專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)人血清補(bǔ)體3的免疫金同步散射光譜試劑盒及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化分析技術(shù)，具體是一種檢測(cè)人血清補(bǔ)體3的免疫金同步散射光譜 試劑盒及使用方法。
背景技術(shù)：
人類(lèi)補(bǔ)體3 (complement component 3，簡(jiǎn)稱(chēng)C3)成分是補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑、替 代途徑以及甘露聚糖結(jié)合凝聚素途徑三者的交匯點(diǎn)，也是補(bǔ)體系統(tǒng)的核心。急、慢性腎小球 腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病常引起人血清補(bǔ)體減少。補(bǔ)體C3含量過(guò)低常導(dǎo) 致嚴(yán)重的化膿性感染、肺炎、腦膜炎和敗血癥等，這可能與機(jī)體抗感染能力大大降低，C3介 導(dǎo)的循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)溶解和清除功能喪失有關(guān)；而C3含量過(guò)高也會(huì)引起急性炎癥和 惡性腫瘤等病癥。因此，人體血清中C3含量的檢測(cè)，對(duì)闡明一些自身免疫性和變態(tài)性疾病 的發(fā)病機(jī)理以及臨床診斷與病情變化觀察具有重要意義。 補(bǔ)體3的測(cè)定過(guò)去多采用溶血試驗(yàn)，但靈敏度較低。近來(lái)，免疫比濁法 (immunon印helometry)、免疫擴(kuò)散法(RID)、電泳免疫擴(kuò)散法(EID)、時(shí)間分辨熒光測(cè)定法 (TrFIA)、放射免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA)、火箭免疫電泳法(RIE)、 電化學(xué)免疫傳感器技術(shù)、固體基質(zhì)室溫磷光免疫分析法(SS-RTP-IA)、高效液相色譜分析 法(HPLC)等也用于補(bǔ)體C3的測(cè)定。在這些方法中，免疫比濁法簡(jiǎn)便但靈敏度較低。RID 法簡(jiǎn)單，但靈敏度低、重復(fù)性較差且操作流程長(zhǎng)。EID法的影響因素較多，每塊板檢測(cè)樣品 較少。RIA法靈敏度較高，需要的抗血清量少，但操作過(guò)程復(fù)雜且以放射性元素做為示蹤 物，應(yīng)用受到限制。TrFIA法以鑭系元素位標(biāo)記物，靈敏度高、線(xiàn)性范圍寬，由于在近紫外 激發(fā)光譜，對(duì)生物分子的活性有影響。其檢測(cè)補(bǔ)體C3的線(xiàn)性范圍為0. 7-3650 ii g L—、 檢出限達(dá)O. liig*L—、 ELISA法需抗血清量少，檢出限1.2iig*mL—、 RIE法比RID法 縮短了檢測(cè)時(shí)間，但需經(jīng)醛化處理，在應(yīng)用過(guò)程醛化影響因素較多。電化學(xué)免疫傳感器 技術(shù)也可直接快速檢測(cè)抗原或抗體，但固定抗體的方法效果欠佳，傳感器再生性能受到 限制[16]。其中電位法的線(xiàn)性范圍為0. 12-117. 3ng mL-1 ，檢出限達(dá)0. 02ng mL-1 ;陽(yáng)極 溶出免疫法的線(xiàn)性范圍為7. 2-7330ng mL—\檢測(cè)限達(dá)7. 0ng mL—1 ;電容型免疫傳感器 的線(xiàn)性范圍在18. 2-292. 5ng mL—1 ，檢出限9. lng mL—1 ;壓電免疫傳感器的線(xiàn)性范圍 在0. 078-24. 81 ii g mL—、檢測(cè)限為0. 078 y g mL—1 。 SS-RTP-IA法有標(biāo)記法和夾心法 兩種方式，其中有標(biāo)記法用異硫氰酸曙紅(Eosin-ITC)做標(biāo)記物，CaCl2做增強(qiáng)劑檢測(cè) 補(bǔ)體C3的線(xiàn)性范圍為0. 391-12. 5ng mL—\檢測(cè)限達(dá)0. 3ng mL—1 ;夾心法的線(xiàn)性范圍為 6. 25-100ng *mL—、檢出限1. 37ng *mL—、 HPLC法檢測(cè)補(bǔ)體C3濃度范圍在12. 5_400ng *mL—1 但操作時(shí)間長(zhǎng)。目前，在眾多檢測(cè)補(bǔ)體C3的方法中，只有免疫透射比濁法有商品化的試劑 盒，該試劑盒使用簡(jiǎn)便，但是線(xiàn)性范圍窄，而且靈敏度不高，限制了其在檢測(cè)低濃度樣品中 的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏、檢出限低、檢測(cè)濃度范圍寬，不需 繁瑣步驟的檢測(cè)人血清補(bǔ)體3的免疫金同步散射光譜試劑盒及使用方法。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是 本發(fā)明利用C3和金標(biāo)羊抗人C3抗體發(fā)生特異性反應(yīng)后，膠體金發(fā)生聚集，使得體 系同步散射峰急劇增強(qiáng)，且增強(qiáng)的同步散射強(qiáng)度增強(qiáng)值與C3濃度成正比，通過(guò)測(cè)定同步散 射強(qiáng)度增強(qiáng)值，可對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)確定樣品中C3的含量。 本發(fā)明試劑盒由下述三種試劑組成，其中試劑1為為校準(zhǔn)品，含補(bǔ)體3凍干血漿蛋
白參考血清，試劑2含111. 5 164. 5mM Na2HP04、17. 5 45. 0mM擰檬酸溶液禾口 50 70g/
mL PEG6000，試劑3含金標(biāo)記羊抗人C3抗體和0. 03-0. 06g/L PEG20000。試劑3是取200. OmL濃度為58. 0 y g mL—1膠體金溶液，加入0. 2-0. 4mL 30g/L
PEG20000作穩(wěn)定劑，然后用0. 20mol L-%〇03調(diào)pH值至6. 5-8. 0。在磁力攪拌下，逐滴滴
加2. Omg的羊抗人C3抗體溶液，繼續(xù)攪拌15min制成，然后放置4t:冰箱保存。 本發(fā)明免疫金同步散射光譜試劑盒檢測(cè)人血清補(bǔ)體3的使用方法，包括如下步
驟 1、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) (1)準(zhǔn)備6支試管，各試管依次加入不同體積的試劑l，一管不加參考血清作為空 白對(duì)照管； (2)每支試管加入800 ii L試劑2，混勻;
(3)每支試管加入500 ii L試劑3，混勻; (4)每支試管加入蒸餾水定容，使每根試管溶液最終體積為3.0mL，混勻后，在超 聲波反應(yīng)器中溫育15min后，取適量于石英池中，置于熒光分光光度計(jì)上，在激發(fā)波長(zhǎng)等于 發(fā)射波長(zhǎng)的條件下同步掃描，得到體系的同步散射光譜，測(cè)定同步散射峰處的同步散射光 強(qiáng)度I，不加補(bǔ)體3作空白，測(cè)其同步散射光強(qiáng)度Ib ;最終同步散射值按下式計(jì)算最終同步 散射值A(chǔ) I = I_Ib ; (5)以濃度c與最終同步散射值A(chǔ) I繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
2、制備樣品測(cè)定體系 用步驟1的(1) (4)的方法制備樣品測(cè)定體系，并求出其AI# ;
3、樣品的最終同步散射值參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到濃度值。 本試劑盒測(cè)定的線(xiàn)性范圍為6. 0ng/mL-200ng/mL ;相關(guān)系數(shù)》0. 9909 ;檢測(cè)限為 2. Ong mL—、 在相對(duì)誤差在±5%之間時(shí)，1530倍L-酪氨酸、3846倍甘氨酸、2423倍尿素、2500 倍組氨酸、1277倍葉酸、16倍VB2、254倍IgA、8倍BSA、 154倍HSA、2307倍天冬氨酸、169倍 L-精氨酸、2077倍色氨酸、6410倍蔗糖、2154倍L_胱氨酸、354倍IgG、923倍抗壞血酸、461 倍MnS(V923倍ZnS04、138倍IgM、923倍DL-甲硫氨酸、615倍DL-色氨酸、60倍a -酸性 糖蛋白不干擾C3測(cè)定。 儲(chǔ)存與有效期試劑避光儲(chǔ)存于4t:冰箱中，可穩(wěn)定半年。 本發(fā)明試劑盒操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏、檢出限低、檢測(cè)濃度范圍寬，不需繁瑣的相分 離步驟，樣品消耗量少，僅需幾微升，適用于大多數(shù)生物樣品分析。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例 主要儀器和試劑5mL刻度試管若干，可加0 1000 y L的加樣槍一支，RF-540型 熒光分光光度計(jì)(日本島津)，SY SK8200LH型超聲波反應(yīng)器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公 司，工作頻率為59KHz)。 試劑1為為校準(zhǔn)品，含3. 0mg L—1補(bǔ)體3凍干血漿蛋白參考血清，試劑2含 145. 5mMNa2HP04和27. 25mM擰檬酸溶液和60g/mL PEG6000，試劑3含金標(biāo)記羊抗人C3抗體 和0. 04g/LPEG20000。凍干血漿蛋白參考血清(補(bǔ)體C3含量為3. 0mg L—0 。樣品人血清 由桂林市第五醫(yī)院提供，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。
測(cè)定方法包括如下步驟
1、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) (1)用7支試管，各試管依次加入6. 0ii L、25. 0ii L、50. 0ii L、100. 0ii L、150. 0ii L、
200. 0 ii L補(bǔ)體C3含量為3. Omg L—1的凍干血漿蛋白參考血清，其中第一管不加參考血清 作為空白對(duì)照管； (2)每支試管加入800 ii L試劑2，混勻；
(3)每支試管加入500 ii L試劑3，混勻; (4)每支試管加入蒸餾水定容，使每根試管溶液最終體積為3.0mL，混勻后，在超 聲波反應(yīng)器中溫育15min后，取適量于石英池中，置于熒光分光光度計(jì)上，用靈敏度為2，縱 坐標(biāo)為6，在激發(fā)波長(zhǎng)等于發(fā)射波長(zhǎng)的條件下同步掃描，得到體系的同步散射光譜，確定同 步散射測(cè)量波長(zhǎng)為560nm。測(cè)定560nm同步散射峰的同步散射光強(qiáng)度I，不加補(bǔ)體C3作空 白，測(cè)其同步散射光強(qiáng)度Ib ;最終同步散射值按下式計(jì)算最終同步散射值A(chǔ)I = I-Ib。
(5)以濃度c與最終同步散射值A(chǔ) I繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
2、制備樣品測(cè)定體系 以步驟1的(1) (4)的方法制備樣品測(cè)定體系，加入的是從醫(yī)院取到的正常人 的血清，用蒸餾水將人血清稀釋100倍，取稀釋后的樣品30. Oii L，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，并求出 其AI樣； 3、樣品的最終同步散射值參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到濃度值。 本試劑盒測(cè)定的線(xiàn)性范圍為6. 0ng/mL-200ng/mL ;相關(guān)系數(shù)^ 0. 9909 ;檢測(cè)限為 2. Ong mL—、 對(duì)比試驗(yàn)，用本檢測(cè)方法檢測(cè)正常人血清10份，檢測(cè)的結(jié)果人血清補(bǔ)體C3含量為 0. 80-1. 90g L—1與正常人的血清補(bǔ)體含量一致，在置信水平為95%時(shí)，與用透射比濁法所 得的結(jié)果基本一致，證明了本發(fā)明測(cè)定方法的可靠性。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)人血清補(bǔ)體3的免疫金同步散射光譜試劑盒，其特征是它由下述三種試劑組成，其中試劑1為為校準(zhǔn)品，含補(bǔ)體3凍干血漿蛋白參考血清，試劑2含111.5～164.5mMNa2HPO4和17.5～45.0mM檸檬酸溶液和50～70g/mL PEG6000，試劑3含金標(biāo)記羊抗人C3抗體和0.03-0.06g/L PEG20000。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍為6. 0ng/ mL-200ng/mL，相關(guān)系數(shù)^ 0. 9909，檢測(cè)限為2. 0ng mL—、
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是試劑3是取200. 0mL濃度為58. 0 y g *mL—1 膠體金溶液，加入0. 2-0. 4mL 30g/L PEG20000作穩(wěn)定劑，然后用0. 20mol *L—、C03調(diào)pH值 至6. 5-8. 0，在磁力攪拌下，逐滴滴加2. 0mg的羊抗人C3抗體溶液，繼續(xù)攪拌15min制成，然后放置4t:冰箱保存。
4. 權(quán)利要求1所述的使用方法，其特征是包括如下步驟(1) 、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)1) 準(zhǔn)備6支試管，各試管依次加入不同體積的試劑l，一管不加參考血清作為空白對(duì)照管；2) 每支試管加入800 ii L試劑2，混勻；3) 每支試管加入500 ii L試劑3，混勻；4) 每支試管加入蒸餾水定容，使每根試管溶液最終體積為3. 0mL，混勻后，在超聲波反 應(yīng)器中溫育15min后，取適量于石英池中，置于熒光分光光度計(jì)上，在激發(fā)波長(zhǎng)等于發(fā)射波 長(zhǎng)的條件下同步掃描，得到體系的同步散射光譜，測(cè)定同步散射峰處的同步散射光強(qiáng)度I， 不加補(bǔ)體3作空白，測(cè)其同步散射光強(qiáng)度Ib ;最終同步散射值按下式計(jì)算最終同步散射值△I = H"5) 以濃度c與最終同步散射值A(chǔ) I繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；(2) 、制備樣品測(cè)定體系用步驟(1)的l) 4)的方法制備樣品測(cè)定體系，并求出其AI#;(3) 、樣品的最終同步散射值參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到濃度值。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)人血清補(bǔ)體3的免疫金同步散射光譜試劑盒及使用方法，本試劑盒由下述三種試劑組成，其中試劑1為為校準(zhǔn)品，含補(bǔ)體3凍干血漿蛋白參考血清，試劑2含111.5～164.5mM Na2HPO4和17.5～45.0mM檸檬酸溶液和50～70g/mL PEG6000，試劑3含金標(biāo)記羊抗人C3抗體和0.03-0.06g/L PEG20000。使用時(shí)，先制備C3標(biāo)準(zhǔn)系列，按一定比例加入試劑1、試劑2及試劑3定容后，在超聲波反應(yīng)器中溫育15min后，用熒光分光光度計(jì)掃描同步散射光譜，測(cè)定其同步散射值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出C3含量。本發(fā)明試劑盒可以精確定量檢測(cè)補(bǔ)體3，適用于臨床和科研血清、血漿等樣品中的補(bǔ)體3分析，具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏、檢出限低、線(xiàn)性范圍寬，不需繁瑣的相分離步驟，樣品消耗量少的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101718780SQ20091011450
公開(kāi)日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者李紀(jì)順, 蔣治良, 黃文鑫 申請(qǐng)人:廣西師范大學(xué)