS的MEM以終止酶反應(yīng)，接著采用10mL移液管重復(fù)抽排五次，并進(jìn)一步采用配備有21G注射針頭的注射器抽排五次，以分散構(gòu)成組織的細(xì)胞。將細(xì)胞分散體經(jīng)100|^im、然后40jim尼龍濾器(CellStrainer;Falcon),以除去包含在分散體中的未經(jīng)酶處理的細(xì)胞團(tuán)。在50mL離心管中回收已濾過(guò)濾器的細(xì)胞分散體，并在室溫下以1,500rpm離心5分鐘。向含有通過(guò)離心獲得的目的細(xì)胞的細(xì)胞層添加80fiL含有0.5%牛血清白蛋白(BSA;Sigma-Aldrich)的D-PBS，以充分懸浮細(xì)胞，向其中添加20的抗成纖維細(xì)胞微珠(MilitenyiBiotec),讓其在室溫下靜置30分鐘。完成與抗體的反應(yīng)后，向其中加入2mL含有0.5%BSA的D-PBS,并再次在室溫下以1，500rpm離心5分鐘。向含有通過(guò)離心獲得的目的細(xì)胞的細(xì)胞層添加1mL含有0.5%BSA的D-PBS以充分懸浮細(xì)胞，將其滴加至預(yù)先采用柱洗液(含有2mMEDTA(DojindoLaboratories)和0.5%BSA的D-PBS)平tf的LD牙主(MilitenyiBiotec)。然后，向LD柱滴加2mL的柱洗液。從滴加細(xì)胞懸液后開(kāi)始到完成滴加柱洗液，在50mL離心管中回收未被吸附至柱上的未被抗體標(biāo)記的目的細(xì)胞(非成纖維細(xì)胞)。使回收在離心管中的細(xì)胞再次在室溫下以1,500rpm離心5分鐘，以除去上清液。向沉淀加入1mL的成分明確的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(DK-SFM;Invitrogen)以懸浮細(xì)胞，由此制備了瞼板腺上皮細(xì)胞懸液。將制備的細(xì)胞接種在直徑3.5cm的用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)皿(IWAKI)中，該培養(yǎng)i預(yù)先經(jīng)I型膠原溶液(NittaGelatinInc.)包被，并加入了3mL的DK-SFM。接種的細(xì)胞在設(shè)定37。C、5%C02、95%空氣、和100。/。濕度的培養(yǎng)箱(SANYO)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每48小時(shí)以新鮮培養(yǎng)基替換，直至測(cè)試日。00763.測(cè)試物和制備方法以下化合物用作測(cè)試物PPARa激動(dòng)劑非諾貝特(Sigma-Aldrich)PPAR5激動(dòng)劑L-165041(Sigma-Aldrich)PPARy激動(dòng)劑曲格列酮(Calbiochem)將每種測(cè)試物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，濃度達(dá)到培養(yǎng)基中終濃度的200倍，將它們保存在-80。C,直至使用前不久。為了研究每種測(cè)試物的促進(jìn)細(xì)胞增殖效果，根據(jù)DK-SFM制備方案的說(shuō)明，將從DK-SFM去除附加至DK-SFM的補(bǔ)充物而得到的培養(yǎng)基用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，而作為用于證實(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖效果的陽(yáng)性對(duì)照，使用向其中加入了補(bǔ)充物的培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+補(bǔ)充物)。00774.測(cè)試方法1)培養(yǎng)皿的膠原處理將用于組織培養(yǎng)的96孔培養(yǎng)皿(Corning)用作細(xì)胞增殖促進(jìn)測(cè)試的培養(yǎng)皿。在測(cè)試前一天，向培養(yǎng)皿的每孔加入50IliL的0.01%I型膠原(NittaGelatinInc.),在4°C進(jìn)行包被直至測(cè)試前。在測(cè)試當(dāng)天，在除去I型膠原溶液后，用D-PBS洗滌培養(yǎng)皿的底部3次，將此作為膠原處理的培養(yǎng)皿用在測(cè)試中。2)細(xì)力包培養(yǎng)和加入測(cè)試物在測(cè)試中，使用猴瞼板腺上皮細(xì)胞，其已經(jīng)在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至亞匯合，直徑3.5cm,并且在液氮中冷藏保存。將已懸浮在細(xì)胞banker(NipponZenyakuKogyoCo.,Ltd.)并已;令藏寸呆存的纟田月包融解，專爭(zhēng)移至50mL離心管，加入10-倍量的DK-SFM。此后在室溫下以1,500rpm離心5分鐘以回收細(xì)l包層，加入合適量的DK-SFM以懸浮細(xì)胞，使得到的細(xì)胞濃度為3x106細(xì)胞/mL。向每孔加入64的這種細(xì)胞懸浮液，使得用于組織培養(yǎng)的經(jīng)膠原處理的96-孔培養(yǎng)皿單位底部面積(0.32cm,的細(xì)胞數(shù)量為6x10S田胞/cm2。細(xì)胞接種結(jié)束后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至設(shè)定了37。C、5%C02、95%空氣和100%濕度的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時(shí)。自細(xì)胞接種起24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿的每孔新加入100pL的以下培養(yǎng)基。[1]僅基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無(wú)添加物組)[2]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+補(bǔ)加物(陽(yáng)性對(duì)照組)[3]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+非諾貝特(終濃度1iaM和10|uM)[4]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+L-165041(終濃度0.1(aM和1pM)[5]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+曲格列酮(終濃度0.1fiM和1|iM)為了使所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%,向培養(yǎng)基[1]和[2]力口入5|uL/lmL的乙醇。3)細(xì)胞數(shù)的測(cè)量從開(kāi)始培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換起48小時(shí)后，用上述[1]至[4]的每種新制備的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。此外，自此48小時(shí)后，除去每孔的培養(yǎng)上清，接著向每孔加入100pL含有10%細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)的DK-SFM。加入后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至設(shè)定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育兩小時(shí)。孵育兩小時(shí)后，采用微量板閱讀4義(DainipponPharmaceuticalCo.,Ltd.)測(cè)量450nm處的吸收，將此用作細(xì)胞數(shù)量增加的指標(biāo)。00785.統(tǒng)計(jì)分析，支定無(wú)添加物組的吸收值均值為100%,計(jì)算無(wú)添加物組、每種測(cè)試物添加組和陽(yáng)性對(duì)照組每組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗(yàn)法(雙尾)比4交無(wú)添加物組與每種測(cè)試物添加組和陽(yáng)性對(duì)照組。作為測(cè)試結(jié)果，小于5%的顯著性水平被確定為顯著的。00796.測(cè)試結(jié)果每組細(xì)胞數(shù)量增加的影響顯示在表3中。假定無(wú)添加物組的細(xì)胞增殖為100。/。，PPARot激動(dòng)劑非諾貝特添加組和PPAR5激動(dòng)劑L-165041添加組，以及陽(yáng)性對(duì)照組中的細(xì)胞增殖顯著高于無(wú)添加物組(p〈0.01),并且其顯示細(xì)胞增殖被增強(qiáng)。另一方面，PPARY激動(dòng)劑曲格列酮未顯示出細(xì)胞增殖促進(jìn)活性。乂人該測(cè)試結(jié)果顯然可知，PPARot激動(dòng)劑和PPAR5激動(dòng)劑增加了瞼板腺上皮細(xì)胞的數(shù)量。0080[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>0081PPARot激動(dòng)劑、PPAR5激動(dòng)劑或PPARy激動(dòng)劑或補(bǔ)加物(陽(yáng)性對(duì)照)被添加到培養(yǎng)的猴瞼板腺上皮細(xì)胞中時(shí)的細(xì)胞數(shù)量變化被顯示為當(dāng)無(wú)添加物組均值為100%時(shí)的值(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，N=5)。表中的**表示與無(wú)添加物組比較有顯著差異(p<0.01)。0082(測(cè)試實(shí)施例4)PPAR在角膜上皮細(xì)胞和瞼板腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)1.-使用的細(xì)胞將通過(guò)與(測(cè)試實(shí)施例l)相同方法制備并培養(yǎng)的細(xì)胞用作兔角膜上皮細(xì)胞。將通過(guò)與(測(cè)試實(shí)施例3)相同方法制備并培養(yǎng)的細(xì)胞用作猴瞼板腺上皮細(xì)胞。將在設(shè)定37°C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中采用用于正常人角膜上皮細(xì)胞增殖的無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EpiLife;KuraboIndustriesLTD.)培養(yǎng)的細(xì)胞用作人角膜上皮細(xì)胞(humancornealepithelialcell)。00832.測(cè)-汰方法1)A人細(xì)胞纟是取總RNA根據(jù)TRizol試劑(Invitrogen)常規(guī)方法從每種細(xì)胞提取總RNA2)從提取的RNA制備cDNA根據(jù)DNA-free(Ambion)常規(guī)方法在37°C進(jìn)行總提取RNA的DNA酶處理30分鐘，以除去基因組DNA。根據(jù)SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)常規(guī)方法從提取的RNA制備cDNA。即，釆用隨機(jī)引物(Invitrogen)從1jag的經(jīng)DNA酶處理的總RNA制備與其互補(bǔ)的cDNA。3)擴(kuò)增PPAR基因(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；PCR)根據(jù)PlatinumPCRSuperMix(Invitrogen)常規(guī)方法進(jìn)行PPAR基因的PCR。參考人、猩猩、食蟹猴、牛和小鼠的已知序列，PPAR引物被設(shè)計(jì)為使得PCR產(chǎn)物為約200bps。PPARoc:GTAGAATCTGCGGGGACAAG(有義)(SEQIDNo.:1):GTTGTGTGACATCCCGACAG(反義)(SEQIDNo.:2)PPARS:TTCCTTCCAGCAGCTACACA(有義)(SEQIDNo.:3):GATCGTACGACGGAAGAAGC(反義)(SEQIDNo.:4)PPARy:CTCCGTGGATCTCTCCGTAA(有義)(SEQIDNo.:5):GATGCAGGCTCCACTTTGAT(反義)(SEQIDNo.:6)通過(guò)在94°C反應(yīng)2分15秒后，重復(fù)94°C30秒、55°C30秒和72°C30分鐘的三階段反應(yīng)35次，完成該P(yáng)CR反應(yīng)。使PCR反應(yīng)后的樣品經(jīng)采用2%瓊脂糖的電泳，然后采用SYBRGold(MolecularProbes)對(duì)在膠中分離的DNA染色。讓染色的DNA在UV透射儀上發(fā)光，圖像被存儲(chǔ)為數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。00843.測(cè)試結(jié)果電泳后染色的DNA帶顯示在圖1中。作為該測(cè)試的結(jié)果，其證實(shí)所有PPARa、PPAR5和PPARy都在人角膜上皮細(xì)胞和猴瞼板腺上皮細(xì)胞中表達(dá)。此外，在兔角膜上皮細(xì)胞中，僅證實(shí)有PPARS的表達(dá)。Bonazzi等人報(bào)道，PPAR中PPARa和PPARP(=S)在兔角膜上皮細(xì)胞中表達(dá)(BonazziA.etal.，J.Biol.Chem.(2000);275(4):2837-2844)，在他們的報(bào)告中，他們使用了檢測(cè)PPARoc的特殊方法。如測(cè)試實(shí)施例1中所顯示的，顯然PPARa激動(dòng)劑促進(jìn)了兔角膜上皮細(xì)胞的增殖，既然Bonazzi等人的報(bào)告中采用特殊的檢測(cè)方法檢測(cè)到了PPARot，就提示PPARa在兔角膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)量很小。0085(測(cè)試實(shí)施例5)PPAR5激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞數(shù)量增加的作用，采用人角膜上皮細(xì)胞1.-使用的細(xì)月包使用了正常人角膜上皮細(xì)胞(KURABO)。2.測(cè)試物和制備方法將以下的化合物用作測(cè)試物。PPAR5激動(dòng)劑L-165041(Sigma畫(huà)Aldrich),GW-501516(Alexis)將每種測(cè)試物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，終濃度為培養(yǎng)基中終濃度的200倍，保存在-80。C,直至使用前不久。為了研究每種測(cè)試物促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，將這樣的培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)用作細(xì)胞培養(yǎng)基向EpiLife(KURABO)中添加了包含在HCGS增殖添加劑組合(KURABO)中的胰島素、氫化可的松、和轉(zhuǎn)鐵蛋白。此外，作為證實(shí)細(xì)胞增殖促進(jìn)作用的陽(yáng)性對(duì)照，使用了向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了包含在HCGS增殖添加劑組合(KURABO)中的小鼠衍生上皮生長(zhǎng)因子(mEGF)的培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+lng/mLmEGF)。00863.測(cè):汰方法1)細(xì)力包i告養(yǎng)和測(cè)試物的添加融解在液氮中冷藏保存的正常人角膜上皮細(xì)胞、對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且將其總量轉(zhuǎn)移至向其中添加了所有HCGS增殖添加劑組合(胰島素、小鼠衍生上皮生長(zhǎng)因子、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛垂體腺提取物)的4mLEpiLife(完全培養(yǎng)基)中，以將它們充分懸浮。將該細(xì)胞懸浮液接種在纖維蛋白包被的多孔板(24孑L,BECTONDICKINSON)上，使得細(xì)胞數(shù)為2x].O4細(xì)胞/500^L/孔(由于底面積為2cm2,數(shù)量為1x104細(xì)胞/cm2)。在完成細(xì)胞接種后，在設(shè)定37°C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，接著培養(yǎng)基每個(gè)以400nL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基替換。另外，此后24小時(shí)，培養(yǎng)基被各400nL的以下培養(yǎng)基替換。[1]僅基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無(wú)添加物組)[2]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+mEGF(終濃度1ng/mL;陽(yáng)性對(duì)照組)[3]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+L-165041(終濃度0.01|aM和0.1,[4]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+GW-501516(終濃度0.001|uM和0.01pM)為了使所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%,向培養(yǎng)基[1]和[2]分別加入5jaL/1mL的乙醇。2)細(xì)胞數(shù)量的測(cè)量在開(kāi)始用測(cè)試物刺激起24小時(shí)后，除去每孔的培養(yǎng)上清，將其中加有10。/。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(a10%CellCountingKit-8)(DOJINDO)的200iaL基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入至每孔。加入后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至設(shè)定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育2小時(shí)，在完成該反應(yīng)后，從上清液各取出100|iL至用于組織培養(yǎng)的培養(yǎng)皿(Corning)。已轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)皿的反應(yīng)溶液在450nm處的吸收值通過(guò)微量板閱讀4義(DainipponSumitomoPharmaceuticalCo.,Ltd.)觀'J量,并將此用作細(xì)胞數(shù)量增加的指標(biāo)。00874.統(tǒng)計(jì)分析假定無(wú)添加物組的吸收值的均值為100%,計(jì)算無(wú)添加物組、每種測(cè)試物添加組和陽(yáng)性對(duì)照組每組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗(yàn)法(單尾)比4交無(wú)添加物組與每種測(cè)試物添加組和陽(yáng)性對(duì)照組。作為測(cè)試結(jié)果，小于5%的顯著性水平被確定為顯著的。5.測(cè)試結(jié)果每組細(xì)胞數(shù)量增加的影響顯示在表4中。假定無(wú)添加物組的細(xì)月包增殖為100%,測(cè)試物添加組(<0.01)，以及陽(yáng)性對(duì)照組(p〈0.05)中的細(xì)胞增殖顯著高于無(wú)添加物組，并且其顯示細(xì)胞增殖被增強(qiáng)。從該測(cè)試結(jié)果顯然可知，PPARS激動(dòng)劑增加了正常人角膜上皮細(xì)胞的數(shù)量。00891[<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>PPARS激動(dòng)劑或mEGF(陽(yáng)性對(duì)照)被添加到培養(yǎng)的正常人角膜上皮細(xì)胞中時(shí)的細(xì)胞數(shù)量變化被顯示為相對(duì)于無(wú)添加物組均值為100%時(shí)的值(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，N二3至4)。表中的*表示與無(wú)添加物組比4交有顯著差異(p<0.05)，表中的"表示與無(wú)添加物組比較有顯著差異(p<0.01)。0091(測(cè)試實(shí)施例6)PPARS激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞數(shù)量增加的作用，采用正常人角膜上皮細(xì)胞1.4吏用的細(xì)月包使用正常人角膜上皮細(xì)胞(KURABO)。2.測(cè)試物和制備方法將以下化合物用作測(cè)試物。PPAR5激動(dòng)劑GW-501516(Alexis),GW-0742(Sigma畫(huà)Aldrich)將每種測(cè)試物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，終濃度為培養(yǎng)基中終濃度的200倍，保存在-80。C,直至使用前不久。為了研究每種測(cè)試物對(duì)促進(jìn)細(xì)胞增殖的影響，將這樣的培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)用作細(xì)胞培養(yǎng)基向EpiLife(KURABO)中添加了包含在HCGS增殖添加劑組合(KURABO)中的胰島素、氫化可的松、和轉(zhuǎn)鐵蛋白。00923.測(cè)i式方法1)纟田胞培養(yǎng)和測(cè)試物的添力口融解在液氮中冷藏保存的正常人角膜上皮細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且將其總量轉(zhuǎn)移至向其中添加了所有HCGS增殖添加劑組合(胰島素、小鼠衍生上皮生長(zhǎng)因子、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛垂體腺提取物)的4mLEpiLife(完全培養(yǎng)基)中，以將它們充分懸浮。將該細(xì)胞懸浮液接種在用于組織培養(yǎng)的96孔培養(yǎng)皿(Corning)上，使得細(xì)胞數(shù)為1.28x104細(xì)胞/100nL/孔(由于底面積為0.32cm2,數(shù)量為4x1()4細(xì)胞/cm2)。在完成細(xì)胞接種后，在設(shè)定37°C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，接著培養(yǎng)基以100pL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EpiLife,向其中加入了HCGS增殖添加劑的胰島素、氫化可的松和轉(zhuǎn)鐵蛋白)替換。另外，此后24小時(shí)，培養(yǎng)基被各100的以下培養(yǎng)基替換。[1]基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無(wú)添加物組)[2]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+GW-501516(終濃度0.01|iM)[3]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+GW-0742(終濃度0.01^M)為了使所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%，向培養(yǎng)基[l]加入5|iL/lmL的乙醇。2)細(xì)胞數(shù)量的測(cè)量在開(kāi)始用測(cè)試物刺激起48小時(shí)后，除去每孔的培養(yǎng)上清，將其中加有10%細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)的100[iL基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入至每孔。加入后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至設(shè)定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育2小時(shí)。每孔在450nm處的吸收值通過(guò)微量板閱讀4義(DainipponSumitomoPharmaceuticalCo.,Ltd.)測(cè)量，并^l奪jt匕用作細(xì)胞數(shù)量增加的指標(biāo)。00934.統(tǒng)計(jì)分析假定無(wú)添加物組的吸收值的均值為100%,計(jì)算無(wú)添加物組和每種測(cè)試物添加組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗(yàn)法(單尾)比較無(wú)添加物組與每種測(cè)試物添加組和陽(yáng)性對(duì)照組。作為測(cè)試結(jié)果，小于5%的顯著性水平被確定為顯著的。00945.測(cè)試結(jié)果每組細(xì)胞數(shù)量增加的影響顯示在表5中。假定無(wú)添加物組的細(xì)胞增殖為100%，兩測(cè)試物添加組中的細(xì)胞增殖顯著高于無(wú)添加物組，并且其顯示細(xì);9包增殖^:增強(qiáng)(p<0.01)。^v該測(cè)試結(jié)果顯然可知，PPARS激動(dòng)劑增加了正常人角膜上皮細(xì)胞的數(shù)量。0095[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>0096PPARS激動(dòng)劑被添加到培養(yǎng)的正常人角膜上皮細(xì)胞中時(shí)的細(xì)胞數(shù)量變化被顯示為相對(duì)于無(wú)添加物組均值為100%時(shí)的值(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，N=4至5)。表中的"表示與無(wú)添加物組比較有顯著差異(p〈0.01)。0097(測(cè)試實(shí)施例7)PPARy激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞數(shù)量增加的影響，采用正常人角膜上皮細(xì)胞1.使用的細(xì)胞使用正常人角膜上皮細(xì)胞(KURABO)。2.測(cè)試物和制備方法采用以下化合物作為測(cè)試化合物。PPARy激動(dòng)劑曲格列酮(Calbiochem)將測(cè)試物溶解在乙醇(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)中，終濃度為培養(yǎng)基中終濃度的200倍，保存在-80。C,直至使用前不久。為了研究每種測(cè)試物對(duì)正常人角膜上皮細(xì)胞的影響，將這樣的培養(yǎng)基(EpiLife基礎(chǔ)培養(yǎng)基)用作細(xì)胞培養(yǎng)基向EpiLife(KURABO)中添加了包含在HCGS增殖添加劑組合(KURABO)的添加劑中的胰島素、氬化可的松、和轉(zhuǎn)鐵蛋白，除了小鼠衍生上皮生長(zhǎng)因子(mEGF)。00983.測(cè)i式方法1)細(xì)胞培養(yǎng)和添加測(cè)試物正常人角膜上皮細(xì)胞融解在液氮中冷藏保存的正常人角膜上皮細(xì)刀包，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且將其總量轉(zhuǎn)移至向其中添加了所有HCGS增殖添加劑組合(含有mEGF)的EpiLife(完全培養(yǎng)基)中，以將它們充分懸浮。將該細(xì)胞懸浮液接種在如測(cè)試實(shí)施例1中所述被膠原包被的多孔板(96孑L,Costar)中，使得細(xì)胞數(shù)為1.28x104細(xì)胞/64(aL/孔(由于底面積為0.32cm2,數(shù)量為4x1()4細(xì)胞/cm2)。在完成細(xì)胞接種后，在設(shè)定37°C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，接著培養(yǎng)基以100(iL的含有以下測(cè)^式物的培養(yǎng)基替換，并繼續(xù)培養(yǎng)。[1]僅EpiLife基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無(wú)添加物組)[2]EpiLife基礎(chǔ)培養(yǎng)基+曲格列酮(終濃度0.1fiM)為了使所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%,向培養(yǎng)基[l]加入5pL/1mL的乙醇。在測(cè)試物添加起始日和細(xì)胞數(shù)量測(cè)量日之間，每?jī)商鞂⑴囵B(yǎng)基以含有前述測(cè)試物的培養(yǎng)基替換。2)細(xì)胞數(shù)量的測(cè)量在開(kāi)始用測(cè)試物刺激起6天后，除去每孔的培養(yǎng)上清，將其中加有10%細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)的100pLEpiLife基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入至每孔。加入后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至設(shè)定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，孵育2小時(shí)，完成反應(yīng)后該培養(yǎng)i每孔在450nm處的吸^lj直通過(guò)樣i:量氺反閱"i賣^義(DainipponSumitomoPharmaceuticalCo.,Ltd.)測(cè)量，并將此用作細(xì)胞數(shù)量增加的指標(biāo)。00994.統(tǒng)計(jì)分析假定無(wú)添加物組的吸收值的均值為100%,計(jì)算無(wú)添加物組和每種測(cè)試物添加組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗(yàn)法(單尾)比較無(wú)添加物組與每種測(cè)試物添加組。作為測(cè)試結(jié)果，小于5%的顯著性水平纟皮確定為顯著的。01005.測(cè)試結(jié)果PPARy激動(dòng)劑對(duì)正常人角膜上皮細(xì)胞的影響顯示在表6中。從該測(cè)試結(jié)果可知，沒(méi)有看出PPARy激動(dòng)劑增加角膜上皮細(xì)胞數(shù)量的作用。0101[表6]<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>0102PPARr激動(dòng)劑被添加到培養(yǎng)的正常人角膜上皮細(xì)胞中時(shí)的細(xì)胞數(shù)量變化被顯示為相對(duì)于無(wú)添加物組均值為100%時(shí)的^直(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏>差，N=3或4)。表中的**表示與無(wú)添加物組比較有顯著差異(p<0.01)。0103(測(cè)試實(shí)施例8)PPAR5激動(dòng)劑對(duì)瞼板腺上皮細(xì)胞數(shù)量增加的作用1.制備猴瞼板腺上皮細(xì)胞從猴眼瞼制備瞼板腺上皮細(xì)胞按測(cè)試實(shí)施例3進(jìn)行。采用成分明確的角質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基(DK-SFM;Invitrogen,根據(jù)制備方案添加了附加的補(bǔ)加物)在設(shè)定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，并且培養(yǎng)基每48小時(shí)用新鮮培養(yǎng)基替換，直至達(dá)到亞匯合。01042.測(cè)試物和制備方法將以下化合物用作測(cè)試化合物。PPAR5激動(dòng)劑L-165041(Sigma-Aldrich)和GW-501516(Alexis)將每種測(cè)試物溶解在乙醇(NacalaiTesque，Inc.)中，濃度達(dá)到培養(yǎng)基中終濃度的200倍，將它們保存在-80。C,直至使用前不久。為了研究每種測(cè)試物的促進(jìn)細(xì)胞增殖效果，根據(jù)DK-SFM制備方案的說(shuō)明，將從DK-SFM去除附加至DK-SFM的補(bǔ)充物而得到的培養(yǎng)基用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，而作為用于證實(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖效果的陽(yáng)性對(duì)照，使用向其中加入了補(bǔ)充物的培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+補(bǔ)充物)。01053.測(cè)試方法1)培養(yǎng)jm的膠原處理采用I型膠原(NittaGelatinInc.)包被用于細(xì)胞增殖促進(jìn)測(cè)試的培養(yǎng)皿，如測(cè)試實(shí)施例3中所述。2)細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)試物的添加在測(cè)試中，使用猴瞼板腺上皮細(xì)胞，其已經(jīng)被培養(yǎng)至亞匯合，懸浮在細(xì)胞banker(NipponZenyakuKogyoCo.，Ltd.)中并冷藏保存在液氮中。將冷藏保存的細(xì)胞融解，轉(zhuǎn)移至50mL離心管，并加入10-倍量的DK-SFM。此后在室溫下以1,500rpm離心5分鐘以回收細(xì)胞層，力口入合適量的DK-SFM以懸浮細(xì)胞，使得到的細(xì)胞濃度為2x106細(xì)胞/mL。向每孔加入64|aL的這種細(xì)胞懸浮液，使得用于組織培養(yǎng)的經(jīng)月交原處理的96-孔培養(yǎng)皿單位底部面積(0.32cm"的細(xì)胞數(shù)量為4x104細(xì)胞/cm2。細(xì)胞接種結(jié)束后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至設(shè)定37。C、5%C02、95%空氣和100%濕度的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時(shí)。自細(xì)胞接種起24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿的每孔新加入100(iL的以下培養(yǎng)基。[1]僅基礎(chǔ)培養(yǎng)基(無(wú)添加物組)[2]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+補(bǔ)加物(陽(yáng)性對(duì)照組)[3]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+L-165041(終濃度0.1(iM和1pM)[4]基礎(chǔ)培養(yǎng)基+GW-501516(終濃度0.01和0.1一)為了使所有培養(yǎng)基中的乙醇濃度都等于0.5%,分別向培養(yǎng)基[l]和2]加入5fiL/1mL的乙醇。3)細(xì)胞數(shù)量的測(cè)量從最初培養(yǎng)基替換起48小時(shí)后，培養(yǎng)基以新制備的培養(yǎng)基[1]至[4]之一替換。此外，自此48小時(shí)后，培養(yǎng)基再次用新制備的培養(yǎng)基[l〗至[4]之一替換。此外，自此48小時(shí)后，除去每孔的培養(yǎng)上清，接著向每孔加入100|aL加有10%細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(DOJINDO)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。加入后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至設(shè)定37。C、5%C02、95%空氣、和100%濕度的培養(yǎng)箱中，并孵育2小時(shí)。孵育2小時(shí)后，采用微量板閱讀儀(DainipponPharmaceuticalCo.,Ltd.)測(cè)量450nm處的吸收值，并3尋jt匕用作細(xì)胞數(shù)量增加的指標(biāo)。4.統(tǒng)計(jì)分析假定無(wú)添加物組的吸收值的均值為100%，計(jì)算無(wú)添加物組、每種測(cè)試物添加組和陽(yáng)性對(duì)照組的值，并采用Dunnett多重比較檢驗(yàn)法(單尾)比較無(wú)添加物組與每種測(cè)試物添加組和陽(yáng)性對(duì)照組。作為測(cè)試結(jié)果，小于5%的顯著性水平被確定為顯著的。01075.測(cè)試結(jié)果每組的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用顯示在表7中。假定無(wú)添加物組的細(xì)月包增殖為100%,PPARS激動(dòng)劑L-165041(l(T6M)添加組和PPAR5激動(dòng)劑GW-501516(l(T7M)添加組，以及陽(yáng)性對(duì)照組中的細(xì)胞增殖顯著高于無(wú)添加物組，并且其顯示細(xì)胞增殖被增強(qiáng)。從該測(cè)試結(jié)果顯然可知，PPARS激動(dòng)劑增加了瞼板腺上皮細(xì)胞的數(shù)量。0108[表7]<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>0109PPAR5/p激動(dòng)劑或補(bǔ)充物(supplement)!陽(yáng)性對(duì)照.)被添加到培養(yǎng)的猴瞼板腺上皮細(xì)胞中時(shí)的細(xì)胞數(shù)量變化被顯示為相對(duì)于無(wú)添加物^L均值為100%時(shí)的值(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，N=5)。表中的*表示與無(wú)添力口物組比較有顯著差異(p<0.05),表中的**表示與無(wú)添加物組比較有顯著差異(p〈0.01)。0110(測(cè)試實(shí)施例9)研究PPARS激動(dòng)劑對(duì)角膜上皮損傷的愈合促進(jìn)活性1.使用的動(dòng)物使用雄性兔(日本白兔，KITAYAMALABESCo.,Ltd.)。根據(jù)InternationalGuidingPrinciplesforBiomedicalResearchInvolvingAnimals使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。2.測(cè)試物和制備滴眼劑溶液的方法將PPARS激動(dòng)劑GW-501516(AlexisBiochemicals)用作測(cè)試物。其中GW-501516以0.05%懸浮在以下載體中的溶液3皮用作滴眼劑溶液。無(wú)水磷酸二氫鈉0.05g氯化鈉0.45g超純水q.s.聚山梨醇酯80(Polysorbate80)0.05mLNaOH__總量50mL(pH7.0)作為測(cè)試物給藥組的對(duì)照，設(shè)置了不含藥物的上述載體給藥組。01113.實(shí),險(xiǎn)方法1)角膜上皮細(xì)胞刮除在通過(guò)肌肉注射(0.9mL/kg)selactar(2%曱苯蓬口秦Bayer):ketalar(5%氯胺酮Sankyo)=0.5:1混合溶液使動(dòng)物全身麻醉后，給予鹽酸丁氧普魯卡因滴眼劑溶液(Benoxil滴眼劑溶液0.4%;SantenPharmaceuticalCo.,Ltd.),^吏眼球暴露。采用直徑6mm的環(huán)鉆在角月莫中心部分的角膜上皮上鉆出直徑6mm的痕跡，并在立體顯微鏡下將鉆出圓周內(nèi)的整個(gè)角膜上皮層刮除。刮除后，采用生理鹽水(OtsukaPharmaceuticalFactoryInc.)洗滌角膜表面，讓眼球返回到眼眶以完成角膜上皮刮除處理。2)給藥采用微量移液管向處理眼給予測(cè)試物滴眼劑溶液或滴眼劑溶液載體，每次50iuL,在角膜上皮刮除當(dāng)天給藥兩次，第二天和之后，每天四次，直至完成測(cè)試。3)評(píng)估將完成所有個(gè)體雙眼角膜上皮刮除的時(shí)間點(diǎn)定義為測(cè)試起始時(shí)間(0小時(shí))，通過(guò)在其后24、38和48小時(shí)定量角膜上皮缺損面積，評(píng)估角膜上皮的恢復(fù)。即，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，向經(jīng)處理眼給予10fiL的0.1%焚光素鈉(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)溶液，采用配備了鈷濾光片的裂隙燈立即對(duì)動(dòng)物眼前端照相，由此記錄經(jīng)染色的角膜上皮缺損面積。將顯影的照片作為數(shù)字圖像存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中，采用圖像分析軟件(Image-ProPlus)測(cè)量經(jīng)染色的角膜上皮缺損部分的面積。01124.統(tǒng)計(jì)分析關(guān)于在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的角膜上皮缺損面積，計(jì)算每個(gè)個(gè)體的值，假定其起始值為100%,將此采納為剩余角膜上皮缺損的比例。關(guān)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)剩余角膜上皮缺損的比例，通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行載體給藥組和測(cè)試物給藥組的比較，少于5%的顯著性水平被確定為顯著的。01135.測(cè)試結(jié)果載體給藥組和0.05%GW-501516給藥組在每個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)時(shí)剩余角膜上皮缺損的比例顯示在表8中。其顯示0.05%GW-501516給藥組在角膜上皮刮除后24小時(shí)和38小時(shí)時(shí)角膜上皮缺損比例顯著降低。48小時(shí)后，所有個(gè)體中角膜上皮缺損消失。由此檢驗(yàn)結(jié)果顯然可知，通過(guò)向眼給予PPARS激動(dòng)劑促進(jìn)了缺損的角膜上皮的恢復(fù)。0114[表8]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>0115對(duì)于每個(gè)個(gè)體，假定起始值為100%,顯示了通過(guò)計(jì)算在兔眼的角膜上皮刮除處理后剩余的角膜上皮缺損比例(％)而獲得的值(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，N二4)。表中的f表示與載體給藥組相比有顯著差異(p<0.05),**表示與載體給藥組相比有顯著差異(p<0.01)。工業(yè)實(shí)用性0116根據(jù)本發(fā)明，提供了促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的新試劑或促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的新試劑，該促進(jìn)劑促進(jìn)了瞼板腺上皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞的增殖。此外，本發(fā)明的治療劑可有效用于治療/改善諸如瞼板腺功能異常、角膜上皮病癥或蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的疾病。0117本發(fā)明基于2005年11月28日提交的日本專利申請(qǐng)2005-342025，在此通過(guò)參考將其內(nèi)容整體并入本文。權(quán)利要求1.一種促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的試劑，包括作為活性成分的PPARα或δ激動(dòng)劑。2.—種促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑，包括作為活性成分的PPARot或5激動(dòng)劑。3.—種治療瞼板腺功能異常的試劑，包括作為活性成分的PPARoc或S激動(dòng)劑。4.一種治療角膜上皮病癥的試劑，包括作為活性成分的PPARa或5激動(dòng)劑。5.—種治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的試劑，包括作為活性成分的PPARa或5激動(dòng)劑。6.—種促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的試劑，包括作為活性成分的PPARS激動(dòng)劑。7.—種促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑，包括作為活性成分的PPA&S激動(dòng)劑。8.—種治療瞼板腺功能異常的試劑，包括作為活性成分的PPARS激動(dòng)劑。9.一種治療角膜上皮病癥的試劑，包括作為活性成分的PPAR5激動(dòng)劑。10.—種治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的試劑，包括作為活性成分的PPARS激動(dòng)劑。11.如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的試劑，其中所述PPARot或5激動(dòng)劑為式(I)表示的化合物或其藥理學(xué)上可接受的鹽其中A為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)，B為選自-CO-、-NH-、-(CH2)n-S-、-(CH2)n-C-0-(CH2)i^接物，其中n為1至3的整數(shù)，X和Y相同或不同，各為碳原子或氮原子，Z為氧原子、硫原子或-CH2-,Ar,為5至6元芳環(huán)基團(tuán)，任選地具有1至3個(gè)取代基，R,和R2相同或不同，各為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)，以及R3為氫、卣素原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)。12.如權(quán)利要求6至10中任一項(xiàng)所述的試劑，其中所述PPARS激動(dòng)劑為式(II)表示的化合物或其藥理學(xué)上可接受的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中A為氫原子或碳原子數(shù)l至6的烷基基團(tuán)，B為選自-(CH2)n-S-和-0-(CH2)n-0-的連接物，其中n為1至3的整數(shù)，X和Y相同或不同，各為碳原子或氮原子，Z為氧原子、硫原子或-CH2-，Ar，為5至6元芳環(huán)基團(tuán)，任選地具有1至3個(gè)取代基，R,和R2相同或不同，各為氫原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)，以及R3為氫、卣素原子或碳原子數(shù)1至6的烷基基團(tuán)。13.如權(quán)利要求11或12所述的試劑，其中所述PPAR5激動(dòng)劑為(4-(3-(4-乙?；?3-羥基-2-丙基)苯氧基)丙氧基苯氧基)乙酸、(2-甲基一4-(((4-曱基-2-(4-(三氟曱基)苯基)-5-噻唑基)曱基)硫基)苯氧基)乙酸或(4-(((2-(3-氟-(4-(三氟曱基)苯基)-4-甲基-5-噻唑基)甲基)硫基)-2-曱基苯氧基)乙酸，或它們藥理學(xué)上可接受的鹽。14.如權(quán)利要求11所述的試劑，其中所述PPARoc激動(dòng)劑為2-(4-(4-氯苯曱?；?苯氧基)-2-曱基丙酸1-甲基乙酯或((4-氯-6-((2，3-二曱基苯基)氨基)-2-嘧啶基)硫基)乙酸，或它們藥理學(xué)上可接受的鹽。15.PPARoc或S激動(dòng)劑在生產(chǎn)促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的試劑中的用途。16.PPARot或S激動(dòng)劑在生產(chǎn)促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑中的用途。17.PPARa或S激動(dòng)劑在生產(chǎn)治療瞼板腺功能異常的試劑中的用途。18.PPARoc或5激動(dòng)劑在生產(chǎn)治療角膜上皮病癥的試劑中的用途。19.PPARot或S激動(dòng)劑在生產(chǎn)治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的試劑中的用途。20.PPAR5激動(dòng)劑在生產(chǎn)促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的試劑中的用途。21.PPARS激動(dòng)劑在生產(chǎn)促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑中的用途。22.PPARS激動(dòng)劑在生產(chǎn)治療瞼板腺功能異常的試劑中的用途。23.PPARS激動(dòng)劑在生產(chǎn)治療角膜上皮病癥的試劑中的用途。24.PPAR5激動(dòng)劑在生產(chǎn)治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的試劑中的用途。25.—種促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的方法，包括向需要促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的個(gè)體給予有效量的PPARot或5激動(dòng)劑。26.—種促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的方法，包括向需要促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的個(gè)體給予有效量的PPARa或S激動(dòng)劑。27.如權(quán)利要求25所述的方法，其被執(zhí)行以治療瞼板腺功能異常。28.如權(quán)利要求26所述的方法，其被執(zhí)行以治療角膜上皮病癥。29.—種治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的方法，包括向患有蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的患者給予有效量的PPARa或5激動(dòng)劑。30.—種促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的方法，包括向需要促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞增殖的個(gè)體給予有效量的PPARS激動(dòng)劑。31.—種促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的方法，包括向需要促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖的個(gè)體給予有效量的PPAR5激動(dòng)劑。32.如權(quán)利要求30所述的方法，其被執(zhí)行以治療瞼板腺功能異常。33.如權(quán)利要求31所述的方法，其被執(zhí)行以治療角膜上皮病癥。34.—種治療蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的方法，包括向患有蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的患者給予有效量的PPARS激動(dòng)劑。全文摘要本發(fā)明的目的是提供促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑，以及提供治療諸如瞼板腺功能異常或蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的眼病的治療劑。本發(fā)明提供了促進(jìn)瞼板腺上皮細(xì)胞或角膜上皮細(xì)胞增殖的試劑，其含有PPARα或δ激動(dòng)劑作為活性成分，以及用于治療諸如瞼板腺功能異常或蒸發(fā)過(guò)強(qiáng)型干眼的眼病的試劑，其含有PPARα或δ激動(dòng)劑作為活性成分。文檔編號(hào)A61K31/216GK101336113SQ200680051899公開(kāi)日2008年12月31日申請(qǐng)日期2006年11月27日優(yōu)先權(quán)日2005年11月28日發(fā)明者中村義邦,井上淳,花野郁子申請(qǐng)人:千壽制藥株式會(huì)社