一種用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬藥物制劑領(lǐng)域，涉及多肽遞藥系統(tǒng)，具體涉及一種包載具有特異性抗癌活性的裝訂肽聚合物膠束制劑。本遞藥系統(tǒng)由靶向功能材料、兩親性嵌段共聚物和裝訂肽組成，通過(guò)包載可恢復(fù)抑癌蛋白p53活性的裝訂肽，將其遞送入癌細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮其抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，提高靶向抗癌效果，且與替莫唑胺聯(lián)合用藥后抗癌效果更好。本發(fā)明通過(guò)體內(nèi)外活性評(píng)價(jià)，證明了該遞藥系統(tǒng)能夠成功將裝訂肽遞送到靶部位并進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，具有明確的治療效果。
【專利說(shuō)明】
一種用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬藥物制劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多肽制劑，具體涉及一種包載具有特異性抗癌活性的裝訂肽的聚合物膠束制劑。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥依舊是威脅人類健康的頭號(hào)殺手，盡管基于放療和化療為主的常規(guī)治療手段在過(guò)去幾十年間取得了階段性的成果，但其有限的療效與嚴(yán)重的毒副作用使得探索癌癥發(fā)病機(jī)理、相關(guān)靶點(diǎn)及針對(duì)具體靶點(diǎn)與機(jī)制設(shè)計(jì)特異性藥物的努力一刻也未停止過(guò)。研究人員經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究與積累，近年來(lái)逐步明確了多個(gè)與癌癥發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的通路，伴隨著多種癌相關(guān)重要靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，為特異性抗癌藥物的研發(fā)墊定了基礎(chǔ)。
[0003]抑癌蛋白p53及其負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白MDM2和MDMX是近年來(lái)逐步闡明的一條癌發(fā)生通路，并為抗癌研究提供了一個(gè)嶄新的靶點(diǎn)。研究表明，P53基因是人類最重要的抑癌基因，由其表達(dá)產(chǎn)生的P53蛋白是其抑癌功能的具體執(zhí)行者。癌癥的發(fā)生與p53基因及蛋白有著十分重要的聯(lián)系。研究還表明，約有50%癌組織的細(xì)胞內(nèi)p53蛋白正常表達(dá)，但卻由于高表達(dá)MDM2等負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白，使得p53蛋白被結(jié)合而喪失了抑癌活性。如果能針對(duì)p53與MDM2蛋白的結(jié)合設(shè)計(jì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，則能將被結(jié)合的p53重新釋放出來(lái)而發(fā)揮其功效，從而達(dá)到抗癌的目的，這對(duì)于高表達(dá)負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白的惡性腫瘤如一些軟組織癌、腦膠質(zhì)瘤等的治療有著十分重要的意義。
[0004]近年來(lái)，在有關(guān)癌相關(guān)靶點(diǎn)的研究中，逐步由主要研究癌細(xì)胞外各類因子和細(xì)胞膜上相關(guān)受體轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞內(nèi)潛在的靶分子，而這一研究變化趨勢(shì)的形成，主要得益于分子藥劑學(xué)的興起與發(fā)展。任何針對(duì)癌細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的特異性藥物或分子實(shí)體，只有進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)才能真正發(fā)揮作用，而要達(dá)到此目標(biāo)，首先需要有效地將藥物或分子實(shí)體遞送至癌組織部位。
[0005]有研究通過(guò)鏡像噬菌體展示技術(shù)篩選得到一類針對(duì)MDM2和MDMX的多肽(PMI)，經(jīng)初步驗(yàn)證，其能結(jié)合負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白MDM2和MDMX，推測(cè)其具有潛在抑制MDM2和MDMX結(jié)合P53并恢復(fù)p53功能的抗癌活性；但所述的PMI多肽本身不具有進(jìn)細(xì)胞的功能，需要適宜的遞送系統(tǒng)將其帶入癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其抗癌活性。通過(guò)裝訂肽技術(shù)修飾PMI多肽后賦予了其穿細(xì)胞膜的能力，但是其水溶性差，在含血清環(huán)境中活性低，體內(nèi)腫瘤靶向性差。目前聚合物膠束已廣泛應(yīng)用于化療藥物、基因藥物和診斷藥物(放射性、順磁等物質(zhì))等的制劑開發(fā)中，一定粒徑聚合物膠束具有良好的被動(dòng)靶向性，通過(guò)對(duì)材料的修飾，可賦予其長(zhǎng)循環(huán)和主動(dòng)革G向等功能。
[0006]采用聚合物膠束包載可以恢復(fù)P53活性的裝訂肽，并發(fā)揮其特異性抗癌功效的研究未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外類似報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種用于抗癌的多肽聚合物膠束制劑，具體涉及一種包載具有特異性抗癌活性的裝訂肽的聚合物膠束制劑。
[0008]具體而言，本發(fā)明的用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑，其特征在于，由靶向功能材料、兩親性高分子嵌段共聚物和裝訂肽組成，其中:靶向功能材料作為聚合物膠束一個(gè)組成部分用于識(shí)別靶細(xì)胞，兩親性高分子嵌段共聚物作為聚合物膠束骨架部分用于包載和遞送裝訂肽，裝訂肽具有恢復(fù)抑癌蛋白P53活性功能，將其遞送入癌細(xì)胞內(nèi)可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)癌癥的靶向治療。
[0009]本發(fā)明中，革El向功能材料是能夠特異性結(jié)合癌細(xì)胞的革El向分子與兩親性嵌段共聚物材料偶聯(lián)成的主動(dòng)靶向復(fù)合物，其中的兩親性高分子嵌段共聚物材料選自:聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)，聚乙二醇-乳酸羥基乙酸共聚物(PEG-PLGA)，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)，聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(PEG-DPPC)等。聚乙二醇端基為活性基團(tuán)，可以與特異性結(jié)合靶細(xì)胞的靶向分子偶聯(lián)。聚乙二醇上的活性基團(tuán)主要選自于馬來(lái)酰亞胺基、巰基、酰胺基、氨基、羧基、生物素或親和素。
[0010]本發(fā)明中，能夠特異性結(jié)合癌細(xì)胞或靶細(xì)胞的靶向分子包括:特異性結(jié)合癌細(xì)胞或靶細(xì)胞小分子配體如葉酸(具備腫瘤細(xì)胞靶向親和特性)、氧化抗壞血酸(具備腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞靶向親和特性)等；多肽配體如RGD肽(是精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸保守排序的多肽分子，具備腫瘤細(xì)胞、腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向親和特性，其包括線性、環(huán)形和逆序D構(gòu)型的多肽)、LyP-1肽(是具有9個(gè)氨基酸殘基CGNKRTRGC的多肽分子，具備腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、腫瘤淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞靶向親和特性，其包括線性、環(huán)形和逆序D構(gòu)型的多肽)、CDX肽(是具有16個(gè)氨基酸殘基FKESWREARG的多肽分子，具備腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向親和特性，其包括線性多肽和逆序D構(gòu)型多肽)等，以及針對(duì)癌細(xì)胞或靶細(xì)胞表面特殊靶標(biāo)開展噬菌體展示篩選得到的多肽配基，如針對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87篩選得到的序列為VTWTPQAWFQWV的多肽配基，或SELEX技術(shù)篩選得到的核酸適體，如針對(duì)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞表面抗原PSMA篩選得到的核酸適體A10PSMA Apt等；抗體如anti_HER2等。
[0011]本發(fā)明中，遞送的裝訂肽為針對(duì)癌蛋白MDM2開展鏡像噬菌體展示技術(shù)所篩選得到的多肽或其衍生物，能夠競(jìng)爭(zhēng)性拮抗MDM2/MDMX與抑癌蛋白p53的結(jié)合，恢復(fù)p53蛋白活性。裝訂肽或其衍生物包括PMI多肽、PM1-N8A等肽，其序列為TSFAEYWN-LLSP、TSFAEYffALLSP 或 TSFAEYWALLS，裝定位點(diǎn)為 4、11 位。
[0012]本發(fā)明以聚合物膠束為裝訂肽的載體，采用成膜水化法得到載肽聚合物膠束，并經(jīng)凝膠柱分離純化，得到裝訂肽聚合物膠束制劑；通過(guò)粒徑測(cè)定儀對(duì)其粒徑進(jìn)行表征，并計(jì)算該制劑中多肽的包封率；制得本發(fā)明用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑，構(gòu)建了一種能夠?qū)⒖拱┑难b訂肽遞送到靶部位及其靶細(xì)胞內(nèi)的聚合物膠束遞藥系統(tǒng)。
[0013]本發(fā)明中，包載裝訂肽的聚合物膠束粒徑為30-200nm。通過(guò)靜脈給藥途徑能夠發(fā)揮治療癌癥的作用。
[0014]本發(fā)明通過(guò)下述步驟，以人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87為模型，對(duì)其活性進(jìn)行了體外(細(xì)胞)和體內(nèi)(皮下瘤與腦原位瘤)藥效學(xué)評(píng)價(jià)。
[0015]I)制備靶向功能材料
[0016]通過(guò)多肽的游離巰基與馬來(lái)酰亞胺活化的兩親性高分子嵌段共聚物材料反應(yīng)，如馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸、馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺實(shí)現(xiàn)膜材料的合成；
[0017]2)制備裝訂肽的聚合物膠束制劑
[0018]采用成膜水化法制備載裝訂肽的聚合物膠束，并經(jīng)凝膠柱分離純化，得到裝訂肽的聚合物膠束制劑。通過(guò)粒徑測(cè)定儀對(duì)其粒徑進(jìn)行表征，并計(jì)算該制劑中多肽的包封率；
[0019]3)裝訂肽聚合物膠束的體外抗癌活性評(píng)價(jià)
[0020]以人腦膠質(zhì)瘤U87為體外模型對(duì)裝訂肽stapled PMI聚合物膠束的抗癌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)手段為MTT法測(cè)定給藥后癌細(xì)胞生存率，繪制不同給藥濃度下的癌細(xì)胞生存率變化曲線；
[0021]4)裝訂肽聚合物膠束的抗癌特異性評(píng)價(jià)(作用機(jī)制)
[0022]以p53野生型的人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞為模型進(jìn)行裝訂肽stapled PMI聚合物膠束的抗癌機(jī)制研究，采用Western Blotting技術(shù)檢測(cè)給藥后細(xì)胞內(nèi)p53通路相關(guān)的三種重要指標(biāo)(p53、MDM2和p21)的含量變化情況；
[0023]5)裝訂肽聚合物膠束的體內(nèi)抗癌活性評(píng)價(jià)(皮下瘤)
[0024]以U87皮下移植瘤裸小鼠為模型動(dòng)物，對(duì)裝訂肽stapled PMI聚合物膠束的體內(nèi)抗癌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，繪制瘤體積相對(duì)值隨時(shí)間變化的曲線評(píng)價(jià)治療效果；
[0025]6)裝訂肽聚合物膠束的體外抗癌活性評(píng)價(jià)(腦原位瘤)
[0026]以U87腦原位瘤裸小鼠為模型動(dòng)物，對(duì)裝訂肽stapled PMI聚合物膠束的體內(nèi)抗癌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)指標(biāo)為荷瘤裸小鼠的生存時(shí)間。
[0027]結(jié)果顯示，本發(fā)明所述的制劑能特異性地殺傷p53野生型的人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，能顯著抑制U87皮下瘤的生長(zhǎng)和延長(zhǎng)U87腦原位瘤模型動(dòng)物的生存時(shí)間，提示本發(fā)明具有良好的用于癌癥治療的潛力。
[0028]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:以兩親性嵌段共聚物作為主要載體材料，將具有特異性抗癌機(jī)制的新型裝訂肽包載于聚合物膠束中，具有良好的治療癌癥的潛力。本發(fā)明利用裝訂肽策略和聚合物膠束腫瘤靶向策略，能夠有效克服生理環(huán)境下的血清穩(wěn)定性、穿細(xì)胞膜能力和腫瘤組織選擇性，可以保障多肽被遞送至腫瘤部位后，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定抗癌效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1:RGD_聚乙二醇-聚乳酸的核磁H譜表征
[0030]其中，核磁H譜顯示，與馬來(lái)酰亞胺-聚乙二醇-聚乳酸相比較，產(chǎn)物中已不含馬來(lái)酰亞胺特征峰S胺ppm)6.7，說(shuō)明反應(yīng)進(jìn)行完全，高效液相未檢測(cè)到產(chǎn)物中含有游離多肽，說(shuō)明透析較為徹底。
[0031]圖2:裝訂肽聚合物膠束制劑體外抑制癌細(xì)胞效果圖
[0032]其中，裝訂肽聚合物膠束制劑是包載裝訂肽sPMI的RGD-PEG-PLA聚合物膠束(RGD環(huán)肽修飾的主動(dòng)靶向制劑)，分別以空白載體RGD-PEG-PLA膠束、游離裝訂肽sPMI和小分子p53-MDM2抑制劑Nutlin-3作為對(duì)照，以人腦膠質(zhì)瘤U87的MTT細(xì)胞活性檢測(cè)法評(píng)價(jià)體外活性。
[0033]圖3:裝訂肽聚合物膠束制劑特異性體外抑制癌細(xì)胞機(jī)制圖
[0034]其中顯示了選用p53蛋白野生型的U87細(xì)胞，分別加入不同劑量的RGD環(huán)肽修飾的裝訂肽聚合物膠束制劑后，以游離裝訂肽sPMI和小分子p53-MDM2抑制劑Nutlin_3作為對(duì)照，通過(guò)Western Blotting技術(shù)，測(cè)定兩種細(xì)胞中p53、MDM2和p21三種蛋白含量變化的情況。
[0035]圖4:裝訂肽聚合物膠束制劑體內(nèi)抗癌效果圖(皮下瘤)
[0036]其中顯示了以皮下荷瘤(人腦膠質(zhì)瘤U87)裸鼠為體內(nèi)活性評(píng)價(jià)模型動(dòng)物，48只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為6組(η = 8)，分別為生理鹽水組，游離多肽sPMI組，包載裝訂肽sPMI的RGD-PEG-PLA聚合物膠束低劑量(4mg/kg)和高劑量組(10mg/kg)，替莫唑胺組(50mg/kg，口服)和聯(lián)合給藥組(50mg/kg替莫唑胺加10mg/kg裝訂肽聚合物膠束)，以瘤體積相對(duì)值隨時(shí)間變化的曲線評(píng)價(jià)治療效果，并比較各組與陰性對(duì)照組的差異(*:P < 0.05，具有顯著性差異:p < 0.01，具有十分顯著的差異；***:p < 0.001，具有特別顯著的差異)。
[0037]圖5顯示了裝訂肽聚合物膠束制劑體內(nèi)抗癌效果圖(腦原位瘤)，
[0038]其中，以人膠質(zhì)瘤U87的原位荷瘤裸鼠為體內(nèi)活性評(píng)價(jià)模型動(dòng)物，50只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組(η = 10)，分別為生理鹽水組，包載裝訂肽sPMI的RGD-PEG-PLA聚合物膠束(10mg/kg)，替莫卩坐胺組(50mg/kg，口服)，聯(lián)合給藥組(50mg/kg替莫卩坐胺加10mg/kg裝訂肽聚合物膠束)，低劑量替莫唑胺聯(lián)合給藥組(10mg/kg替莫唑胺加10mg/kg裝訂肽聚合物膠束)，以荷瘤裸鼠的生存時(shí)間為指標(biāo)評(píng)價(jià)治療效果。
【具體實(shí)施方式】
[0039]通過(guò)以下實(shí)施例描述將有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于如下描述范圍。
實(shí)施例1
[0040]I)制備靶向功能材料:
[0041]制備RGD-聚乙二醇-聚乳酸
[0042]通過(guò)多肽的游離巰基與Mal-PEG3400-PLA2000所含馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)膜材料的合成。具體反應(yīng)如下:10mg Mal-PEG3400-PLA2000溶于ImL甲醇，旋蒸成膜后，用ImlpH 8.0的PB緩沖液水化，分多次加入反應(yīng)，于室溫下反應(yīng)5h。收集樣品，對(duì)純水透析(透析膜截留分子量為3500)過(guò)夜，除去游離多肽，凍干后即得RGD-聚乙二醇-聚乳酸；
[0043]制備RGD-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
[0044]通過(guò)多肽的游離巰基與Mal-PEG3400_DSPE所含馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)膜材料的合成。具體反應(yīng)如下:1mg Mal-PEG3400-DSPE溶于ImL DMF，2mg多肽溶于3mL pH7.5的PBS溶液，兩者混合并超聲除氣泡后，于室溫下反應(yīng)lh。收集樣品，對(duì)純水透析(透析膜截留分子量為3500)過(guò)夜，除去游離多肽，凍干后即得RGD-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；
[0045]制備LyP-1-聚乙二醇-聚乳酸
[0046]通過(guò)多肽的游離巰基與Mal-PEG3400-PLA2000所含馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)膜材料的合成。具體反應(yīng)如下:10mg Mal-PEG3400-PLA2000溶于ImL甲醇，旋蒸成膜后，用ImlpH 8.0的PB緩沖液水化，分多次加入1.2倍摩爾量的Lyp-1多肽反應(yīng)，于室溫下反應(yīng)5h0收集樣品，對(duì)純水透析(透析膜截留分子量為3500)過(guò)夜，除去游離多肽，凍干后即得LyP-1-聚乙二醇-聚乳酸；
[0047]制備LyP-1-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
[0048]通過(guò)多肽的游離巰基與Mal-PEG3400_DSPE所含馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)膜材料的合成。具體反應(yīng)如下:1mg Mal-PEG3400-DSPE溶于ImL DMF，2mg多肽溶于3mL pH7.5的PBS溶液，兩者混合并超聲除氣泡后，于室溫下反應(yīng)lh。收集樣品，對(duì)純水透析(透析膜截留分子量為3500)過(guò)夜，除去游離多肽，凍干后即得LyP-1-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；
[0049]制備⑶X-聚乙二醇-聚乳酸
[0050]通過(guò)多肽的游離巰基與Mal-PEG3400-PLA2000所含馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)膜材料的合成。具體反應(yīng)如下:10mg Mal-PEG3400-PLA2000溶于ImL甲醇，旋蒸成膜后，用ImlpH 8.0的PB緩沖液水化，分多次加入1.2倍摩爾量的⑶X多肽反應(yīng)，于室溫下反應(yīng)5h。收集樣品，對(duì)純水透析(透析膜截留分子量為3500)過(guò)夜，除去游離多肽，凍干后即得⑶X-聚乙二醇-聚乳酸；
[0051]制備⑶X-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
[0052]通過(guò)多肽的游離巰基與Mal-PEG3400_DSPE所含馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)膜材料的合成。具體反應(yīng)如下:1mg Mal-PEG3400-DSPE溶于ImL DMF，2mg多肽溶于3mL pH7.5的PBS溶液，兩者混合并超聲除氣泡后，于室溫下反應(yīng)lh。收集樣品，對(duì)純水透析(透析膜截留分子量為3500)過(guò)夜，除去游離多肽，凍干后即得⑶X-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；
[0053]制備葉酸-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
[0054]通過(guò)乙二胺將葉酸氨基化后，與NHS-PEG3400-DSPE所含琥珀酰亞胺活化的羧基反應(yīng)實(shí)現(xiàn)膜材料的合成。具體反應(yīng)如下:1mg NHS-PEG3400-DSPE溶于ImL DMF，5mg葉酸溶于3mL pH7.5的PBS溶液，兩者混合并超聲除氣泡后，于室溫下反應(yīng)lh。收集樣品，對(duì)純水透析(透析膜截留分子量為3500)過(guò)夜，除去游離葉酸，凍干后即得葉酸-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；
[0055]2)制備裝訂肽sPMI聚合物膠束制劑
[0056]稱取90%質(zhì)量比的甲氧基封端的聚乙二醇-聚乳酸(PEG2_-PLA2_)和5%質(zhì)量比的RGD環(huán)肽-聚乙二醇-聚乳酸(RGD-PEG2_-PLA2_)作為制備聚合物膠束的材料。將上述材料和裝訂肽sPMI溶于甲醇中，其中多肽與材料的質(zhì)量比為1: 9。置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上恒壓緩慢蒸發(fā)成膜后，置于真空干燥相中過(guò)夜，除去殘留的有機(jī)溶劑。加ImL生理鹽水，37°C水化20min，G50凝膠柱分離游離多肽，得粒徑約為23nm的裝訂肽聚合物膠束制劑。經(jīng)測(cè)定，該聚合物膠束制劑對(duì)裝訂肽的包封率約為99%。
[0057]3)裝訂肽聚合物膠束制劑的體外抗癌活性評(píng)價(jià)
[0058]用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(37°C，5% C02，飽和濕度)連續(xù)培養(yǎng)，使人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87處于貼壁狀態(tài)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層培養(yǎng)U87細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸二鈉消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)，以每孔3000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積200 μ L，鋪板時(shí)留出不含細(xì)胞的空白培養(yǎng)液孔。培養(yǎng)24h后給藥；
[0059]取上述已接種U87細(xì)胞的96孔板，棄掉孔中培養(yǎng)液，更換為不同濃度梯度的培養(yǎng)液配制RGD-PEG-PLA/sPMI膠束、空載體RGD-PEG-PLA膠束、游離多肽sPMI或陽(yáng)性對(duì)照Nutlin-3 (每孔加入20 μ L)，每個(gè)濃度均設(shè)三復(fù)孔(實(shí)驗(yàn)孔)。留出三個(gè)僅加入培養(yǎng)液的孔作為對(duì)照孔。培養(yǎng)72h后，每孔均加入20每L MTT溶液(5mg/mL)，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)4h后，移除孔內(nèi)液體并每孔加入1505移DMSO，于室溫孵育15min后在檢測(cè)波長(zhǎng)490nm處測(cè)定各孔吸光度值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率:
[0060]將存活率對(duì)藥物濃度對(duì)數(shù)值作圖，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC5。)。結(jié)果顯示，RGD-PEG-PLA/sPMI膠束能有效殺傷U87細(xì)胞，其IC5。約為10.7 μ M，與陽(yáng)性對(duì)照Nutlin-3相當(dāng)(7.6 μ M)，提示該聚合物膠束制劑具有較強(qiáng)的體外抗癌潛力。
[0061]4)裝訂肽聚合物膠束制劑的體內(nèi)抗癌活性評(píng)價(jià)(皮下瘤)
[0062]U87皮下瘤模型動(dòng)物的建立:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞，每只裸小鼠接種6胞，每6個(gè)細(xì)胞(均勻分散于100分散PBS緩沖液中)。細(xì)胞接種于裸小鼠的右肩胛骨皮下。接種后每?jī)商鞙y(cè)定一次瘤的長(zhǎng)徑(Dniax)和短徑(D_)，按照下列公式計(jì)算瘤體積(V):
[0063]V= [DnaxX (Dnin)2]/2
[0064]種瘤14天后，裸小鼠皮下瘤大小達(dá)到50?120mm3時(shí)，開始進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為6組，每組8只U87皮下瘤模型裸小鼠；
[0065]實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案:生理鹽水組，游離多肽sPMI組，包載裝訂肽sPMI的RGD-PEG-PLA聚合物膠束低劑量(4mg/kg)和高劑量組(10mg/kg)，替莫唑胺組(50mg/kg，口服)和聯(lián)合給藥組(50mg/kg替莫卩坐胺+10mg/kg裝訂肽聚合物膠束)，于第I天、第3天、第5天、第7天和第9天給藥；
[0066]藥效實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行14天，首次給藥前測(cè)定瘤的長(zhǎng)徑和短徑，得瘤體積(V。)，以后每?jī)商焱瑯硬僮鞯昧鲶w積(Vd)，按Rd= V d/V。計(jì)算得到瘤體積相對(duì)值(R d)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以Rd為縱坐標(biāo)作圖，得瘤體積相對(duì)值隨時(shí)間變化曲線評(píng)價(jià)治療效果；
[0067]瘤體積相對(duì)值隨時(shí)間變化結(jié)果顯示，對(duì)比生理鹽水組，游離多肽sPMI組能輕微抑制U87皮下瘤的生長(zhǎng)(P〈0.01)，包載裝訂肽sPMI的RGD-PEG-PLA聚合物膠束低劑量(4mg/kg)和高劑量組(10mg/kg)均能顯著抑制U87皮下瘤生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)濃度依賴性，提示該聚合物膠束制劑具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗腫瘤潛力(P〈0.001)。相比單獨(dú)替莫唑胺組，裝訂肽sPMI聚合物膠束和替莫唑胺聯(lián)合給藥后，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)抑瘤效果(P〈0.001)。
[0068]5)裝訂肽聚合物膠束遞藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗癌活性評(píng)價(jià)(腦原位瘤)
[0069]U87腦原位瘤模型動(dòng)物的建立:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞，每只裸小鼠接種5 X 15個(gè)細(xì)胞(分散于5yL PBS緩沖液中)。裸小鼠麻醉后，用腦立體定位儀固定，細(xì)胞接種于腦紋狀體右部(前囟前0.6mm，側(cè)1.8mm，深3mm)；
[0070]從接種腫瘤細(xì)胞后第10天開始給藥。荷瘤裸小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只；[0071 ] 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案如下:生理鹽水組，包載裝訂肽sPMI的RGD-PEG-PLA聚合物膠束組(10mg/kg)，替莫卩坐胺組(50mg/kg，口服)，聯(lián)合給藥組(50mg/kg替莫卩坐胺+1mg/kg裝訂肽聚合物膠束)，低劑量替莫挫胺聯(lián)合給藥組(10mg/kg替莫卩坐胺+10mg/kg裝訂肽聚合物膠束)，于種瘤后第10天、第12天、第14天、第16天和第18天給藥。繪制各組Kaplan-Meier生存曲線，評(píng)價(jià)治療效果；結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，包載裝訂肽sPMI的RGD-PEG-PLA聚合物膠束組(10mg/kg)具有一定的延長(zhǎng)模型動(dòng)物的生存時(shí)間。與高劑量替莫挫胺相比(中位生存時(shí)間為59天)，聯(lián)合給藥組(50mg/kg替莫卩坐胺+10mg/kg裝訂肽聚合物膠束)，能夠顯著延長(zhǎng)模型動(dòng)物的中位生存時(shí)間(74天)；用低劑量替莫唑胺(1mg/kg)和裝訂肽聚合物膠束(10mg/kg)聯(lián)合給藥后，其中位生存時(shí)間(55天)與單獨(dú)高劑量替莫唑胺組(59天)接近，結(jié)果表明，本發(fā)明的裝訂肽聚合物膠束制劑具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗腦腫瘤潛力，且能顯著提升替莫唑胺抗腦腫瘤藥效。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑，其特征在于，由革G向功能材料、兩親性高分子嵌段共聚物和裝訂肽組成，其中:靶向功能材料作為聚合物膠束一個(gè)組成部分用于識(shí)別靶細(xì)胞，兩親性高分子嵌段共聚物作為聚合物膠束骨架部分用于包載和遞送裝訂肽； 所述的裝訂肽為具有抗癌活性的裝訂肽，所述的聚合物膠束制劑粒徑為30-200nm。2.按權(quán)利要求1所述的用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑，其特征在于，所述的靶向功能材料特異性結(jié)合靶細(xì)胞的靶向分子與兩親性高分子嵌段共聚物偶聯(lián)成的主動(dòng)靶向復(fù)合物。3.按權(quán)利要求1所述的用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑，其特征在于，所述的兩親性高分子嵌段共聚物選自:聚乙二醇-聚乳酸，聚乙二醇-乳酸羥基乙酸共聚物，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿。4.按權(quán)利要求3所述的用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑，其特征在于，所述的兩親性高分子嵌段共聚物中的聚乙二醇其端基為活性基團(tuán)，選自馬來(lái)酰亞胺基、巰基、酰胺基、氨基、羧基、生物素或親和素中的一種。5.按權(quán)利要求2所述的用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑，其特征在于，所述的特異性結(jié)合靶細(xì)胞的靶向分子是小分子配體葉酸或氧化抗壞血酸。6.按權(quán)利要求5所述的用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑，其特征在于，所述的特異性結(jié)合靶細(xì)胞的靶向分子中的多肽配體是RGD肽、LyP-1肽或CDX肽。7.按權(quán)利要求1所述的用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑，其特征在于，所述的兩親性高分子嵌段共聚物作為骨架材料用于制備聚合物膠束，選自甲氧基聚乙二醇-聚乳酸，甲氧基聚乙二醇-乳酸羥基乙酸共聚物，甲氧基聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，甲氧基聚乙二醇-二棕櫚酰磷脂酰膽堿，或多種甲氧基聚乙二醇-磷脂的混合材料。8.按權(quán)利要求1所述的用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑，其特征在于，所述的裝訂肽競(jìng)爭(zhēng)性拮抗MDM2/MDMX與抑癌蛋白p53的結(jié)合，恢復(fù)p53蛋白活性。9.按權(quán)利要求1所述的用于抗癌的裝訂肽聚合物膠束制劑，其特征在于，所述的裝訂肽選自PMI多肽及其衍生物的不同i，i+4和i，i+7裝訂位點(diǎn)后的多肽產(chǎn)物。
【文檔編號(hào)】A61K47/34GK105853355SQ201510035753
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2015年1月23日
【發(fā)明人】陸偉躍, 陸五元, 陳溪山, 占昌友, 謝操, 閆志強(qiáng)
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)