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有效的c3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的制作方法

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專(zhuān)利名稱(chēng)::有效的c3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的制作方法有放的C3補(bǔ)休抑制紊類(lèi)似輪本申請(qǐng)要求2005年11月28日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/740,205的優(yōu)先權(quán),其全部?jī)?nèi)容在此引入作為參考。政府支持依據(jù)35U.S.C.《202(c),承認(rèn)美國(guó)政府可以享有在此描述的本發(fā)明的某些權(quán)利,本發(fā)明一部分是使用來(lái)自國(guó)家衛(wèi)生研究所授權(quán)號(hào)GM62134的基金做出的。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及體內(nèi)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的激活。尤其是,本發(fā)明提供了能夠結(jié)合C3蛋白并抑制補(bǔ)體激活的肽和模擬肽。發(fā)明背景說(shuō)明書(shū)自始至終引用各種出版物,包括專(zhuān)利、公開(kāi)的申請(qǐng)、技術(shù)文獻(xiàn)和學(xué)術(shù)文章。這些引用的每篇出版物在此全部引入作為參考。說(shuō)明書(shū)中未完全引用的出版物的完全引證列在說(shuō)明書(shū)的結(jié)尾。補(bǔ)體系統(tǒng)是對(duì)抗外來(lái)病原體的第一道免疫防線。其通過(guò)經(jīng)典的、旁路的或凝集素途徑的激活引起過(guò)敏毒性(anaphylatoxic)肽C3a和C5a產(chǎn)生和C5b-9膜攻擊復(fù)合體形成.補(bǔ)體成分C3在所有三個(gè)途徑的激活中起著重要作用,補(bǔ)體途徑C3轉(zhuǎn)變酶引起的C3激活及其隨后附著于靶表面引起膜攻擊復(fù)合體裝配,并最終引起靶細(xì)胞損害或裂解,C3是獨(dú)特的,因?yàn)樗哂刑峁┒嘀夭煌潴w結(jié)合位點(diǎn)的豐富的構(gòu)造,所述位點(diǎn)在免疫監(jiān)視和免疫反應(yīng)途徑中很重要。不適當(dāng)?shù)难a(bǔ)體激活可以引起宿主細(xì)胞損害。補(bǔ)體牽連幾種病態(tài),包括各種自身免疫疾病,并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)另外的臨床病癥,例如成人呼吸綜合征、心臟病發(fā)作、異種移植后排斥和燒傷損害。還已發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體介導(dǎo)的組織損傷是由生物不相容情況,例如經(jīng)受透析或心肺分流術(shù)的患者遭遇的情況引起的。補(bǔ)體介導(dǎo)的組織損傷通過(guò)膜攻擊復(fù)合體直接介導(dǎo),和通過(guò)產(chǎn)生C3a和C5a間接介導(dǎo)。這些肽通過(guò)它們對(duì)各種細(xì)胞,包括嗜中性白細(xì)胞和肥大細(xì)胞的影響而引起損害。在體內(nèi),對(duì)C3和C5激活步稞的補(bǔ)體調(diào)節(jié)通過(guò)血漿和膜蛋白來(lái)提供。血漿蛋白抑制劑是因子H和C4結(jié)合蛋白,而位于細(xì)胞表面的調(diào)節(jié)膜蛋白是補(bǔ)體受體1(CR1),衰變加速因子(DAF)和膜輔因子蛋白(MCP)。這些蛋白通過(guò)促進(jìn)多亞基復(fù)合物解離和/或通過(guò)蛋白酶解(由因子I催化)使復(fù)合物失活來(lái)抑制C3和C5轉(zhuǎn)變酶(多亞基蛋白酶)。通過(guò)體外測(cè)定已經(jīng)鑒定出調(diào)節(jié)或調(diào)整補(bǔ)體活性的幾種藥劑,但是大多數(shù)在體內(nèi)顯示出活性低或有毒性。迄今為止,沒(méi)有補(bǔ)體激活抑制劑被批準(zhǔn)用于臨床,盡管存在某些供臨床使用的候選物,具體地說(shuō),被稱(chēng)為可溶補(bǔ)體受體l(sCRl)的重組形式的補(bǔ)體受體1和人源化抗C5單克隆抗體(5G1.l-scFv),這兩種物質(zhì)在體內(nèi)動(dòng)物棋型中已經(jīng)顯示出抑制補(bǔ)體激活(KalliKR等,1994;和Wang等,1996)。然而,每種物質(zhì)都具有作為大分子重蛋白(分別是240kDa和26kDa)的缺點(diǎn),難以制備和必須通過(guò)輸液給藥。因此,最近的研究著重于較小活性劑的開(kāi)發(fā),其易于遞送、更穩(wěn)定和制造成本更低。Lambris等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,319,897描述了噬菌體展示組合隨機(jī)肽文庫(kù)用于鑒定與C3結(jié)合并抑制補(bǔ)體激活的27個(gè)殘基的肽的用途。這個(gè)肽被截短為保留了全部活性的13個(gè)殘基的環(huán)狀片段,其在本領(lǐng)域中被稱(chēng)為C3補(bǔ)體抑制素(co即staUn)。C3補(bǔ)體押制素抑制C3被C3轉(zhuǎn)變酶切割為C3a和C3b。已在一系列體外、體內(nèi)、離體和體內(nèi)/離體交界實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了C3補(bǔ)體抑制素,并已證明(1)在人血清中抑制補(bǔ)體激活(SahuA等,1996);(2)在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中抑制肝素/魚(yú)精蛋白引起的補(bǔ)體激活,而無(wú)顯著的副作用(SoulikaAM等,2000);(3)延長(zhǎng)輸注人血的豬至人異種移植物的壽命(FianeAE等,1999a;FianeAE等,1999b;和FianeAE等,2000);(4)在心肺分流術(shù)、血漿去除術(shù)和透析體外循環(huán)模型中抑制補(bǔ)體激活(NilssonB等,1998);和(5)具有低毒性(FurlongST等,2000)。C3補(bǔ)體抑制素是包含序列ICVVQDWGHHRCT-NH2(SEQIDNO:1)的肽,其中Cys2和Cysl2形成二疏鍵,使用同核2DNMR核磁共振與兩個(gè)分開(kāi)的實(shí)驗(yàn)上受約束的計(jì)算方法相結(jié)合來(lái)確定它的三維結(jié)構(gòu)。第一種方法涉及距離幾何學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)和模擬退火(MorikisD等,1998;W099/13899)而笫二種方法涉及總體優(yōu)化(Klepeis等,J.ComputationalChem.,20:1344-1370,1999)。C3補(bǔ)體抑制素的結(jié)構(gòu)揭示了一個(gè)由極性斑和非極性斑組成的分子表面。極性部分包括I型P轉(zhuǎn)角且非極性斑包括二硫鍵。此外,合成了具有丙氨酸置換(丙氨酸分區(qū))的一系列類(lèi)似物并測(cè)試了活性,揭示P轉(zhuǎn)角的四個(gè)殘基和帶環(huán)繞的疏水簇的二硫鍵在C3補(bǔ)體抑制素的抑制活性中起著重要作用(Morikis等,1998;W099/13899)。使用包括測(cè)定旁路途徑介導(dǎo)的紅細(xì)胞裂解的補(bǔ)體活性試驗(yàn),已經(jīng)測(cè)定了C3補(bǔ)體抑制素的ICs。為12MM。已經(jīng)證明某些以前測(cè)試的類(lèi)似物具有相當(dāng)于或大于C3補(bǔ)體抑制素的活性。公開(kāi)的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩O2004/026328公開(kāi)了具有N-和C-末端和在第4和9位變異的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物和模擬物,其在上述試驗(yàn)中顯示活性提高。已報(bào)道茱些類(lèi)似物活性的提高超過(guò)C3補(bǔ)體抑制素達(dá)99倍{也參見(jiàn),Mallik等,2005)。具有甚至更高活性的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物或模擬物的開(kāi)發(fā)將構(gòu)成本領(lǐng)域的顯著進(jìn)步。發(fā)明概述本發(fā)明提供了補(bǔ)體抑制肽C3補(bǔ)體抑制素(H00C-ICVVQDWGHHRCT-NH2;SEQIDNO:1)的類(lèi)似物和模擬物,其與C3補(bǔ)體抑制素相比具有提高的補(bǔ)體抑制活性。在一個(gè)方面,本發(fā)明的特征是抑制補(bǔ)體激活的化合物,其包含具有下述序列的肽Xaal-Cys-Val-Xaa2-Gln-Asp-Xaa3-Gly-Xaa4-His-Arg-Cys-Xaa5(SEQIDNO:26);其中Xaal是Ile、Val、Leu、Ac-Ile、Ac-Val、Ac-Leu或包含Gly-Ile的二肽;Xaa2是Trp或Trp的類(lèi)似物,其中Trp的類(lèi)似物與Trp相比疏水特性增加,條件是,如果Xaa3是Trp,那么Xaa2是Trp的類(lèi)似物;Xaa3是Trp或在其吲哚環(huán)上包含化學(xué)修飾的Trp的類(lèi)似物,其中化學(xué)修飾增加吲哚環(huán)的氫鍵能;Xaa4是His、Ala、Phe或TrpjXaa5是L-Thr、D-Thr、Ile、Val、Gly、包含Thr-Asn的二肽、或包含Thr-Ala的二肽、或包含Thr-Ala-Asn的三肽,其中L-Thr、D-Thr、Ile、Val、Gly或Asn中任何一個(gè)的羧基末端-OH任選被-麗2替代;并且兩個(gè)Cys殘基通過(guò)二硫鍵相連。在某些實(shí)施方案中,Xaa2參與與C3的非極性相互作用。在其他實(shí)施方案中,Xaa3參與與C3氳鍵鍵合.在其他實(shí)施方案中,Xaa2參與與C3的非極性相互作用,和Xaa3參與與C3氫鍵鍵合。在各種實(shí)施方案中,Xaa2的Trp的類(lèi)似物是自代色氨酸,例如5-氟代-L-色氨酸或6-氟代-L-色氨酸。在其他實(shí)施方案中,Xaa2的Trp類(lèi)似物在第5位包含低級(jí)烷氧基或低級(jí)烷基取代基,例如5-甲氣基色氨酸或5-甲基色氨酸,在其他實(shí)施方案中,Xaa2的Trp類(lèi)似物在笫1位包含低級(jí)烷基或低級(jí)烷?;〈纠龑?shí)施方案包舍1-甲基色氨酸或1-甲?;彼?。在其他實(shí)施方案中,Xaa3的Trp的類(lèi)似物是卣代色氨酸,例如5-氟代-L-色氨酸或6-氟代-L-色氨酸。在某些實(shí)施方案中,Xaa2在色氨酸第l位包含低級(jí)烷?;虻图?jí)烷基取代基,Xaa3任選包含鹵代色氨酸和Xaa4包含丙氨酸。在特定實(shí)施方案中,Xaa2是l-甲基色氨酸或1-甲?;彼岷蚗aa3任選包含5-氟代-L-色氨酸。本發(fā)明的一些示例化合物包含SEQIDN0S:15-25中的任何一個(gè)。在一些實(shí)施方案中,該化合物包含由編碼肽的多核苷酸表達(dá)而生產(chǎn)的肽。在其他實(shí)施方案中,化合物至少部分通過(guò)肽合成來(lái)生產(chǎn)。還可以使用合成法的組合。在某些實(shí)施方案中,C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物是其中化合物是聚乙二醇化的,如包含SEQIDNO:36的化合物示例。在其他實(shí)施方案中,C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物進(jìn)一步包含延長(zhǎng)化合物體內(nèi)保留的另外的肽成分。例如,另外的肽成分可以是白蛋白結(jié)合肽。一個(gè)示例的C3補(bǔ)體抑制素-白蛋白結(jié)合肽綴合物包含SEQIDNO:39。本發(fā)明的另一個(gè)方面的特征是抑制補(bǔ)體激活的化合物,包含SBQIDNO:26或在上文描述的類(lèi)似物和綴合物的任何其他序列的非肽或部分肽模擬物。這些非肽或部分肽模擬物被設(shè)計(jì)用來(lái)結(jié)合C3并抑制補(bǔ)體激活,在同等試驗(yàn)條件下,其活性比包含SEQIDN0:1的肽大至少100倍。本發(fā)明的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物、綴合物和模擬物具有實(shí)用性,用于應(yīng)用C3補(bǔ)體抑制素本身的任何目的,如本領(lǐng)域已知和本文更詳細(xì)描述的。某些這些用途包括化合物配制入給予患者的藥物組合物。這種制劑可以包含該化合物的藥物可接受鹽,以及一種或多種藥物可接受稀釋劑、栽體、賦形劑等等,如在本領(lǐng)域技術(shù)人員權(quán)限內(nèi)的。通過(guò)參考下述詳細(xì)描述、附圖和實(shí)施例會(huì)理解本發(fā)明的各種特征和優(yōu)點(diǎn)o附圖簡(jiǎn)述圖1.表達(dá)的C3補(bǔ)體抑制素及其類(lèi)似物的活性。補(bǔ)體抑制百分比對(duì)Ac-V4W/H9A(SEQIDNO:5)(正方形)和表達(dá)的具有色氨酸的C3補(bǔ)體抑制素(SEQIDN0:15)(圃形)、5-氟代-色氡酸(SEQIDN0:16)(三角形)、6-氟代色氨酸(SEQIDNO:17(星形)、5-羥基-色氦酸(SEQIDNO:27)(六角形)、7-氮雜-色氨酸(SEQIDNO:28)(菱形)的肽濃度的圖。圖2.合成的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的活性。補(bǔ)體抑制百分比對(duì)Ac-V4W/H9A(SEQIDNO:5)(正方形)和在第4位(SEQIDNO:18)(圃形)、第7位(SEQIDNO:19)(三角形)、第4和7位(SEQIDNO:20)(菱形)具有5-氟代-L-色氦酸的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的肽濃度的圍。圖3.另外的合成的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的活性。補(bǔ)體抑制百分比對(duì)以下肽濃度的困(A)Ac-V4W/H9A(SEQIDNO:5)(三角形)與Ac-V4(5f-l-W)/H9A(SEQIDNO:18)(倒置三角形)、Ac-V4(5-甲基-W)/H9A(SEQID冊(cè)22)(圃形)、Ac-V4(l-甲基-W)/H9A(SEQIDNO:23)(菱形)、Ac-V4(2-Nal)/H9A(SEQIDNO:7)(正方形)相比;(B)Ac-V4W/H9A(SEQIDNO:5)(三角形)與Ac-V4W/W7(5f-l-W)/H9A卿IDN0:19)(六邊形)相比;和(C)野生型C3補(bǔ)體抑制素(SEQIDN0:1)(三角形)與Ac-V4(l-甲基-W)/W7(5f-l-W)/H9A(SEQIDN0:24)(尖端向左的三角形)相比。圖4.另外的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物與C3相互作用的熱力學(xué)表征。表明(A)Ac-V4W/H9A(SEQIDN0:5);(B)Ac-V4(5f-l-W)/H9A(SEQIDNO:18);(C)Ac-V4(5-甲基-W)/H9A(SEQIDNO:22);(D)Ac—V4(l-甲基-W)/H9A(SEQIDNO:23);(E)Ac-V4(2-Nal)/H9A(SEQIDNO:7)和(F)Ac-V4W/W7(5f-l-W)/H9A(SEQIDN0:19)與C3結(jié)合的ITC數(shù)據(jù)。該圖是通過(guò)使校正的原始數(shù)據(jù)符合Origin7.0中"onesetofsites"模式而獲得的。圖5.顯示了以logP表示的類(lèi)似物的疏水性與抑制常數(shù)(A)、以-T△S表示的熵(B)和結(jié)合常數(shù)(C)之間關(guān)系的圖。圖6.另外的合成的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的活性。補(bǔ)體抑制百分比對(duì)Ac-V4(l-甲基-W)/H9A(SEQIDNO:23)(圃形)和Ac-V4(l-甲?;?W)/H9A(SEQIDNO:25)(正方形)的肽濃度的圖。圖7.聚乙二醉化C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的活性。補(bǔ)體抑制百分比對(duì)Ac-V4(l-甲基-W)/H9A(SEQIDNO:23)(圃形)和Ac-V4(l-甲基-W)/H9A-K-PEG5000(SEQIDNO:36)(正方形)的肽濃度的圖。困8.白蛋白結(jié)合蛋白-綴合的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的活性.補(bǔ)體抑制百分比對(duì)Ac-V4(l-甲基-W)/H9A(SEQIDNO:23)(圃形)和融合肽(Ac-ICV(lMeW)QDWGAHRCTRLIEDICLPRWGCLWEDD-NH2)(SEQIDNO:39)(正方形)的肽濃度的圖。示例實(shí)施方案的詳細(xì)描述與本發(fā)明的方法及其他方面有關(guān)的各種術(shù)語(yǔ)貫穿說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)使用。這種術(shù)語(yǔ)賦予它們?cè)诒绢I(lǐng)域通常的意思,除非另有陳述。其他具體限定的術(shù)語(yǔ)以與本文提供的定義一致的方式進(jìn)行解釋。定義說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例中可以使用下列縮寫(xiě)Ac,乙?;?;NH2,氨基;MALDI,基質(zhì)輔助激光解吸離子化;T0F,飛行時(shí)間;ITC,等溫滴定量熱法;HPLC,高效液相色鐠法;M,非活性的;dT,D-蘇氨酸;2-Nal,2-萘基丙氨酸;l-Nal,l-萘基丙氨酸;2-Igl,2-茚滿基甘氨酸;Dht,二氫色氨酸;Bpa,4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸;5f-l-W,5-氟代-L-色氛酸;6f-l-W,6-氟代-L-色氨酸;5-0H-W,5-羥色氣酸;5-甲氧基-W,5-甲氣基色氨酸;5-甲基-W,5-甲基色氨酸;l-甲基-W,1-甲基色氨酸;氨基酸縮寫(xiě)使用標(biāo)準(zhǔn)的三或單字母命名法,例如對(duì)于色氨酸,用Trp或W。本文使用的術(shù)語(yǔ)"大約"當(dāng)涉及可測(cè)值,如量、持續(xù)時(shí)間等時(shí),意思是包括從給定值±20%或±10%,在一些實(shí)施方案中±5%,在一些實(shí)施方案中士1、和在一些實(shí)施方案中土O.1%的變化,因?yàn)檫@種變化適于作出并用于公開(kāi)的化合物和組合物。術(shù)語(yǔ)"藥物活性的"和"生物活性的"是指本發(fā)明化合物結(jié)合C3或其片段并抑制補(bǔ)體激活的能力。這種生物活性可以通過(guò)幾種本領(lǐng)域認(rèn)可的試驗(yàn)中的一種或多種進(jìn)行測(cè)定,如本文更詳細(xì)描述的.本文使用的"烷基"是指具有大約1至大約10個(gè)碳原子(和那里碳原子范圍和具體數(shù)量的所有組合和亞組合)的任逸取代的飽和直鏈、支鏈或環(huán)狀烴,大約1至大約7個(gè)碳原子是優(yōu)選的。烷基包括但不限于曱基、乙基、正-丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、環(huán)戊基、異戊基、新戊基、正己基、異己基、環(huán)己基、環(huán)辛基、金剛烷基、3-甲戊基、2,2-二甲丁基和2,3-二曱丁基。術(shù)語(yǔ)"低級(jí)烷基"是指具有大約1至大約5個(gè)碳原子(和那里碳原子范圍和具體數(shù)量的所有組合和亞組合)的任選取代的飽和直鏈、支鏈或環(huán)狀烴。低級(jí)烷基包括但不限于甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、環(huán)戊基、異戊基和新戊基。本文使用的"鹵代"是指F、Cl、Br或I。本文使用的"烷?;?可以與"酰基"互換使用,是指具有大約1至大約10個(gè)碳原子(和那里碳原子范圍和具體數(shù)重的所有組合和亞組合)的任選取代的一個(gè)直鏈或支鏈或脂肪族非環(huán)狀殘基。烷跣基包括但不限于甲跣基、乙酰基、丙?;⒍□;惗□;?、戊跣基、異戊?;?、2-甲基-丁?;?,2-二甲基丙酰基、己跣基、庚?;⑿刘;?。術(shù)語(yǔ)"低級(jí)烷酰基"是指具有大約1至大約5個(gè)碳原子(和那里碳原子范圍和具體數(shù)量的所有組合和亞組合)的任選取代的直鏈或支鏈脂肪族非環(huán)狀殘基。低級(jí)烷酰基包括但不限于甲?;⒁阴;?、正丙酰基、異丙酰基、丁酰基、異丁?;⑽祯;?、異戊酰基等。本文使用的"芳基"是指具有大約5至大約14個(gè)碳原子(和那里碳原子范圍和具體數(shù)量的所有組合和亞組合)的任選取代的單環(huán)或二環(huán)芳環(huán)系統(tǒng),大約6至大約IO個(gè)碳原子是優(yōu)選的.非限制實(shí)例包括例如苯基和茶基。本文使用的"芳烷基"是指具有大約6至大約20個(gè)碳原子(和那里碳原子范圍和具體數(shù)量的所有組合和亞組合)的含芳基取代基的烷基,大約6至大約12個(gè)碳原于是優(yōu)選的。芳烷基可以任意取代。非限制實(shí)例包括例如苯甲基、萘?xí)趸?、二苯甲基、三苯甲基、苯乙基和二苯乙基。本文使用的術(shù)語(yǔ)"烷氧基"是指任選取代的烷基-O-基,其中烷基如前定義。示例的烷氧基包括甲氣基、乙氧基、正丙氧基、異丙氣基、正丁氧基和庚氣基等等。本文使用的"羧基"是指-C—0)0H基。本文使用的"烷氧羰基"是指-C(-O)0-烷基,其中烷基如前定義。本文使用的"芳酰基"是指-C(-O)芳基,其中芳基如前定義。示例的芳?;ū郊椎⒒洼恋⒒5湫偷?,取代的化學(xué)部分包括取代分子上選定位置的氳的一個(gè)或多個(gè)取代基。示例的取代基包括例如囟代、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、芳基、巰基、羥基(-OH)、烷氧基、氛基(-CN)、羧基(-C00H)、醜基(烷?;?-CH))R);-C(-0)0-烷基、甲酕胺基(-C(0)NH2)、-N-取代的甲酰胺基(-C(-0)NHR")、CF3、CF2CF3等。至于上述取代基,每部分R,,可以單獨(dú)例如是H、烷基、環(huán)烷基、芳基或芳烷基中的任何。本文使用的"L-氨基酸"是指蛋白質(zhì)中正常存在的任何天然存在的左旋oc-氨基酸或那些cx-氨基酸的烷基酯。術(shù)語(yǔ)"D-氡基酸"是指右旋cc-氨基酸,除非另外規(guī)定,本文提及的全部氨基酸是L-氨基酸。"疏水"和"非極性"在本文同義使用,是指不以偶極為特征的分子間或分子內(nèi)任何相互作用。本文使用的"pi符號(hào)"是指C3補(bǔ)體抑制素參與pi與C3鍵舍的能力。Pi鍵由兩個(gè)平行的p軌域側(cè)向重疊產(chǎn)生。本文使用的"氬鍵能"是指C3補(bǔ)體抑制素參與與C3靜電吸引的能力,涉及C3補(bǔ)體抑制素上修飾的色氨酸殘基或色氨酸類(lèi)似物上帶負(fù)電的部分和C3上的氫原子。這種帶負(fù)電部分的非限制實(shí)例是氟原子。"聚乙二醇化"是指其中至少一個(gè)聚乙二醇(PEG)部分,無(wú)論其大小,與蛋白質(zhì)或肽化學(xué)連接形成PEG-肽綴合物的反應(yīng)。聚乙二醇化意思是至少一個(gè)PEG部分,不管其大小,化學(xué)連接于肽或蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)PEG通常帶有數(shù)字后綴,其指明PEG聚合物的近似平均分子量;例如PEG-8,000是指平均分子量為大約8,000的聚乙二醇。本文使用的"藥物可接受鹽"是指所公開(kāi)化合物的衍生物,其中母體化合物通過(guò)制備其酸或堿鹽而被修飾.藥物可接受鹽的實(shí)例包括但不限于堿性殘基例如胺類(lèi)的無(wú)機(jī)或有機(jī)酸鹽;酸性殘基例如羧酸類(lèi)的堿性或有機(jī)鹽等等。因此術(shù)語(yǔ)"酸加成鹽"是指通過(guò)添加酸而制備的母體化合物的相應(yīng)鹽衍生物。藥物可接受鹽包括由無(wú)機(jī)或有機(jī)酸形成的母體化合物的常規(guī)鹽或季銨鹽。例如,這種常規(guī)鹽包括但不限于源自無(wú)機(jī)酸如鹽酸、氬溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的鹽;和由無(wú)機(jī)酸如醋酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、棕櫚酸、馬來(lái)酸、羥基馬來(lái)酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、磺胺酸、2-乙酸基苯甲酸、反丁烯二酸、甲苯橫酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙磺酸等制備的鹽,本發(fā)明的某些酸性或堿性化合物可以以?xún)尚噪x子形式存在,所有形式的化合物,包括游離酸、游離堿和兩性離子都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。說(shuō)明書(shū)根據(jù)本發(fā)明,已經(jīng)使用關(guān)于C3補(bǔ)體柙制素的生物和物理化學(xué)特性的信息設(shè)計(jì)了與親本C3補(bǔ)體抑制素肽相比活性顯著提高的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物。在一些實(shí)施方案中,該類(lèi)似物具有C3補(bǔ)體抑制素的至少50倍或更大的活性.在其他實(shí)施方案中,該類(lèi)似物具有C3補(bǔ)體抑制素的60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、或130倍或更大的活性。還在其他的實(shí)施方案中,使用實(shí)施例中描述的試驗(yàn)來(lái)比較,該類(lèi)似物具有C3補(bǔ)體抑制素的135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265倍或更大的活性。已經(jīng)表明根據(jù)其他方法合成的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物具有與親本肽相比稍微提高的活性,即達(dá)到大約99倍(Mallik,B.等,2005,見(jiàn)上;W02004/026328)。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的類(lèi)似物甚至具有比迄今為止生產(chǎn)的親本肽或其類(lèi)似物更大的活性,如本文附圖和實(shí)施例中所示的體外試驗(yàn)所證明。表1B顯示了C3補(bǔ)體抑制素和活性顯著提髙的所選類(lèi)似物的氨基酸序列和補(bǔ)體抑制活性,選擇的類(lèi)似物涉及與親本肽C3補(bǔ)體抑制素(SEQIDN0:1)和與SEQNOS:2-14的肽相比指定位置(1-13)的特異性修飾,如表1A所示,其在WO2004/026328中描述。SEQIDNOS:15-24的肽代表根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的修飾,產(chǎn)生了明顯更有效的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物。如下面更詳細(xì)描述的,很清楚如SEQIDN0SJ-13所列出的對(duì)第4位上的色氨酸進(jìn)行的某些修飾可以與第7位上的色氦酸類(lèi)似物置換結(jié)合,形成另外的強(qiáng)效C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>這個(gè)表中使用的縮寫(xiě)如下dT-D-蘇氨酸2-Na卜2-萘基丙氨酸1-Nal-l-萘基丙氨酸2-Igl=2-茚滿基甘氨酸Dht-二氬色氛酸Bpa-4-苯甲酰基-L-苯丙氨酸5f-l-W巧-氣代-L-色氨酸6f-1-W6-氣代-L-色氡酸5-OH-W-5-羥色氨酸5-甲氧基-W-5-甲氣基色氨酸5-甲基-W-5-甲基色氨酸l-甲基-W-l-甲基色氨酸l-甲?;?W-l-甲?;彼酦-末端的修飾。N-末端的乙?;湫偷卦黾覥3補(bǔ)體抑制素及其類(lèi)似物的補(bǔ)體抑制活性,如通過(guò)SEQIDNO:1與SEQIDNO:2比較具體可見(jiàn)。因此,肽的氨基末端添加酰基,包括但不限于N-乙跣化,是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案,當(dāng)合成制備肽時(shí)特別實(shí)用。然而,通過(guò)在原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)編碼肽的核酸分子,或通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯而制備肽時(shí),有時(shí)也有利。對(duì)于這些實(shí)施方案,可以使用天然存在的N-末端。適于體外或體內(nèi)表達(dá)C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的一個(gè)實(shí)例以SEQIDNOS:15-17為代表,其中在N-末端乙酰基被未修飾的甘氨酸替代。如下所討論的在肽內(nèi)和在C-末端另外包含修飾的SEQIDNOS:15-17在本文描述的補(bǔ)體抑制試驗(yàn)中比C3補(bǔ)體抑制素活性高大約45至大約125倍。肽內(nèi)修飾。使用為低能量序列分級(jí)的計(jì)算方法,以前測(cè)定了Tyr和Val是第4位上支持肽穗定性和活性最可能的候選者(KlepeisJL等,2003)。WO2004/026328中7>開(kāi)了Trp在第4位,尤其是聯(lián)合Ala在第9位,產(chǎn)生比親本肽活性高很多倍的肽(例如,SEQIDNOS:4、5和6與SEQIDNOS:2和3的活性比較)。W02004/026326還公開(kāi)了發(fā)現(xiàn)在第4位包含色氨酸類(lèi)似物2-萘基丙氡酸(SEQIDNOS:7、8)、l-萘基丙氡酸(SEQIDNO:9)、2-茚滿基甘氨酸(SEQIDNOS:10、11)或二氫色氨酸(SEQIDNO:12)的肽的補(bǔ)體抑制活性全部增加,范圍從大于C3補(bǔ)體抑制素5倍至99倍。此外,在第4位包含苯丙氨酸類(lèi)似物、4-苯甲?;?L-丙氨酸的肽(SEQIDNO:13)活性比C3補(bǔ)體抑制素大49倍。根據(jù)本發(fā)明,在第4位包含5-氟代-L-色氨酸(SEQIDN0:19)或5-甲氧基、5-甲基或1-甲基色氛酸或者l-甲?;彼岬碾?分別是SEQIDN0S:21、22、23和25)比C3補(bǔ)體抑制素活性大31-264倍。1-曱基或1-甲?;彼岬膿饺肱c其他類(lèi)似物相比增加了活性和結(jié)合親合力最大。人們相信在第4位吲哚'N,介導(dǎo)的氫鍵對(duì)于C3補(bǔ)體抑制素的結(jié)合和活性不是必要的。通過(guò)在笫4位用低級(jí)烷基、烷酰基或吲哚氮取代氫引起缺乏這個(gè)氫鍵或極性降低使C3補(bǔ)體抑制素結(jié)合和活性增加。不意欲限于任何特定的理論或作用機(jī)制,人們相信在第4位的疏水作用或效應(yīng)加強(qiáng)C3補(bǔ)體抑制素與C3的相互作用。因此,方法改變側(cè)鏈結(jié)構(gòu))或Trp類(lèi)似物的置換包括在本發(fā)明中以生產(chǎn)甚至更大活性的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物。這種類(lèi)似物是本領(lǐng)域熟知的,包括但不限于本文例證的類(lèi)似物,以及其未取代或者取代的衍生物。適當(dāng)?shù)念?lèi)似物實(shí)例可以參考下列出版物和很多其他的出版物而找到Beene,等(2002)Biochemistry41:10262-10269(尤其描述了單和多鹵代Trp類(lèi)似物);Babitzky&Yanofsky(1995)J.Biol.Che邁.270:12452-12456(尤其描述了甲基化和卣代Trp及其他Trp和吲哚類(lèi)似物)和美國(guó)專(zhuān)利6,214,790、6,169,057、5,776,970、4,870,097、4,576,750和4,299,838。Trp類(lèi)似物通過(guò)體外或體內(nèi)表達(dá),或通過(guò)肽合成被引入C3補(bǔ)體抑制素肽,如本領(lǐng)域已知的和實(shí)施例中更詳細(xì)描述的。在某些實(shí)施方案中,C3補(bǔ)體抑制素的笫4位Trp被類(lèi)似物替代,該類(lèi)似物包含1-烷基取代基,更具體地包含如上定義的低級(jí)烷基(例如d-Cs)取代基。這些包括但不限于N(ot)甲基色氨酸和5-甲基色氨酸。在其他的實(shí)施方案中,C3補(bǔ)體抑制素笫4位的Trp被類(lèi)似物替代,該類(lèi)似物包含1-烷?;〈?,更具體地包含如上定義的低級(jí)烷酖基(例如d-Cs)取代基。除了例證的類(lèi)似物之外,這些包括但不限于1-乙酰基-L-色氨酸和L-p-同型色氛酸。熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明相對(duì)于野生型C3補(bǔ)體抑制素,在第7位摻入5-氟代-L-色氨酸增加了C3補(bǔ)體抑制素與C3之間相亙作用的焓,而在C3補(bǔ)體抑制素第4位摻入5-氟代-色氨酸降低了這種相互作用的烚。不意欲受任何特定機(jī)制的束縛,前面的結(jié)果表明在C3補(bǔ)體抑制素第7位Trp殘基上用氟原子替代吲哚氫可以加強(qiáng)吲咮環(huán)的氬鍵能,引入新的氫鍵能,或通過(guò)結(jié)合交界面的水分子介導(dǎo)與C3的相互作用。(KatragaddaM等,2004)。因此,保持或增強(qiáng)上述氬鍵能,或通過(guò)結(jié)合交界面的水分子介導(dǎo)與C3的相互作用,在第7位Trp的修飾(例如根據(jù)本領(lǐng)域熟知方法改變側(cè)鏈結(jié)構(gòu))或Trp類(lèi)似物的置換包括在本發(fā)明中以生產(chǎn)具有甚至更大活性的類(lèi)似物。在某些實(shí)施方案中,其吲咪環(huán)具有修飾的Trp類(lèi)似物可以通過(guò)體外或體內(nèi)表達(dá),或通過(guò)肽合成而引入C3補(bǔ)體抑制素肽的第7位,所述修飾引起氫鍵能增加或通過(guò)結(jié)合交界面的水分子介導(dǎo)與C3的相互作用。發(fā)現(xiàn)在第7位包含色氨酸類(lèi)似物5-氟代-色氨酸的肽(SEQIDNO:19)與C3補(bǔ)體抑制素相比,活性增加121倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中,Trp類(lèi)似物摻入C3補(bǔ)體抑制素分子的笫4和7位,和任選C3補(bǔ)體抑制素笫9位的His被Ala替代。熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明相對(duì)于野生型C3補(bǔ)體抑制素,在第4和7位摻入5_氟代-色氨酸增加C3補(bǔ)體抑制素和C3之間相互作用的焓。因此,經(jīng)由第4位保持或增加上述與C3的疏水性相互作用和經(jīng)由第7位保持或增加上述與C3的氮鍵能,或經(jīng)由第7位通過(guò)結(jié)合交界面的水分子介導(dǎo)與C3的相互作用,在第4和7位Trp的修飾(例如根據(jù)本領(lǐng)域熟知方法改變側(cè)鏈結(jié)構(gòu))或Trp類(lèi)似物的置換包括在本發(fā)明中以生產(chǎn)甚至更大活性的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物。這種修飾的Trp或Trp類(lèi)似物可以通過(guò)體外或體內(nèi)表達(dá),或通過(guò)肽合成被引入C3補(bǔ)體抑制素肽的第4和7位。發(fā)現(xiàn)在第4和7位包含色氨酸類(lèi)似物5-氣代-色氨酸的肽(SEQIDNO:16)和包含色氨酸類(lèi)似物6-氣代色氛酸(SEQIDNO:17)具有比C3補(bǔ)體抑制素顯著增加的活性,活性增加范圍從112倍至264倍。此外,發(fā)現(xiàn)在第4位包含色氨酸類(lèi)似物1-甲基-色氨酸和第7位包含5-氟代-色氨酸的肽(SEQID冊(cè)24)相對(duì)于C3補(bǔ)體押制素活性増加264倍。羧基末端的修飾。通過(guò)合成法生產(chǎn)的肽通常羧基末端被修飾包舍氨基而不是酸;這種常見(jiàn)修飾可以參見(jiàn)表1的C3補(bǔ)體抑制素(SEQIDN0:1)和幾個(gè)類(lèi)似物。的確,在有些情況下,已經(jīng)測(cè)定到含有末端氨基的肽具有比末端含酸的肽更大的活性(例如SEQIDNOS:5和7分別與SEQIDN0S:4和8相比)。因此,本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案使用了C末端氨基修飾。然而,一些情況下在C末端使用酸有利。這種情況包達(dá),C3補(bǔ)體抑制素的羧基末端殘基是蘇氨酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,C末端蘇氨酸被一個(gè)或多個(gè)天然存在的氨基酸或類(lèi)似物取代。例如,具有SEQIDNO:6的肽包含D-蘇氨酸而不是L-蘇氨酸,和在C末端進(jìn)一步具有C00H。這個(gè)肽顯示出活性等于C末端包含L-蘇氨酸和C0冊(cè)2的肽SEQIDN0:5。此外,His替代了第13位的Thr,獲得了活性比C3補(bǔ)體抑制素大21倍的肽。此外SEQIDN0S:14-17的肽,其C末端包含Asn的肽延伸,或Ala-Asn二肽延伸,以及C末端C00H和非乙?;疦-末端,證明活性比C3補(bǔ)體抑制素大38至126倍。它們還適于經(jīng)由原核或真核生物表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn),如下面更詳細(xì)描述的。本發(fā)明的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物可以通過(guò)各種肽合成法,根據(jù)常規(guī)肽合成方法經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的縮合來(lái)制備。例如,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)固相法合成肽,例如可以根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū),在AppliedBiosystemsModel431A肽合成儀(AppliedBiosystems,FosterCity,加利福尼亞州)上進(jìn)行。通過(guò)閨相法或液相法合成肽或模擬肽的其他方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的.在肽合成過(guò)程中,支鏈氨基和羧基可以根椐需要被保護(hù)/去保護(hù),使用通常已知的保護(hù)基。實(shí)施例3中列出了適當(dāng)?shù)碾暮铣煞ǖ膶?shí)例。利用選擇性肽和肽衍生物的保護(hù)基進(jìn)行修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。作為選擇,本發(fā)明的某些肽可以通過(guò)在適當(dāng)?shù)脑嘶蛘婧讼到y(tǒng)表達(dá)來(lái)生產(chǎn)。例如,DNA構(gòu)建體可以插入適宜于在細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)或酵母細(xì)胞(例如釀酒酵母)中表達(dá)的質(zhì)粒栽體,或插入用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒栽體或用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的病毒栽體。這種載體包含DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的調(diào)控元件,其以使得允許DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方式安置。表達(dá)所需的這種調(diào)控元件包括啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列和任選增強(qiáng)子序列。SEQIDN0S:14-17和設(shè)計(jì)相似的其他肽適于通過(guò)體外或體內(nèi)表達(dá)核酸分子來(lái)生產(chǎn)。編碼肽多連體的DM構(gòu)建體可以被引入體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng),多連體的上限取決于所用的表達(dá)系統(tǒng)。多連體產(chǎn)生后,通過(guò)多肽暴露于肼來(lái)實(shí)現(xiàn)C末端Asn和下列N末端G之間的切割。在重組原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)基因而生產(chǎn)的肽可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法來(lái)純化。實(shí)施例l和2列出了適于在本發(fā)明中使用的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中,可使用市場(chǎng)上可買(mǎi)到的表達(dá)/分泌系統(tǒng),由此重組肽被表達(dá)并此后從宿主細(xì)胞分泌出來(lái),易于從周?chē)囵B(yǎng)基中純化。也可以使用基因表達(dá)和合成法組合生產(chǎn)C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物,例如,類(lèi)似物可以通過(guò)基因表達(dá)來(lái)生產(chǎn)和此后經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)翻譯后合成過(guò)程,例如修飾N-或C-末端或使分子環(huán)化。C3補(bǔ)體抑制素的結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域已知的,上述類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)通過(guò)類(lèi)似方法來(lái)測(cè)定。一旦已經(jīng)確定了特別期望的短肽構(gòu)象,設(shè)計(jì)肽或肽模擬物以適合那個(gè)構(gòu)象的方法就是本領(lǐng)域熟知的。參見(jiàn)例如G.R.Marshall(1993),Tetrahedron,49:3547-3558;HrubyandNikiforovich(1991),inMolecularConformationandBiologicalInteractions,P.Balaram&S.Ramasehan,eds,,IndU"cad,ofSci.,Bangalore,PP,429-455)。與本發(fā)明特別相關(guān)的是,通過(guò)考慮氨基酸殘基的各種側(cè)鏈所起的作用可以進(jìn)一步改善肽類(lèi)似物的設(shè)計(jì),如上討論(即對(duì)于官能團(tuán)或?qū)τ诳臻g因素的影響)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到為了提供與C3結(jié)合和抑制補(bǔ)體激活所需的特殊主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈官能度,肽模擬物同樣可以很好地充當(dāng)肽。因此,通過(guò)使用天然存在的氨基酸、氨基酸衍生物、類(lèi)似物或非氨基酸分子生產(chǎn)與C3結(jié)合、抑制補(bǔ)體的化合物包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。非肽類(lèi)似物或包含肽和非肽成分的類(lèi)似物有時(shí)本文稱(chēng)為"肽模擬物"或"等構(gòu)模擬物,,以指明本發(fā)明肽的置換或衍生,其具有相同主鏈構(gòu)象特征和/或其他官能度,以致它們與示例肽足夠相似以抑制補(bǔ)體激活。模擬肽用于開(kāi)發(fā)高親合力肽類(lèi)似物的用途是本領(lǐng)域熟知的(參見(jiàn)例如ZhaoB等,1995;Beeley,N.1994;和Hruby,VJ1993)。假定旋轉(zhuǎn)限制類(lèi)似于肽內(nèi)的氨基酸殘基,可以分析包含非氨基酸部分的類(lèi)似物,和通過(guò)拉馬錢(qián)德蘭圖(Hruby&Nikiforovich1991),連同其他已知技術(shù)來(lái)證實(shí)它們的構(gòu)象基序。本發(fā)明的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物可以通過(guò)將聚乙二醇(PEG)成分添加至肽來(lái)修飾。如本領(lǐng)域熟知的,聚乙二醇化可以增加治療肽和蛋白質(zhì)在體內(nèi)的半衰期。在一個(gè)實(shí)施方案中,PEG平均分子量大約l,OOO至大約50,000。在另一個(gè)實(shí)施方案中,PBG平均分子量大約l,OOO至大約20,000。在另一個(gè)實(shí)施方案中,PEG平均分子量大約l,OOO至大約10,000。在示例的實(shí)施方案中,PEG平均分子量大約5,000,聚乙二醇可以是支鏈或直鏈,和優(yōu)選直鏈。本發(fā)明的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物可以經(jīng)連接基與PEG共價(jià)結(jié)合。這種方法是本領(lǐng)域熟知的。(在KozlowskiA.等2001中綜述;也參見(jiàn)HarrisJMandZalipskyS,eds,Poly(ethyleneglycol),ChemistryandBiologicalApplications,ACSSymposiumSeries680(1997))??山邮艿倪B接基的非限制性實(shí)例包括酯基、酰胺基、酰亞胺基、氨基甲酸酯基、羧基、羥基、碳水化合物、琥珀酰亞胺基(包括不限于琥珀酰亞胺基琥珀酸鹽(SS)、琥珀酰亞胺基丙酸鹽(SPA)、琥珀酰亞胺基羧甲酸鹽(SCM)、琥珀酰亞胺基琥珀酸胺(SSA)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS))、環(huán)氧基、氧羰基咪唑基(包括不限于羰基咪唑基(CDI))、硝苯基(包括不限于硝苯基碳酸鹽(NPC)或三氯苯基碳酸鹽(TPC))、trysylate基、醛基、異氛酸酯基、乙烯砜基、酪氨酸基、半胱氨酸基、組氨酸基、或伯胺。在某些實(shí)施方案中,連接基是琥珀酰亞胺基。在一個(gè)實(shí)施方案中,連接基是NHS。本發(fā)明的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物可以選擇通過(guò)氨基、巰基、羥基或羧基直接與PEG偶聯(lián)(即無(wú)連接基)。在一個(gè)實(shí)施方案中,PEG與賴(lài)氨酸殘基連在一起被添加至C3補(bǔ)體抑制素C末端。聚乙二醇化是一種增加治療肽和蛋白質(zhì)在體內(nèi)保留時(shí)間的方法。通過(guò)將肽與某些其他肽連接還可以降低肽的體內(nèi)清除率。例如,當(dāng)某些白蛋白結(jié)合肽通過(guò)靜脈內(nèi)推注給兔子時(shí),顯示出罕見(jiàn)的2.3h的長(zhǎng)半衰期(Dennis等,2002)。這個(gè)類(lèi)型的肽與抗組織因子-D3H44的Fab融合使Fab能夠與白蛋白結(jié)合,同時(shí)保留Fab結(jié)合組織因子的能力(Nguyen等,2006)。這種相互作用白蛋白導(dǎo)致與野生型D3H"Fab相比時(shí),在小鼠和兔子體內(nèi)清除率顯著降低和半衰期延長(zhǎng),可與對(duì)于聚乙二醇化的Fab分子、免疫粘附素和白蛋白融合蛋白中所見(jiàn)的相匹敵。如本文實(shí)施例11所述,發(fā)明人合成了與白蛋白結(jié)合肽融合的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物并證明了該融合蛋白有抑制補(bǔ)體激活的活性。C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物、模擬肽和綴合物的補(bǔ)體激活抑制活性可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種試驗(yàn)測(cè)試。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,使用實(shí)施例4中描述的試驗(yàn)。美國(guó)專(zhuān)利6,319,897中列出了其他試驗(yàn)的非詳盡清單,包括但不限于(l)肽與C3和C3片段結(jié)合試驗(yàn);(2)各種溶血試驗(yàn);(3)C3轉(zhuǎn)變酶介導(dǎo)的C3切割的測(cè)定;和(4)因子D切割因子B的測(cè)定。本文描述的肽和模擬肽具有實(shí)用性,用于應(yīng)用C3補(bǔ)體抑制素本身的任何目的,如本領(lǐng)域已知的。這種應(yīng)用包括但不限于(l)在患者(人或動(dòng)物)血清、組織或器官中抑制補(bǔ)體激活,其可以促進(jìn)某些疾病或病情的治療,包括但不限于年齡相關(guān)的黃斑變性、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、脊髄損傷、帕金森氏癥和阿爾茨海默氏病;(2)抑制使用人造器官或植官);(3)抑制生理性流體(血'、尿)的體外分流期間發(fā)生的補(bǔ)體激活(例如將本發(fā)明的肽涂布分流流體的管道);和(4)篩選小分子文庫(kù)以鑒定抑制素類(lèi)似物竟?fàn)幗Y(jié)合C3或C3片段的能力的液相或固相高通量試驗(yàn))。提供下列實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。它們的意困是說(shuō)明,而不是限制本發(fā)明。使用實(shí)施例1-5中列出的材料和方法產(chǎn)生實(shí)施例6-11中描述的結(jié)果。實(shí)施例1C3補(bǔ)體抑制素的細(xì)菌表達(dá)具有下列序列NH2-GICVWQDWGAHRCTN-OH("G(-1)/V4W/H9A/N14")(SEQIDNO:15)的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物以與殼多糖結(jié)合城和DnaB內(nèi)含肽(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)融合的形式表達(dá)。在肽序列和大煬桿菌的密碼子使用的指導(dǎo)下,使用下列遺傳密碼產(chǎn)生具有下列序列的這個(gè)肽的合成基因NO:29)為將合成基因克隆入pGEM-T栽體,設(shè)計(jì)含有Sapl位點(diǎn)的5'側(cè)翼區(qū)和含有PstI位點(diǎn)的3'側(cè)翼區(qū)。為構(gòu)建合成基因,使用DnaWorks軟件設(shè)計(jì)如下顯示的四個(gè)重疊的寡核苷酸并在InvitrogenInc.(Carlsbad,CA)合成5'GGTGGTGCTCTTCCAACGGTATTTGCGTTTGGCAGGA3'(SEQIDNO:30)s'TTGGGGTGCGCACCGTTGCACCAATTAACTGCAGG3'(SEQIDNO:31)3CAACGTGGTTAATTGACGTCCGC5'卿IDNO:32)3CATAAACGCAAACCGTCCTAACCCCACGCGTGG5'(SEQIDNO:33)重疊DNA片段如Stemmer等,1995所述通過(guò)PCR組合。使用下列引物擴(kuò)增所產(chǎn)生的基因5CGCCTGCAGTTAATTGGT3'(SEQIDNO:34)s'GGTGGTGCTCTTCCAACG3(SEQIDNO:35)然后將C3補(bǔ)體抑制素的PCR擴(kuò)增片段克隆入pGEM-T栽體,并用Pstl和SapI消化所得克隆。將編碼C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的Pstl-SapI片段進(jìn)一步亞克隆入表達(dá)栽體pTWINl,該栽體已經(jīng)預(yù)先用PstI和SapI消化;通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)證實(shí)該克隆的序列。為表達(dá)C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物,用C3補(bǔ)體抑制素克隆轉(zhuǎn)化的ER2566大腸桿菌細(xì)胞在SOB培養(yǎng)基(20g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母骨、0.5g/LNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2)中37C生長(zhǎng)。當(dāng)OD600達(dá)到O.7時(shí),添加IPTG至終濃度O.3mM誘導(dǎo)表達(dá),隨后在37t;另外孵育4小時(shí)。離心收集細(xì)胞和在補(bǔ)充O.2%Tween-20的緩沖液B1(20mM磷酸鹽緩沖液,pH8.5,500mMNaCl和1mMEDTA)中超聲裂解。細(xì)胞提取物離心,可溶組分填入緩沖液Bl預(yù)平衡過(guò)的殼多糖結(jié)合柱(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)。用100ml緩沖液Bl洗滌柱,隨后用3柱體積的緩沖液B2(50mM乙酸銨,pH7.O)迅速洗滌,柱在室溫下孵育20小時(shí),用緩沖液B2洗脫肽,凍干并在C18HPLC柱上進(jìn)一步純化。使用MALDI-TOF質(zhì)譜法鑒定純化肽。實(shí)施例2C3補(bǔ)體抑制素的色氛酸類(lèi)似物在大腸桿菌中的表達(dá)為表達(dá)含有色氨酸衍生物的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物,pTWTN1-C3補(bǔ)體抑制素克隆轉(zhuǎn)化Trp82營(yíng)養(yǎng)缺陷型ER2566。在補(bǔ)充1mM如上所述的L-色氨酸的M9基本培養(yǎng)基中進(jìn)行表達(dá)。細(xì)胞生長(zhǎng)至OD600為0.8-1.0,然后離心收集并重懸于含有2mM期望的色氨酸類(lèi)似物的新鮮基本培養(yǎng)基中,色氛酸類(lèi)似物為5-氟代-色氨酸,6-氟代-色氨酸、7-氮雜-色氦酸或5-羥色氨酸。表達(dá)的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物進(jìn)一步如實(shí)施例1所述純化。實(shí)施例3肽合成肽合成和純化如Sahu等,1996;Sahu等,2000;和Mallik等,2005所述進(jìn)行,簡(jiǎn)言之,使用Fmoc氨基樹(shù)脂和標(biāo)準(zhǔn)的側(cè)鏈保護(hù)基在A卯1iedBiosystem肽合成儀(型號(hào)431A)中合成肽。肽在22t:與含有5%苯酚、5%苯硫基甲烷、5%水、2.5%乙二疏醇和82.594三氟乙酸(TFA)的溶刑混合物孵育3小時(shí),將其從樹(shù)脂切下來(lái)。反應(yīng)混合物通過(guò)坡璃燒結(jié)的漏斗過(guò)濾,用冷乙醚沉淀,溶于含0.1%TFA的50%乙腈,凍干。將切割后獲得的粗肽溶于含0.1%TFA的10%乙猜并使用反相C-18柱純化(Waters,Milford,MA)。使用試劑三氟醋酸鉈(III)通過(guò)樹(shù)脂上環(huán)化法實(shí)現(xiàn)二疏化物氧化。這個(gè)方法刪除了稀釋溶液氣化的步驟和隨后的反相HPLC前通過(guò)凍干而濃縮的耗時(shí)步驟。使用這個(gè)方法,不存在多聚體的形成并獲得了高水平(~90%)的愚笨去保護(hù)、氧化或環(huán)化物質(zhì)。激光解吸質(zhì)謙法和HPLC證實(shí)了所有肽的同一性和純度。對(duì)于5-氟代-色氨酸、1-甲基-色氨酸和5-甲基-色氨酸類(lèi)似物的合成,使用Fmoc-dl-衍生物。肽對(duì)映體的分離如Meyers等1978所述進(jìn)行。每個(gè)肽的dl混合物在C18反相HPLC柱上使用含10%乙腈的0.01M乙酸銨,pH4.l分離為d和1同質(zhì)異構(gòu)肽。用V8蛋白酶處理肽,隨后4吏用MALDI-T0F質(zhì)鐠法(MicroMassT0Fspec2E)分析,測(cè)定洗脫肽的同分異構(gòu)的同一性。實(shí)施例4補(bǔ)體抑制試驗(yàn)C3補(bǔ)體抑制素及其類(lèi)似物對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的抑制活性通過(guò)測(cè)定它們經(jīng)免疫復(fù)合物對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活作用來(lái)測(cè)定。補(bǔ)體激活抑制通過(guò)測(cè)定抑制正常人血漿中C3固定于卵白蛋白-抗卵白蛋白復(fù)合物來(lái)估計(jì)。Microliter孔用50W卵白蛋白(10mg/ml)在25C包被2小時(shí)(4X:包被過(guò)夜)。用10mg/邁lBSA200W在25"C浸透該孔1小時(shí),然后添加兔抗卵白蛋白抗體以形成可被補(bǔ)體激活的免疫復(fù)合物。各種濃度的三十微升肽直接添加至每孔,隨后添加l:80稀釋度的人血漿3(HU。30分鐘孵育后,使用山羊抗人C3HRP-偶聯(lián)抗體檢測(cè)結(jié)合的C3b/iC3b。添加ABTS過(guò)氧化物酶底物顯色并在405nm測(cè)量光密度。基于相當(dāng)于100%補(bǔ)體激活的吸光度,將在405nm獲得的吸光度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為抑制%。抑制%對(duì)肽濃度作圖,和使用Origin7.0軟件使所得數(shù)據(jù)集符合對(duì)數(shù)劑量反應(yīng)函數(shù)。引起C3b/iC3b沉淀50%抑制的肽濃度作為ICs。并用于比較各種肽的活性。從達(dá)到最低卡方值的符合參數(shù)中獲得ICs。值。實(shí)施例5C3與C3補(bǔ)體抑制素及其類(lèi)似物相互作用的等溫滴定量熱法分析使用MicrocalVP-ITC量熱儀(MicricalInc,Northampton,MA)實(shí)施等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)。3.5-5MM的蛋白濃度和80-200MM的肽濃度用來(lái)做這個(gè)實(shí)驗(yàn)。全部滴定在PBS(含150mMNaCl的10mM砩酸鹽緩沖液,pH7.4)中進(jìn)行。在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中,靶蛋白、C3輸入細(xì)胞,和肽輸入注射器。全部實(shí)驗(yàn)在251C進(jìn)行,對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn),2W肽注射刑進(jìn)入含蛋白的細(xì)胞,在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中,原始等溫線通過(guò)減去稀釋熱減去代表進(jìn)入緩沖液的肽注射劑的等溫線進(jìn)行校正。使所得等溫線適于Origin7.0軟件內(nèi)的各種模式,和卡方值達(dá)到最低的模式被認(rèn)為適于各自的數(shù)據(jù)集。結(jié)合親合力和熵值針對(duì)logP值作圖。實(shí)施例6通過(guò)細(xì)菌表達(dá)的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物估計(jì)的色氦酸在C3-C3補(bǔ)體抑制素相互作用中的作用使用內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白表達(dá)系統(tǒng)將吲哚環(huán)化學(xué)性質(zhì)不同的四種不同的色氨酸類(lèi)似物引入C3補(bǔ)體抑制素。表達(dá)后,一步純化肽,最終得率2mg/L培養(yǎng)物,還使用MALDI謙指出的ER2566/Trp82營(yíng)養(yǎng)缺陷型表達(dá)色氨酸類(lèi)似物5-氟代-色氨酸、6-氟代-色氨酸、7-氮雜-色氨酸和5-羥色氨酸,純化所得肽至均一。天然C3補(bǔ)體抑制素和類(lèi)似物通過(guò)二硫鍵在體內(nèi)被環(huán)化,通過(guò)它們不能與P服B起反應(yīng)而表明。在反相C18HPLC柱上進(jìn)一步地純化所有的肽。所表達(dá)C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物G(-l)/V4W/H9A/N14(SEQIDN0:15)的活性顯示出1.2PM的IC5。,這類(lèi)似于對(duì)Ac-V4W/H9A類(lèi)似物SEQIDN0:5)觀察到的活性。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明位于所表達(dá)肽N-末端的甘氨酸起著類(lèi)似于位于Ac-V4W/H9A類(lèi)似物N-末端的乙?;淖饔?。發(fā)現(xiàn)除7-氮雜-色氨酸類(lèi)似物之外的所有表達(dá)的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物在所測(cè)試的濃度下都具有活性。然而,肽顯示出相對(duì)于類(lèi)似物Ac-V4W/H9A不同水平的活性(圖1;表2)。在第9位含6-氟代-色氨酸和5-氟代-色氨酸以及丙氨酸的C3補(bǔ)體抑制素分別顯示出比Ac-V4W/H9A類(lèi)似物高2.8和2.5倍的活性。表2.所表達(dá)肽的抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>'相對(duì)于肽H-I(CVVQDWGHHRC)T-NH2(C3補(bǔ)體抑制素,SEQIDN0:1)的活性°代表羥基b代表合成肽不受任何特定機(jī)制的限制,人們相信添加象原子通過(guò)增加吲咮環(huán)的疏水性而增加肽的活性。也研究了摻入疏水性較低的色氨酸類(lèi)似物5-羥色氨酸和7-氮雜-色氨酸。與5-氟代和6-氟代類(lèi)似物的結(jié)果相比,舍5-羥色氨酸的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物與Ac-Y4W/H9A夾似物(SEQIDNO:5)相比顯示出活性降低27.5倍,和含7-氮雜-色氨酸的肽在所測(cè)試濃度下根本未顯示出活性。7-氮雜-色氨酸在分子結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于色氨酸,除了它在吲哚環(huán)的第7位具有一個(gè)氮原子,而不是碳原子。7-氮雜-色氛酸置換時(shí)觀察到的活性降低顯示出這個(gè)碳原子的相對(duì)重要性。實(shí)施例7各個(gè)色氨酸在C3-C3補(bǔ)體抑制素相互作用中的作用使用固相肽合成產(chǎn)生在第4位、第7位或第4和第7兩個(gè)位置選擇性摻入含5-氟代-色氨酸,在第9位摻入丙氨酸的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物。使用Fmoc-5-氟代-dL-色氨酸進(jìn)行合成。這個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生含有5-氟代-d-色氨酸和5-氟代-L-色氨酸的肽的對(duì)映異構(gòu)混合物。合成三種不同的肽兩種肽在第4或第7位獨(dú)立地具有單個(gè)置換,和一個(gè)肽在第4和第7位含有置換。在單個(gè)置換的情況下可以產(chǎn)生S-氟代-L-色氨酸和5-氟代-d-色氨酸類(lèi)似物的混合物,而在雙置換的情況下就可能產(chǎn)生四個(gè)對(duì)映異構(gòu)體組合的混合物。每種肽混合物進(jìn)一步經(jīng)受反相HPLC以分離肽對(duì)映異構(gòu)體。對(duì)映異構(gòu)體的鑒定通過(guò)用V8蛋白酶消化肽,隨后使用MALDI分析消化的產(chǎn)品來(lái)進(jìn)行。只有當(dāng)其后是一個(gè)l-氡基酸時(shí),V8蛋白酶才在Asp殘基的C末端側(cè)切開(kāi)。質(zhì)譜法鑒定切割產(chǎn)物表明首先洗脫的1-對(duì)映異構(gòu)肽后面跟隨d-形式,這種情況下沒(méi)有檢測(cè)到切割片段。測(cè)試含5-氟代-L-色氨酸或5-氟代-d-色氦酸或兩者的所有肽的補(bǔ)體抑制活性。在兩個(gè)位置都被5-氟代-L-色氦酸置換的合成肽顯示出比Ac-V確9A(SEQIDNO:5)高2.5倍的活性(表3)。表3.合成的含5-氟代-L-色氛酸的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的補(bǔ)體抑<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>'相對(duì)于肽H-I(CVVQDWGHHRC)T-NH2(C3補(bǔ)體抑制素,SEQIDN0:1)的活性補(bǔ)體抑制試驗(yàn)(困2;表3)表明單獨(dú)第4位的5-氟代-L-色氨酸的置換致使肽活性比Ac-V4W/H9A(SEQIDNO:5)至少降低1.5倍。單獨(dú)第7位的5-氟代-L-色氨酸的置換與Ac-V^/H9A相比活性增加2.7倍。在第4和第7位5-氟代-L-色氨酸的同時(shí)置換也導(dǎo)致活性相對(duì)于Ac-V4W/H9A(SEQIDN0:5)增加2.5倍。在第4或7位,或在兩個(gè)位置5-象代-d-色氨酸的置換致使肽無(wú)活性。實(shí)施例8色氨酸介導(dǎo)的C3識(shí)別C3補(bǔ)體抑制素的熱力學(xué)基礎(chǔ)使用等溫滴定量熱法研究肽與C3的結(jié)合和研究它們的活性的熱力學(xué)基礎(chǔ)。使對(duì)于所有肽與C3的相互作用獲得的量熱數(shù)據(jù)適于化學(xué)計(jì)算接近于1的一組位點(diǎn)模式。據(jù)信這些肽與C3的結(jié)合以1:1的比例發(fā)生。由這些擬合產(chǎn)生的熱動(dòng)力參數(shù)在表4中示出。如Kd值顯然可知,在第7位含5-氟代-L-色氡酸單個(gè)置換和在第4和7位含雙置換顯示出比Ac-V確9A(SEQIDNO:5)和Ac-V4(5f-l-W)/H9A(SEQIDNO:18)類(lèi)似物更強(qiáng)的結(jié)合。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與補(bǔ)體抑制試驗(yàn)(表3)中觀察到的相對(duì)活性一致,表明存在結(jié)合-活性相關(guān)性。與C3結(jié)合的所有的肽具有負(fù)焓和正熵。這種結(jié)合是C3補(bǔ)體抑制素與C3相互作用的特征。在研究的所有肽之中,第7位置抶的Ac-V4W/W7(5f-l-W)/H9A類(lèi)似物(SEQIDN0:19)顯示出比野生型副本更高的結(jié)合焓(厶11--21.83,AAH》3.69)。與C3結(jié)合的第4位置換的Ac-V4(5f-l-W)/H9A類(lèi)似物(SEQIDNO:18)的焓是-16.69kcal/mole,顯示比其野生型副本^f氐1.45kcal/mole。第4位摻入5-氟代-色氨酸引起焓相對(duì)于這個(gè)位置是色氨酸的肽減少1.45kcal/mole(表4)。由于色氨酸和5-氟代-色氨酸之間唯一的差異是吲哚C5的氟原子,因此這種焓減少可以歸于氬被氟取代。表4.合成的含5-氟代-L-色氨酸的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物和C3相互作用的熱動(dòng)力參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>笫7位摻入5-氣代-色氨酸,焓相對(duì)于野生型増加3.69kcal/mole(表4)。不受任何特定機(jī)制的限制,據(jù)信第7位色氨酸參與利于焓的相互作用,例如氳鍵。用氟原子取代一個(gè)吲哚氫可以加強(qiáng)吲哚NH的氫鍵特性,這是由于pKa下降?;蛘?,氟形成氦鍵是它的給電子性質(zhì)的結(jié)果,如十四碳(3-氣代酪氨酰)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移醉的結(jié)構(gòu)所證明。所觀察到焓増加的另一種解釋是水分子橋接氣原子和C3上氬受體之間的相互作用,這種情況下需要形成兩個(gè)氬鍵(相當(dāng)于大約4kcal/mole能量)。這個(gè)學(xué)說(shuō)的支持來(lái)自所觀察到的笫7位置換的Ac-雨/W7(5fW)/H9A類(lèi)似物(SEQIDNO:19)相對(duì)于野生型類(lèi)似物的相互作用(表4)的熵減少,這種減少可以通過(guò)交界面上另外的水分子的結(jié)合而產(chǎn)生。在其他系統(tǒng)種已經(jīng)觀察到水介導(dǎo)的氣原于及其他氛鍵受體之間的相互作用。雙置換的類(lèi)似物與C3的結(jié)合導(dǎo)致-19.85kcal/mole的焓變,-9.35kcal/mole的熵變和-lO.5kcal/mole的自由能變化。相信在兩個(gè)位置同時(shí)摻入5-氟代-色氨酸取消了單個(gè)置換的影響。實(shí)施例9另外的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物在第4位摻入色氨酸類(lèi)似物。實(shí)施例5和6表明在C3補(bǔ)體抑制素的第4位用色氨酸置換纈氡酸使其活性增加45倍。為進(jìn)一步研究C3補(bǔ)體抑制素與C3結(jié)合過(guò)程中第4位殘基介導(dǎo)的相互作用的性質(zhì),用色氨酸類(lèi)似物和2-萘基丙氨酸置換第4位的色氨酸。使用基于ELISA的試驗(yàn)測(cè)試了第4位和第9位丙氨酸上含色氨酸類(lèi)似物的所有肽類(lèi)似物的活性。雖然用l-甲基-色氨酸(Ac-V4(l-甲基-W)/H9A(SEQIDNO:23)和2-萘基丙氨酸(Ac-V4(2-Nal)/H9A)(SEQIDN0:7)置換,活性比C3補(bǔ)體抑制素分別增加264和99倍,但是5-氟代-色氦酸(Ac-V4(5f-l-W)/W7/H9A)(SEQIDNO:18和5-甲基色氨酸(Ac-V4(5-甲基-W)/H9A)(SEQIDN0:2"的置換導(dǎo)致較低的活性;比野生型肽顯示的活性高31和67倍(表5)。圖3顯示了描繪活性的抑制曲線和表5顯示了由曲線計(jì)算的ICs。值和肽與原C3補(bǔ)體抑制素的活性相比的相對(duì)活性。圖5顯示了針對(duì)色氨酸類(lèi)似物和2-萘基丙氨酸的logP值描繪的抑制常數(shù)(ICJ。表5.C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的補(bǔ)體抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>*相對(duì)于0fH-I(CVVQDWGHHRC)T-NH2(C3補(bǔ)體抑制素,SEQIDNO:l)的活性。也使用等溫滴定量熱法研究了C3補(bǔ)體抑制素肽的結(jié)合。使對(duì)于所有肽與C3的相互作用獲得的量熱數(shù)據(jù)適于化學(xué)計(jì)算接近于1的一組位點(diǎn)模式(圖4)。這個(gè)結(jié)果提示這些肽與C3的結(jié)合以1:1的比例發(fā)生。由這些擬合產(chǎn)生的熱動(dòng)力參數(shù)在表6中示出。從Kd值顯然可知,Ac-V4(l-曱基-W)/H9A與笫4位具有單個(gè)置換的所有其他肽相比顯示出更高的結(jié)合親和力(Kd-O.015MM)。針對(duì)類(lèi)似物的logP描繪這些值表明色氨酸類(lèi)似物和2-萘基丙氨酸的結(jié)合親合力和疏水性之間存在相關(guān)性,對(duì)于每個(gè)相關(guān)性,結(jié)合親合力隨著第4位摻入的類(lèi)似物疏水性的增加而增加。這個(gè)觀察結(jié)果與logP和抑制常數(shù)之間顯示的相關(guān)性一致。表6.合成的含5-氟代-L-色氨酸的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物和C3相互作用的熱動(dòng)力參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>與C3結(jié)合的所有肽具有負(fù)焓和正熵,提示這種結(jié)合是焓驅(qū)動(dòng)的。這種結(jié)合是C3補(bǔ)體抑制素與C3相互作用的特征。然而,這些肽結(jié)合的特征是熗變低于野生型,和熵變朝著有利端變動(dòng)。囝5B顯示了logP對(duì)-TAS的圖,其表明隨著第4位摻入的類(lèi)似物的疏水性增加,熵更有利由此使得對(duì)自由能變化產(chǎn)生積極影響。在第7位摻入色氨酸類(lèi)似物。實(shí)施例7提出笫7位色氡酸與C3上殘基形成氬鍵。為進(jìn)一步研究這個(gè)可能性,用類(lèi)似于第4位取代的色氨酸類(lèi)似物取代第7位色氨酸,以闡明在這個(gè)位置由色氨酸引起的相互作用的性質(zhì)。具有5-氟代-色氨酸的置換(Ac-V4W/W7(5f+W)/H9A)(SeqIDN0:19)產(chǎn)生高活性121倍的肽。(圖3,表5)。第7位用類(lèi)似物5-甲基-色氨酸或l-甲基-色氨酸置換致使C3補(bǔ)體抑制素?zé)o活性(未顯示數(shù)據(jù))。因此,觀察到色氨酸類(lèi)似物的活性和疏水性之間無(wú)相關(guān)性。通過(guò)量熱法同時(shí)研究了不同的色氨酸7-類(lèi)似物的熱力學(xué)特性。(表6)。由于沒(méi)有檢測(cè)到在第7位含5-甲基-色氨酸或者1-甲基色氨酸的肽的結(jié)合,因此不存在結(jié)合參數(shù)。僅肽Ac-V^/W7(5f-l-W)/H9A(SEQIDN0:19)與C3結(jié)合。結(jié)合親合力是0.035uM,這高于對(duì)于在笫4位含有色氨酸類(lèi)似物的肽所觀察到的,除了肽Ac-V4(l-甲基-W)/H9A(SEQIDNO:23)。與第4位具有色氛酸類(lèi)似物的肽相比,與C3結(jié)合的Ac-兩/W7(5f-l-W)/H9A(SEQIDNO:19)具有很有利的結(jié)合焓變(△H--21.83,△△H=-3.69)和不利的熵變(-T△S=ll.56,-T△△S=2.77),提示進(jìn)一步有利的極性的非共價(jià)相互作用。該結(jié)果表明笫7位摻入5-氟代-色氦酸導(dǎo)致C3補(bǔ)體抑制素活性増加,而類(lèi)似物5-甲基-色氨酸和1-甲基-色泉酸的摻入致使C3補(bǔ)體抑制素?zé)o活性。1-甲基-色氨酸摻入時(shí)C3補(bǔ)體抑制素活性喪失支持色氨酸7的N-H介導(dǎo)的氣鍵對(duì)于C3補(bǔ)體抑制素與C3相互作用4艮重要的推論。此外,S-甲基-色氨酸摻入時(shí)C3補(bǔ)體抑制素活性完全喪失提示第7位不甚允許疏水性氨基酸。在第4和第7兩個(gè)位置摻入色氨酸類(lèi)似物。由于用1-甲基-色氨酸置換第4位色氨酸和用5-氟代-色氨酸置換第7位色氨酸產(chǎn)生活性急劇增加的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物,因此產(chǎn)生在第4和7位含置換的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物。所得肽(Ac-V4(1-甲基-W)/W7(5f-l-W)/H9A)(SEQIDN0:24)產(chǎn)生類(lèi)似于用1-甲基-色氨酸(Ac-V4(l-甲基-W)/H9A)(SEQIDNO:23)單個(gè)置換的抑制曲線(圖3,表5)。量熱器中觀察到這個(gè)肽的結(jié)合親合力(K產(chǎn)O.017)也類(lèi)似于Ac-V4(1-曱基-W)/H9A(SEQIDNO:23)。這些觀察結(jié)果提示在這些實(shí)驗(yàn)條件下,在第4位l-甲基-色氨酸存在下第7位5-氟代-色氨酸沒(méi)有作用。在第4位摻入另一個(gè)色氨酸類(lèi)似物.為進(jìn)一步研究C3補(bǔ)體抑制素與C3結(jié)合過(guò)程中,笫4位殘基介導(dǎo)的相互作用的性質(zhì),用色氦酸類(lèi)似物l-甲?;?色氨酸取代第4位的色氨酸。圖6顯示了補(bǔ)體抑制百分比vs.Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQIDNO:23)(圃形)和Ac-V4(l-甲?;?W)/H9A(SEQIDNO:25)的肽濃度的比較。如所見(jiàn),1-甲酰基-W類(lèi)似物與l-甲基-W類(lèi)似物的補(bǔ)體抑制活性基本上相同。實(shí)施例10C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的聚乙二醇化C3補(bǔ)體抑制素半衰期延長(zhǎng)對(duì)于它在慢性治療中的使用是有利的。通過(guò)聚乙二醇化,在幾種情況下已經(jīng)實(shí)現(xiàn)測(cè)試的治療性肽半衰期延長(zhǎng)(參見(jiàn)Veronese等,2001),因?yàn)镻EG具有延遲生物分子被各種機(jī)制從循環(huán)中除去的能力,包括降低腎清除率、蛋白水解和免疫原性。聚乙二醇化包括PEG聚合物與大分子,優(yōu)選與賴(lài)氨酸的伯胺的共價(jià)連接。這個(gè)實(shí)施例描述了聚乙二醇化C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物Ac-V4(l-甲基-W)/H9A-K-PEG5000(SEQIDNO:36)的制備方法,并評(píng)價(jià)了該化合物抑制補(bǔ)體激活的能力。Fmoc-NH-NHS-5000PEG購(gòu)自Nektartransformingtherapeutics,490discoveryDr,Huntsville,AL35806?;衔顰c-V4(1-甲基-W)/H9A-K-PEG5000(SEQIDNO:36)由Fmoc固相肽化學(xué)根據(jù)改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)約進(jìn)行化學(xué)合成。簡(jiǎn)言之,PEG溶于3ml二氯甲烷中,人工添加lml2MDIEA,和PEG混合5分鐘。然后將PEG轉(zhuǎn)入容器中,使之偶聯(lián)過(guò)夜。接著用20%哌啶對(duì)PEG去保護(hù)20分鐘。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行合成,為了使PEG與分子側(cè)鏈連接,賴(lài)氨酸插入該分子C末端。用ReagentD(TFA:H20:TIS:苯盼,87.5:5:2.5:5)(4mL)在25分鐘實(shí)現(xiàn)肽的最終切割,以提供期望的產(chǎn)物。然后在C18反相HPLC柱上純化肽、凍干和MALDI-TOF表征。使用實(shí)施例4描述的體外試驗(yàn)測(cè)試聚乙二醇化的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的補(bǔ)體抑制活性。如困7所示,聚乙二醇化的類(lèi)似物具有抑制補(bǔ)體激活的活性,然而,比非聚乙二酵化的類(lèi)似物Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQIDNO:23)達(dá)到相同抑制所需綴合物要多7倍。實(shí)施例11C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的白蛋白結(jié)合蛋白綴合物Dennis等(2002)鑒定了一系列具有核心序列DICLF^GaW(SEQIDNO:37)的肽,它們以高親合力特異性結(jié)合來(lái)自多個(gè)物種的血清白蛋白?;瘜W(xué)計(jì)量法測(cè)定這些肽與白蛋白以1:1結(jié)合,位點(diǎn)不同于已知的小分子結(jié)合部位。肽SA21(AcRLIEDICLPRWGCLWEDDNH2;SEQIDN0:38)當(dāng)通過(guò)靜脈內(nèi)推注注射給兔子時(shí),具有罕見(jiàn)的2.3h的長(zhǎng)半襲期,如詳細(xì)說(shuō)明書(shū)中提及,與D3H44的抗組織因子Fab融合的相關(guān)序列使Fab能夠以與SA21相似的親合力結(jié)合白蛋白,同時(shí)保留Fab結(jié)合組織因子1的能力(Nguyen等2006)。在小鼠和兔子中,與白蛋白的這種相互作用導(dǎo)致體內(nèi)清除率與野生型D3H44Fab相比降低25和58倍。在兔子中,半衰期延長(zhǎng)37倍達(dá)32.4小時(shí),和在小鼠中延長(zhǎng)26倍達(dá)10.4小時(shí),在這些動(dòng)物中達(dá)到白蛋白半衰期的25-43%。超過(guò)Fab2的這些半衰期可與聚乙二醇化的Fab分子、免疫粘附素和白蛋白融合物中所見(jiàn)的情形相匹敵。這個(gè)實(shí)施例描述了與白蛋白結(jié)合肽融合的C3補(bǔ)體抑制素類(lèi)似物的合成,和它在體外試驗(yàn)中抑制補(bǔ)體的活性?;衔?(1MeW)-ABP由Fmoc固相肽化學(xué)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)約進(jìn)行化學(xué)合成。肽的N-和C末端用乙酖基和酰胺基保護(hù)。進(jìn)一步在C18反相HPLC柱上純化肽、凍干和MALDI質(zhì)謙法T0F表征。對(duì)于環(huán)化,肽-樹(shù)脂(根據(jù)氨基酸分析0.10咖ol/g填栽)在二氣甲烷(DCM)(2mU中溶脹5分鐘、過(guò)濾和用94:1:5的DCM/TFA/TIS(5mL)251C處理3次x2分鐘,每次選擇性去保護(hù)S-Mmt保護(hù)基,除去溶劑N2壓力,用CH2C12、DMF和NMP(各5次x2分鐘,2mL)洗滌這些二(疏醇)、二(Acm)-肽-樹(shù)脂中間物、在NMP(2mL)中進(jìn)一步溶脹5分鐘,然后用含Et3N(2當(dāng)量)的NMP251C處理4小時(shí).然后用DMF和CH2Ch洗滌肽-樹(shù)脂(各5次x2分鐘,2mL)。樹(shù)脂結(jié)合形式的第一個(gè)環(huán)形成后,再次用DMF洗滌肽-樹(shù)脂(5次x2分鐘,2mL)并在DMF(2mL)中溶脹5分鐘、過(guò)濾并用含T1(tfa)3(1.5當(dāng)量)的服F-苯甲醚(化L)處理以環(huán)化第二個(gè)二硫環(huán)。251C和緩攪攪拌4小時(shí)后,用DMF除去鉈試劑(8次x2分鐘,2mL)和用CH2C12進(jìn)一步洗滌肽-樹(shù)脂(5次x2分鐘,2mL)。用ReagentD(TFA:H20:TIS:苯酚,87.5:5:2.5:5)(4mL)在25"C90分鐘完成雙環(huán)肽的最終切割,以提供期望的產(chǎn)物。生成的綴合肽(SEQIDNO:39)如下所示。Ac-ll:V(lMeW)QDWGAHRiTRLIEDli:LPRWGi:LWEDD-NH2使用實(shí)施例4描述的體外試驗(yàn)測(cè)試了白蛋白結(jié)合肽-C3補(bǔ)體抑制素的補(bǔ)體抑制活性。如圖8所示,該綴合物具有抑制補(bǔ)體激活的活性,然而,比非綴合類(lèi)似物Ac-V4(1-甲基-W)/H9A(SEQIDNO:23)達(dá)到相同量抑制所需的綴合物要多7倍。參考文獻(xiàn)BabitzkeP,andYa加fekyC.(1995)StructuralfeaturesofL-tryptophanrequitedforactivationofTRAP,thetipRNA-bindingattenuationproteinof5acf"us勵(lì)亂/5/o/.CA柳.BeeleyN.(1994)P印tidomimeticsand咖all-moleculedrugdesign:towardsinqwovedbioavailabaityandinvivostability.ZVemis胸狄Ano/.12:213"6.BeeneDL,BrandtGS,ZhongW,ZachariasNM,LesterHAandDoughertyDA.(2002)Cation-piinteractionsinligandrecognitionbyserotonergic(5-HT3A)andnicotinicacetylcholinereceptors:the咖咖lousbindingpropertiesofnicotine.歷0cAe7nirt17.41:10262-9.DennisMS,ZhangM,MengYG,KadkhodayanM,KirchhoferD,CombsD,DamicoLA.(2002)Albuminbindingasageneralstrategyforimprovingttiepharmacokineticsofproteins.J腺CA柳.277:3503543FianeAE,MollnesVMemV,HovigT,HogascnMellbyeOJ,SpruceL,MooreWT,SahuA>ai^LambrisID.(1999a)Prolongationof戰(zhàn)vivo-perfosedpigxenograftsurvivalbythecomplementinhibitorCcanpstatin.2hww//aw,尸roc.31:934-5.FianeAE,MolhwsTE,VidemV,HovigT,HogasenKMellbyeOJ,SpruceL,MoteWT,SahuA,andLamhrisJD.(1柳b)Co邁pstatinjapeptideinhibitorofC3,prolongssurvivalofexvivoper&sedpigxenografts.Jfenofrvznsp/an&z/i饑6:52~65.Fiane線VidemV,LambrisJD,GeiranOR,Sve加evigJL,andMolhwsTE.(2000)Modulationoffluid-phasecomplementactivationinhibitshyperacuteinjectioninaporcine-to-humanxenograftmodeL2hwp/a'".Proc.32:899-900.FurlongST,Du加AS,Coa1hMM,GormleyW,HubbsSJ,UoydD,MaugerRC,StringierAM,SylvesterMA,SoottCW,airiEdwardsPD.(2000)C3activationisioihibitedbyanalogsofcompstatinbut加tbyseriieproteasehihibitoisorp鄰tidylalpha-ketoheteocycles.JntmMBopAarmocotogy.48:199-212.HrubyVJ.(1993)Confo加ationalandtopographicalconsiderationsinthedesignofbiologicallyactivepeptides.丑i'opofy加er51.33:1073-82.KalliKRHsuP,FearonandDT.(1994)Therapeuticusesofrecranbinantcomplemrartproteininhibitor.Spri"gerS柳i/tJmm柳opa汰oZ.15:417-31.KatragaddaM>MorikisD,amiLambris瓜(2004)Thennodynamicstudiesontheinteractionofthethirdcomplementcomponentanditsinhibitor,compstatin.J.丑to/.C%em.279:54訴7-95.幻鄰eisJLFlowiasCAMorikisD,TsokosCG,A^yropoulosE,SpruceL,andLambrisJD.(2003)Integratedcon^putatkmalandeqperimata]approachforleadoptimizationanddesignofcompstatinvariantswithimprovedactivity.加.CA抓.Soc.125:8422-3.KozlowskiACharlesSA,andHarrisJM.(2001)DevelopmentofpegylatedinterferonsforthetreatmentofchronichepatitisC.5iVjDrwgs.15:419-29.MallikB,KatragaddaM,SpruceLA,CarafidesC,TsokosCG,MorikisD,andLambrisJD(2005)DesignandNMRCharacterizationofActiveAnalogsofCompstatinContainingNon-NaturalAminoAcids.丄CA柳.48:274-286.MorikisD,A咖-MuntN,SahuA,andLambrisJD.(l柳)SolutionstructureofCompstatin,apotentcomplementinhibitor.ProtefriScf.7;619-27.NguyenA,ReyesAE2ndZhangM,McDonaldP,WongWL,DamicoLADennisMS.(2006)Thephaxmacokiiieticsofanalbumin-bindingFab(AB.F必)canbemodulatedasafiinctionofaffinityforalbumin.尸rote切五ngDas19:291-7.Nils咖B,LarssonRHongJ,ElgueG,EkdaMKN,Sahu.A,andLambrisJD.(1998)Compstatininhibitscomplementandcelh)laractivationinwholebloodintwomodelsofextracorporealciicuUition.脅od.92:1661-7.SahuAKayBKandLambrisJD.(1996)InhibitionofhumanccHnplementbyaC3-bindingpeptideisolatedfromaphage-displayedrandompeptideKbraiy./nwj柳o,.157:884-91.SoulikaAM,KhanMM>Ha加riT,BowenFW,RichardsonBA,HackCE,SahuA,EdmundsLHJr,andLambrisJD.(2000)Inhibitionofheparin/protaminecomplex-inducedcomplementactivationbyCompstatininbaboons.CZi/t/附otm加/.96:212-21.SpruceL.,E.Argyropoulos,D.MasteUos,G.SfyroeraiandJ.D.Lambris(2002)Chomicalsynthesisofsmallcomplementprotei加andproteinmodules,/nternatfo"a,/m卿加pAarmacoZogy.2:132CM321.VeroneseFM.(2001)PeptideandproteinPEGylation:areviewofproblemsandsolutions,所onwteriais22:405-417.WangY,HuQ,MadriJA,RollinsSA,ChoderaA,andMatisLA.(1996)AmeliorationoflupuslikeautoimmunediseaseinNZB/WF1miceaftertreitnientwithablockingmonoclonalantibodyspecificforcomplementcomponentC5</Voc.Warf.4carf.<SW.t/SJ.93:8563-8.ZhaoB,HelmsLR^DesJarlaisRL,Abdel-MeguidSS,andWetzelR.(1995)Aparadigmfordrugdiscoveiyusingaconfirmationfio邁thecrystalstructureofapresentationscaffold.Waf.S<tmc"/oZ.2:1131-7.本發(fā)明不限于上面描述和舉例說(shuō)明的實(shí)施方案,而是能夠在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)進(jìn)行變化和改進(jìn)。權(quán)利要求1.一種抑制補(bǔ)體激活的化合物,包含具有下述序列的肽Xaal-Cys-Val-Xaa2-Gln-Asp-Xaa3-Gly-Xaa4-His-Arg-Cys-Xaa5(SEQIDNO26);其中Xaa1是Ile、Val、Leu、Ac-Ile、Ac-Val、Ac-Leu或包含Gly-Ile的二肽;Xaa2是Trp或Trp的類(lèi)似物,其中Trp的類(lèi)似物與Trp相比疏水特性增加,條件是,如果Xaa3是Trp,則Xaa2是Trp的類(lèi)似物;Xaa3是Trp或在其吲哚環(huán)上包含化學(xué)修飾的Trp的類(lèi)似物,其中化學(xué)修飾增加吲哚環(huán)的氫鍵能;Xaa4是His、Ala、Phe或Trp;Xaa5是L-Thr、D-Thr、Ile、Val、Gly、包含Thr-Asn或Thr-Ala的二肽、或包含Thr-Ala-Asn的三肽,其中L-Thr、D-Thr、Ile、Val、Gly或Asn中任何一個(gè)的羧基末端-OH任選被-NH2替代;并且兩個(gè)Cys殘基通過(guò)二硫鍵相連。2.權(quán)利要求1的化合物,其中Xaa2參與與C3的非極性相互作用。3.權(quán)利要求1的化合物,其中Xaa2參與與C3的非極性相互作用,和Xaa3參與與C3的氬鍵鍵合。4.權(quán)利要求l的化合物,其中Xaa3參與與C3的氫鍵鍵合。5.權(quán)利要求l的化合物,其中Xaa2的色氨酸類(lèi)似物包含鹵代色氨酸。6.權(quán)利要求5的化合物,其中卣代色氨酸是5-氟代-Z-色氦酸或6-氟代-Z-色氨酸。7.權(quán)利要求l的化合物,其中Xaa2的色氨酸類(lèi)似物在色氨酸笫5位包含低級(jí)烷氧基或低級(jí)烷基取代基。8.權(quán)利要求7的化合物,其中Xaa2的色氨酸類(lèi)似物是5-曱氧基色氨酸或5-甲基色氛酸或1-甲基色氨酸或1-甲酰基色氨酸。9.權(quán)利要求l的化合物,其中Xaa2的色氨酸類(lèi)似物在色氨酸笫1位包含低級(jí)烷?;虻图?jí)烷基取代基。10.權(quán)利要求9的化合物,其中Xaa2的色氨酸類(lèi)似物是1-甲基色氨酸或1-甲酰基色氨酸。11.權(quán)利要求1的化合物,其中Xaa3的色氨酸類(lèi)似物包含面代色氨酸。12.權(quán)利要求11的化合物,其中卣代色氛酸是5-氟代-Z-色氨酸或6-氟代-Z-色氨酸。13.權(quán)利要求l的化合物,其中Xaa4是Ala。14.權(quán)利要求l的化合物,其中Xaa2在色氨酸第l位包含低級(jí)烷?;虻图?jí)烷基取代基,Xaa3任選包含卣代色氨酸和Xaa4包含丙氡酸。15.權(quán)利要求14的化合物,其中Xaa2是l-甲基色氨酸或1-甲酰基色氨酸和Xaa3任選包含5-氟代-Z-色氨酸。16.權(quán)利要求l的化合物,包含SEQIDNOS:15-25任何序列。17.權(quán)利要求l的化合物,其包括由編碼該肽的多核苷酸表達(dá)而生產(chǎn)的肽。18.權(quán)利要求l的化合物,其中該化合物至少部分由肽合成法生產(chǎn)。19.權(quán)利要求l的化合物,包含SEQIDNOS:15-25中的任何一個(gè)。20.權(quán)利要求l的化合物,其中該化合物是聚乙二醇化的。21.權(quán)利要求20的化合物,包含SEQIDNO:36。22.權(quán)利要求1的化合物,進(jìn)一步包含延長(zhǎng)該化合物體內(nèi)保留時(shí)間的另外的肽成分。23.權(quán)利要求22的化合物,其中另外的肽成分是白蛋白結(jié)合肽。24.權(quán)利要求23的化合物,包含SEQIDN0:39。25.—種抑制補(bǔ)體激活的化合物,包含SEQIDN0:26的非肽或部分肽模擬物,其中該化合物結(jié)合C3并抑制補(bǔ)體激活,在同等試驗(yàn)條件下,其活性比包含SEQIDNO:1的肽大至少I(mǎi)OO倍。全文摘要公開(kāi)了包含能夠結(jié)合C3蛋白并抑制補(bǔ)體激活的肽和模擬肽的化合物。這些化合物與目前可獲得的化合物相比顯示出抑制補(bǔ)體激活的活性大大提高。文檔編號(hào)A61K38/08GK101400692SQ200680051817公開(kāi)日2009年4月1日申請(qǐng)日期2006年11月28日優(yōu)先權(quán)日2005年11月28日發(fā)明者J·D·蘭姆布里斯,M·卡特拉加達(dá)申請(qǐng)人:賓夕法尼亞州大學(xué)理事會(huì)
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