用于增加的重組蛋白產(chǎn)生的制劑和方法
【專利說明】用于增加的重組蛋白產(chǎn)生的制劑和方法
[0001]相關(guān)申請
本申請要求2013年2月 26 日提交的題為“FORMULAT1NS AND METHODS FOR INCREASEDRECOMBINANT PROTEIN PRODUCT1N”(代理人案卷號(hào) BHC125022US (BH-023/L))的美國臨時(shí)專利申請序列號(hào)61/769，402的優(yōu)先權(quán)，所述申請?jiān)诖顺鲇谒心康囊云湔w通過引用并入本文。
[0002]背景
細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可用于在包括營養(yǎng)物以促進(jìn)細(xì)胞生長的細(xì)胞培養(yǎng)基制劑中產(chǎn)生重組蛋白。實(shí)例細(xì)胞培養(yǎng)基制劑包括DMEM/F12、RPMI (例如，RPMI 1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、L-15、頂DM、McCoy氏5A培養(yǎng)基和VeroPlus SFM。
[0003]在重組蛋白的生產(chǎn)，包括商業(yè)生產(chǎn)中，期望增加重組蛋白生產(chǎn)的水平，同時(shí)保持產(chǎn)物質(zhì)量。
[0004]因此，需要增加重組蛋白生產(chǎn)而不降低產(chǎn)物的質(zhì)量的細(xì)胞培養(yǎng)基制劑和方法。
[0005]概述
在一些實(shí)施方案中，提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基制劑。所述制劑具有約3.5 g/L或更多的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內(nèi)的鈣中的至少一者。
[0006]在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，提供在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生重組蛋白的方法。所述方法包括在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞，所述細(xì)胞培養(yǎng)基具有約3.5 g/L或更多的甘露糖和重組蛋白的穩(wěn)定劑諸如約1.5 mM至約9.5 mM范圍內(nèi)的鈣中的至少一者。在某些實(shí)施方案中，所述方法導(dǎo)致重組蛋白的產(chǎn)生的增加。在某些實(shí)施方案中，所述方法導(dǎo)致重組蛋白的產(chǎn)生的增加，而不妥協(xié)產(chǎn)生的重組蛋白的質(zhì)量。
[0007]根據(jù)這些和其他實(shí)施方案提供許多其他方面。本文記載本教導(dǎo)的這些和其他特征。
[0008]附圖
技術(shù)人員會(huì)理解下文描述的附圖是僅用于說明目的。附圖不是意在以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。
[0009]圖1是說明根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案增加細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的重組蛋白產(chǎn)生的方法的流程圖。
[0010]圖2圖示顯示根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案甘露糖濃度從3克/升(“g/L”)增加至5 g/L使1L灌注生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)中的重組人因子VIII ( “rhFVIII”)滴度增加25%。
[0011]圖3圖示顯示根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案甘露糖濃度從3 g/L增加至5 g/L使15L灌注生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)中的rhFVIII滴度增加~37%。
[0012]圖4圖示顯示表明根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案對(duì)滾管(重復(fù)分批)實(shí)驗(yàn)中5毫摩爾(“mM”)氯化鈣的測試條件的rhFVIII滴度(~19%增加)的最高影響的結(jié)果。
[0013]圖5圖示顯示根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案鈣濃度從1 mM增加至5 mM使1L灌注生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)中的rhFVIII滴度增加~27%。
[0014]圖6圖示顯示根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案鈣濃度從1 mM增加至5 mM使15L灌注生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)中的rhFVIII滴度增加~29%。
[0015]圖7A-B圖示顯示根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案從對(duì)照培養(yǎng)基(含有ImM氯化鈣和3 g/L甘露糖)切換至針對(duì)兩種組分富集的培養(yǎng)基(含有5mM氯化鈣和5 g/L甘露糖)使rhFVIII滴度增加29%且效果是可逆的結(jié)果。
[0016]圖8A-B顯示根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案15L灌注生物反應(yīng)器活動(dòng)(A)和所得效價(jià)數(shù)據(jù)(B)的設(shè)計(jì)。
[0017]圖9圖示顯示根據(jù)多個(gè)實(shí)施方案操縱細(xì)胞培養(yǎng)制劑的糖含量對(duì)rhFVIII的生產(chǎn)水平的結(jié)果，顯示使用含有甘露糖的培養(yǎng)基和不含甘露糖的培養(yǎng)基的效價(jià)的平均值。
[0018]多個(gè)實(shí)施方案的描述
如所述，增加細(xì)胞培養(yǎng)基制劑中培養(yǎng)的表達(dá)蛋白的細(xì)胞的生產(chǎn)水平、而不會(huì)不利影響蛋白產(chǎn)物質(zhì)量是一種挑戰(zhàn)。根據(jù)本文描述的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，通過向細(xì)胞培養(yǎng)基提供額外的營養(yǎng)物諸如甘露糖和/或穩(wěn)定劑諸如鈣，可以生成改善的細(xì)胞培養(yǎng)基制劑。在一些實(shí)施方案中，改善的細(xì)胞培養(yǎng)基制劑可以增加使用細(xì)胞培養(yǎng)基制劑培養(yǎng)的表達(dá)蛋白的細(xì)胞的生產(chǎn)水平，而對(duì)產(chǎn)物質(zhì)量具有很少影響或沒有可檢測的影響。還提供形成和/或使用此類細(xì)胞培養(yǎng)基制劑的方法。
[0019]實(shí)例細(xì)胞培養(yǎng)基制劑
如上所述，在多個(gè)實(shí)施方案中，可以通過增加制劑中甘露糖的濃度和/或重組蛋白的穩(wěn)定劑諸如鈣的濃度或兩者而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)基制劑中重組蛋白產(chǎn)生的增加。
[0020]在一個(gè)方面，提供細(xì)胞培養(yǎng)基制劑(例如，細(xì)胞培養(yǎng)基組合物)，其包括約3.5 g/L或更多(或者，在某些實(shí)施方案中，約4 g/L、約5 g/L、約6 g/L或約7 g/L或更多)的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM或更多(或者，在某些實(shí)施方案中，以約2 mM、約3 mM、約4mM、約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM或約9.5 mM或更多)范圍內(nèi)的I丐中的至少一者。可以采用其他細(xì)胞培養(yǎng)基制劑。
[0021]在添加約3.5 g/L或更多的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內(nèi)的鈣中的至少一者之前，細(xì)胞培養(yǎng)基制劑可以是任何細(xì)胞培養(yǎng)基制劑。例如，在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基制劑可以包括合適比率諸如1:1的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基和Ham氏F-12營養(yǎng)混合物(DMEM/F12)，和約5 g/L的甘露糖和約5 mM的鈣中的至少一者。
[0022]可以采用其他細(xì)胞培養(yǎng)基制劑代替DMEM/F12諸如RPMI (例如，RPMI 1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、L-15JMDM、McCoy氏5A培養(yǎng)基和VeroPlus SFM。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基制劑用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0023]本文提供的實(shí)例細(xì)胞培養(yǎng)基制劑包括但不限于:
(a)約3.5 g/L或更多的甘露糖和小于約1.5 mM或大于約9.5 mM的|丐；
(b)小于約3.5 g/L的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內(nèi)的鈣；
(c)約4g/L至約5 g/L范圍內(nèi)的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內(nèi)的鈣中的至少一者；
(d)約5g/L的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內(nèi)的鈣中的至少一者；
(e)約4g/L至約5 g/L范圍內(nèi)的甘露糖和小于約1.5 mM或大于約9.5 mM的|丐；
(f)約5g/L的甘露糖和小于約1.5 mM或大于約9.5 mM的|丐；
(g)約3.5 g/L或更多的甘露糖和約2 mM至約5 mM范圍內(nèi)的鈣中的至少一者； (h)約3.5 g/L或更多的甘露糖和約5 mM的鈣中的至少一者；
(i)小于約3.5 g/L的甘露糖和約2 mM至約5 mM范圍內(nèi)的鈣；
(j)小于約3.5 g/L的甘露糖和約5 mM的鈣；和/或
(k) 1:1比率的DMEM/F12，和約5 g/L的甘露糖和約5 mM的鈣中的至少一者。
[0024]可以采用其他制劑。
[0025]形成/使用細(xì)胞培養(yǎng)基制劑的方法
現(xiàn)在將參考下面圖1-8描述在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生重組蛋白的方法。
[0026]圖1說明根據(jù)本文提供的某些實(shí)施方案在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生重組蛋白的方法100的流程圖。參考圖1，方法100開始于方框101，其中提供表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞。
[0027]實(shí)例表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞可以包括，例如，任何真核或原核細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞等。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。實(shí)例哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞、腎和B細(xì)胞的雜交物(HBK)細(xì)胞、人胚腎(HEK)細(xì)胞和NS0細(xì)胞。
[0028]表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞可以是產(chǎn)生任何生物蛋白產(chǎn)物的任何細(xì)胞。例如，所述細(xì)胞可以是經(jīng)工程改造以表達(dá)一種或多種重組蛋白產(chǎn)物的重組細(xì)胞；和/或表達(dá)抗體分子的重組細(xì)胞。
[0029]表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞的產(chǎn)物可以是任何蛋白產(chǎn)物，包括重組蛋白產(chǎn)物諸如凝血因子(凝血途徑中的蛋白)，包括例如因子VI1、因子VII1、因子IX和因子X。例如，表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞可以是表達(dá)因子VIII的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0030]因子VIII可以是因子VIII的變體，諸如遺傳變體，其可以通過對(duì)rFVIII基因構(gòu)建體進(jìn)行遺傳變異而生成，導(dǎo)致，例如，B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII和突變的因子VIII。因子VIII變體包括，例如，表達(dá)后修飾的因子VIII的變體，諸如，例如，聚乙二醇化的FVIII和具有共價(jià)連接的聚乙二醇(PEG)的FVIII。因子VIII變體也可以包括具有共表達(dá)結(jié)合元件的融合蛋白。
[0031 ] 在某些實(shí)施方案中，表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞的重組蛋白產(chǎn)物可以是糖蛋白。在一些實(shí)施方案中，重組蛋白是分泌的?？梢圆捎糜糜谛纬杀磉_(dá)重組蛋白的重組細(xì)胞的任何合適的來源和/或方法。
[0032]在方框102中，在細(xì)胞培養(yǎng)基制劑(即，組合物)中培養(yǎng)表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞，所述細(xì)胞培養(yǎng)基制劑(即，組合物)包括約3.5 g/L或更多的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內(nèi)的鈣中的至少一者。如本文所使用，細(xì)胞培養(yǎng)基可以包括組織或細(xì)胞培養(yǎng)液，一種或多種組織或細(xì)胞培養(yǎng)基，等。
[0033]在添加約3.5 g/L或更多的甘露糖和約1.5 mM至約9.5 mM范圍內(nèi)的鈣中的至少一者之前，細(xì)胞培養(yǎng)基制劑可以是任何細(xì)胞培養(yǎng)基制劑。例如，在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基制劑可以包括合適比率諸如1:1的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基和Ham氏F-12營養(yǎng)混合物(DMEM/F12)，和約5 g/L的甘露糖和約5 mM的鈣中的至少一者。
[0034]可以采用其他細(xì)胞培養(yǎng)基制劑代替DMEM/F12諸如RPMI (例如，RPMI 1640)、MEM、DMEM、F-12、小鼠ES細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、L-15JMDM、McCoy氏5A培養(yǎng)基和VeroPlus SFM。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基制劑用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0035]在多個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基制劑可以是基于Sigma-Aldrich Fine Chemicals(SAFC, Lenexa, Kansas)或Life Technologies (Grand Island, N.Y.)制造的市售DMEM/F12制劑且補(bǔ)充其他補(bǔ)充劑諸如鐵、普朗尼克(Pluronic) F-68或胰島素的培養(yǎng)基組合物，并且可以基本上不含其他蛋白?？梢圆捎闷渌A(chǔ)培養(yǎng)基組合物。
[0036]可