專利名稱：蛋白制劑及其制備方法
蛋白制劑及其制備方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2007年11月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/004992的優(yōu)先權(quán)利益， 該優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)援弓I并入本文。
背景技術(shù)：
藥用蛋白制劑的一個(gè)基本原理是，必須克服某些不穩(wěn)定性。蛋白的降解途徑可以 分成2個(gè)不同類別，包含化學(xué)不穩(wěn)定性和物理不穩(wěn)定性。化學(xué)不穩(wěn)定性導(dǎo)致蛋白的修飾， 這通過(guò)鍵形成或切割來(lái)實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)不穩(wěn)定性問題的實(shí)例包括脫酰胺化、外消旋化、水解、氧 化、β消除和二硫化物交換。另一方面，物理不穩(wěn)定性不會(huì)導(dǎo)致蛋白的共價(jià)變化。相反，它 們包含蛋白的更高級(jí)結(jié)構(gòu)(二級(jí)和以上)的變化。這些包括變性、向表面吸附、聚集和沉淀 (Manning 等人，Pharm. Res. 6，903 (1989))。廣泛接受的是，通過(guò)在制劑中包含其它分子，可以克服這些對(duì)藥用蛋白制劑的商 業(yè)生存力和功效具有巨大影響的不穩(wěn)定性。通過(guò)在溶液中包含與蛋白相互作用的賦形劑來(lái) 保持蛋白穩(wěn)定、可溶和不聚集，可以提高蛋白穩(wěn)定性。例如，鹽化合物和其它離子物質(zhì)是蛋 白制劑的非常常見的添加劑。通過(guò)以非特異性方式結(jié)合蛋白和增加熱穩(wěn)定性，它們輔助對(duì) 抗蛋白的變性。鹽化合物(例如，NaCl, KCl)已經(jīng)成功地用于商業(yè)胰島素制品來(lái)對(duì)抗聚集 和沉淀(上文，在911)。已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)用作制劑添加劑時(shí)，氨基酸(例如，組氨酸，精氨酸) 會(huì)減少蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變(Tian等人，Int' 1 J. Pharm. 355，20 (2007))。常用的添加劑 的其它實(shí)例包括多元醇材料(例如甘油和糖)和表面活性劑例如去污劑，可以是非離子型 (例如，吐溫(Tween)，普盧蘭尼克(Pluronic))和陰離子型(十二烷基硫酸鈉)。添加劑在 所有液體商業(yè)蛋白制劑中的幾乎普遍的流行，暗示著沒有這樣的化合物的蛋白溶液可能遇 到由不穩(wěn)定性導(dǎo)致的降解挑戰(zhàn)。蛋白制劑的基本目標(biāo)是，維持特定蛋白以它的天然的、藥學(xué)活性的形式穩(wěn)定延長(zhǎng) 的時(shí)間段，以確保藥用蛋白藥物的可接受的貯存期限。但是，維持蛋白在溶液中的穩(wěn)定性和 溶解度，是在治療劑中包含添加劑的藥物制劑的巨大挑戰(zhàn)。迄今為止，生物制劑需要其它賦 形劑來(lái)維持蛋白穩(wěn)定性。通常，液體藥物制劑含有多種穩(wěn)定性添加劑。例如，用于患者自己 施用人生長(zhǎng)激素Norditropin SimpleXx 的液體制劑含有添加劑甘露醇(一種糖醇)、組氨 酸和泊洛沙姆188 ( —種表面活性劑)來(lái)穩(wěn)定激素。藥物添加劑需要是可溶的、無(wú)毒的，并以對(duì)特定治療性蛋白提供穩(wěn)定作用的特 定濃度來(lái)使用。由于添加劑的穩(wěn)定作用是蛋白-和濃度-依賴性的，必須小心地測(cè)試考 慮用于藥物制劑的每種添加劑，以確保它不會(huì)造成不穩(wěn)定性或?qū)χ苿┑幕瘜W(xué)或物理構(gòu)成 (make-up)產(chǎn)生其它負(fù)面作用。用于穩(wěn)定化蛋白的成分可能造成儲(chǔ)存期間蛋白隨著時(shí)間的 穩(wěn)定性或蛋白隨著環(huán)境變化的穩(wěn)定性的問題。通常，如下實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)貯存期限通過(guò)以冷凍形式(例如，在-80°C )儲(chǔ)存蛋白，或通過(guò) 對(duì)蛋白進(jìn)行低壓凍干過(guò)程，即通過(guò)以低壓凍干形式儲(chǔ)存蛋白，在即將使用前需要重配步驟， 和從而在患者方便性方面產(chǎn)生顯著不利。但是，為了儲(chǔ)存而冷凍蛋白制劑可能導(dǎo)致局部高 濃度的蛋白和添加劑，這會(huì)在制劑內(nèi)產(chǎn)生局部極端的PH、降解和蛋白聚集。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，冷凍和融化過(guò)程經(jīng)常影響蛋白穩(wěn)定性，這意味著即使以冷凍形式儲(chǔ)存藥物蛋 白也會(huì)伴有由冷凍和融化步驟導(dǎo)致的穩(wěn)定性喪失。另外，低壓凍干的第一個(gè)工藝步驟包含 冷凍，這可能不利地影響蛋白穩(wěn)定性。在工業(yè)場(chǎng)合，在藥品生產(chǎn)(保持(holding)步驟，儲(chǔ) 存，再冷凍和再融化來(lái)增加藥物產(chǎn)品填充_完工的時(shí)限和批次大小彈性)和隨后的藥物產(chǎn) 品填充-完工(低壓凍干)的過(guò)程中，可能對(duì)藥物蛋白進(jìn)行重復(fù)的冷凍-融化處理。眾所 周知，遇到蛋白不穩(wěn)定性現(xiàn)象的風(fēng)險(xiǎn)隨著藥物蛋白遇到的冷凍_融化循環(huán)數(shù)目的增加而增 加，達(dá)到在重復(fù)的冷凍_融化過(guò)程中維持蛋白穩(wěn)定性的制劑條件是一項(xiàng)挑戰(zhàn)性的任務(wù)。在 生物藥物工業(yè)中存在下述需要，即可以不產(chǎn)生不希望的制劑性質(zhì)、特別是PH梯度、滲透性、 密度或蛋白或賦形劑濃度地冷凍和融化的制劑?；诘鞍椎乃幬锂a(chǎn)品經(jīng)常需要為了治療功效而配制成高濃度。高度濃縮的蛋白 制劑希望用于治療用途，因?yàn)樗鼈兡軐?shí)現(xiàn)更小體積的劑量，限制患者不適，且其包裝和儲(chǔ) 存更經(jīng)濟(jì)。但是，高蛋白濃度制劑的開發(fā)存在許多挑戰(zhàn)，包括生產(chǎn)挑戰(zhàn)、穩(wěn)定性挑戰(zhàn)、分析 挑戰(zhàn)、和尤其對(duì)于治療蛋白而言的遞送挑戰(zhàn)。例如，蛋白的聚集、不溶性和降解的困難，通 常隨著制劑中蛋白濃度的升高而增加(評(píng)論參見Shire，S.J.等人.J.Pharm.Sci.，93， 1390(2004))。添加劑可能造成以前沒有觀察到的不利作用，其在更低的添加劑或蛋白濃 度，提供有益作用。高濃度蛋白制劑的生產(chǎn)可能導(dǎo)致乳色、聚集和沉淀的顯著問題。除了可 能發(fā)生非天然蛋白聚集和微粒形成、可逆的自聯(lián)的可能性以外，可能導(dǎo)致增加的粘度或其 它性質(zhì)，使注射遞送復(fù)雜化。高粘度也可能使通過(guò)過(guò)濾方法生產(chǎn)高蛋白濃度復(fù)雜化。因而，藥用蛋白制劑通常小心地平衡成分和濃度來(lái)增加蛋白穩(wěn)定性和治療需求， 同時(shí)限制任何不利的副作用。生物制劑應(yīng)當(dāng)包括穩(wěn)定的蛋白(甚至在高濃度)和特定量的 賦形劑，減少潛在的治療并發(fā)癥、儲(chǔ)存問題和總成本。隨著蛋白和其它生物大分子作為藥物分子獲得更多關(guān)注，用于遞送這樣的分子的 制劑變成一個(gè)重要的問題。盡管用于治療用途的蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)取得革命性進(jìn)展，這些 試劑在身體中的有效且方便的遞送仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)，這歸因于它們固有的理化和生物 性質(zhì)，包括較差的跨生物膜滲透，大分子量，短血漿半衰期，自聯(lián)，物理和化學(xué)不穩(wěn)定性，聚 集，吸附和免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明指向下述令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即在水中配制的蛋白在長(zhǎng)期液體儲(chǔ)存或其它處 理步驟(例如冷凍/融化和低壓凍干)過(guò)程中會(huì)維持溶解度以及穩(wěn)定性，甚至在高濃度時(shí)。本發(fā)明涉及包含水和蛋白的蛋白水制劑的方法和組合物，其中所述蛋白是穩(wěn)定 的，不需要其它試劑。具體地，本發(fā)明的方法和組合物是基于滲濾處理，其中使用水作為滲 濾介質(zhì)，滲濾含有目標(biāo)蛋白的第一溶液。該過(guò)程的進(jìn)行，使得與水存在至少確定體積的交 換，例如5倍體積交換。通過(guò)執(zhí)行本發(fā)明的方法，得到的水制劑具有與起始蛋白溶液相比顯 著降低的賦形劑總百分比。例如，發(fā)現(xiàn)水制劑與起始蛋白溶液相比減少了 95-99%賦形劑。 盡管賦形劑減少，蛋白保持可溶，且保持它的生物活性，甚至在高濃度時(shí)。在一個(gè)方面，本發(fā) 明的方法產(chǎn)生這樣的組合物，其包含增加濃度的蛋白，同時(shí)減少其它組分，例如離子型賦形 劑。這樣，水制劑中蛋白的流體動(dòng)力學(xué)直徑比標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中 的相同蛋白更小。
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本發(fā)明的制劑與標(biāo)準(zhǔn)的緩沖制劑相比具有許多優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)方面，所述水制劑包 含高蛋白濃度，例如50-200mg/mL或更多。在本發(fā)明的制劑中可以包含所有大小的蛋白，甚 至在提高的濃度。盡管蛋白是高濃度，所述制劑具有極微小的聚集，且可以使用各種方法和 形式來(lái)儲(chǔ)存，例如冷凍，而沒有高蛋白制劑可能預(yù)見到的有害作用。本發(fā)明的制劑不需要在 常規(guī)制劑中用于穩(wěn)定溶液中的蛋白的賦形劑，例如，表面活性劑和緩沖系統(tǒng)。作為低水平 離子型賦形劑的結(jié)果，本發(fā)明的水制劑具有低電導(dǎo)率，例如，小于2mS/cm。本發(fā)明的方法和 組合物也會(huì)提供具有低重量摩爾滲透壓濃度的蛋白水制劑，例如，不大于30m0Smol/kg。另 外，本文所述的制劑勝過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的制劑，因?yàn)樗鼈兙哂薪档偷拿庖咴?，這是由于缺少蛋白穩(wěn) 定化所需的其它試劑。本發(fā)明的方法和組合物可以用于提供包含水和任意類型的目標(biāo)蛋白的水制劑。在 一個(gè)方面，本發(fā)明的方法和組合物用于大蛋白，包括大于47kDa的蛋白?？贵w和其片段，包 括用于體內(nèi)和體外目的的那些，是可以用于本發(fā)明的方法和組合物中的蛋白的另一個(gè)實(shí) 例。此外，制備蛋白和肽制劑必需的多步驟純化和濃縮過(guò)程經(jīng)常在組合物中引入變異 性，使得制劑的精確組成可能隨批次而異。聯(lián)邦規(guī)程要求藥物組成在它們的制劑中高度一 致，無(wú)論生產(chǎn)位置或批號(hào)。本發(fā)明的方法可以用于建立在水中配制的蛋白溶液，以精確量向 其加回緩沖劑和賦形劑，以建立具有精確濃度的緩沖劑和/或賦形劑的蛋白制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含蛋白和水的水制劑，其中所述制劑具有某 些特征，例如，但不限于，低電導(dǎo)率，例如，小于約2. 5mS/cm的電導(dǎo)率，至少約10μ g/mL的蛋 白濃度，不超過(guò)約30m0Smol/kg的重量摩爾滲透壓濃度，和/或所述蛋白具有大于約47kDa 的分子量(Mw)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑具有提高的穩(wěn)定性，例如，但不限于，液體 形式長(zhǎng)時(shí)間(例如，至少約3個(gè)月或至少約12個(gè)月)的穩(wěn)定性或經(jīng)過(guò)至少一個(gè)冷凍/融化 循環(huán)(如果不是更多個(gè)冷凍/融化循環(huán))的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑能以選自冷 凍、低壓凍干或噴霧干燥的形式穩(wěn)定至少約3個(gè)月。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的制劑中包含的蛋白可以具有最小的大小，包括，例 如，大于約47kDa的Mw,大于約57kDa的Mw，大于約IOOkDa的Mw，大于約150kDa的Mw，大于 約200kDa的Mw，或大于約250kDa的Mw。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑具有低電導(dǎo)率，包括，例如，小于約2. 5mS/cm的 電導(dǎo)率，小于約2mS/cm的電導(dǎo)率，小于約1. 5mS/cm的電導(dǎo)率，小于約lmS/cm的電導(dǎo)率，或 小于約0. 5mS/cm的電導(dǎo)率。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的制劑中包含的蛋白具有給定的濃度，包括，例如， 至少約lmg/mL的濃度，至少約10mg/mL，至少約50mg/mL，至少約100mg/mL，至少約150mg/ mL,至少約200mg/mL，或大于約200mg/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑具有不超過(guò)約15m0Smol/kg的重量摩爾滲透壓 濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含水和給定濃度的蛋白的水制劑，其中所述 蛋白具有這樣的流體動(dòng)力學(xué)直徑(Dh)，它比給定濃度的緩沖溶液中的蛋白的Dh小至少約 50%。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白的Dh比給定濃度的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的蛋白的Dh小 至少約50% ；蛋白的Dh比給定濃度的PBS中的蛋白的Dh小至少約60% ；蛋白的Dh比給定
9濃度的PBS中的蛋白的Dh小至少約70%。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含蛋白的水制劑，所述蛋白例如，但不限于， 抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述蛋白具有小于約5μπι的流體動(dòng)力學(xué)直徑(Dh)。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述蛋白具有小于約3μπι的Dh。任意蛋白可以用于本發(fā)明的方法和組合物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含 治療蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含抗體或其抗原結(jié)合片段?？梢园诒景l(fā)明 的方法和組合物中的抗體或抗原結(jié)合片段的類型包括、但不限于，嵌合抗體，人抗體，人化 抗體和結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段是抗-TNFa，例如但 不限于阿達(dá)木單抗或golimumab或抗-IL-12抗體，例如但不限于J695。另外，本發(fā)明的制 劑也可以包含至少兩種不同類型的蛋白，例如，阿達(dá)木單抗和J695。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑還可以包含非可離子化賦形劑。非可離 子化賦形劑的實(shí)例包括、但不限于，糖醇或多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)，非離子型表面 活性劑(例如，聚山梨醇酯80，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯40，聚山梨醇酯60)，和/或糖 (例如，蔗糖)?？梢栽诒景l(fā)明的制劑中另外包含的非可離子化賦形劑的其它非限制性實(shí)例 包括、但不限于，非_海藻糖，棉子糖，和麥芽糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑不包含選自下述的試劑張力調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定劑，表面 活性劑，抗氧化劑，冷凍保護(hù)劑，填充劑，凍干保護(hù)劑，堿性組分和酸性組分。本發(fā)明的制劑可以適用于任意用途，包括體外和體內(nèi)用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本 發(fā)明的制劑適合通過(guò)下述給藥模式施用給受試者，包括，但不限于，皮下的，靜脈內(nèi)的，吸入 的，皮內(nèi)的，透過(guò)皮膚的，腹膜內(nèi)的，和肌肉內(nèi)的給藥。本發(fā)明的制劑可以用于治療受試者的 病癥。本發(fā)明也包含可以用于遞送本發(fā)明的制劑的裝置。這樣的裝置的實(shí)例包括、但不 限于，注射器，筆，植入物，無(wú)針注射裝置，吸入裝置，和貼劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑是藥物制劑。本發(fā)明也提供了制備包含蛋白和水的水制劑的方法，該方法包含，提供在第一溶 液中的蛋白，使用水作為滲濾介質(zhì)，對(duì)第一溶液進(jìn)行滲濾，直到已經(jīng)實(shí)現(xiàn)與水至少5倍體積 交換，從而制備水制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，在得到的制劑中的蛋白保留它的生物活性。本發(fā)明另外提供了制備蛋白的水制劑的方法，該方法包含，提供在第一溶液中的 蛋白，使用水作為滲濾介質(zhì)，對(duì)第一溶液進(jìn)行滲濾，直到已經(jīng)實(shí)現(xiàn)與水至少5倍體積交換， 從而制備滲濾過(guò)的蛋白溶液；濃縮滲濾過(guò)的蛋白溶液，從而制備蛋白的水制劑。在一個(gè)實(shí)施 方案中，在得到的制劑中的蛋白保留它的生物活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)離心，濃縮滲濾過(guò)的蛋白溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述滲濾介質(zhì)由水組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，用水對(duì)所述第一溶液進(jìn)行滲濾，直到實(shí)現(xiàn)大于5倍體積交換 的體積交換。在一個(gè)實(shí)施方案中，用水對(duì)所述第一溶液進(jìn)行滲濾，直到實(shí)現(xiàn)至少約6倍體積 交換。在一個(gè)實(shí)施方案中，用水對(duì)所述第一溶液進(jìn)行滲濾，直到實(shí)現(xiàn)至少約7倍體積交換。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述水制劑中的賦形劑終濃度比第一溶液小至少約95 %。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述水制劑中的賦形劑終濃度比第一溶液小至少約99 %。在一個(gè)實(shí)施方案中，從哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)得到第一蛋白溶液，且已經(jīng)純化，以
10去除宿主細(xì)胞蛋白(HCPs)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包含，向水制劑添加賦形劑。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了阿達(dá)木單抗參照標(biāo)準(zhǔn)品AFP04C (底線)、阿達(dá)木單抗DS(DF/UF處理前 (中線)和處理后(頂線)的藥品)的SEC色譜圖。圖2顯示了向DF/UF-處理過(guò)的阿達(dá)木單抗單體加入賦形劑化合物后，山梨醇(非 可離子化賦形劑)和NaCl (可離子化賦形劑)濃度對(duì)阿達(dá)木單抗單體的流體動(dòng)力學(xué)直徑 (Dh)的影響。圖3顯示了 J695參照標(biāo)準(zhǔn)品(下圖)和pH調(diào)節(jié)至pH 4. 4的J695DS (上圖)的 IEC圖譜。圖4顯示了 pH 4. 7的用Mi 11 i_Q水DF/UF后的J695 (上圖)和pH調(diào)節(jié)至pH 4. 4 的DF/UF之前的J695DS (下面曲線)的IEC圖譜。圖5用圖形描述了流體動(dòng)力學(xué)直徑(ζ-平均值)和阿達(dá)木單抗?jié)舛?溶于WFI) 的關(guān)系。X 使用1. IrnPas作為假定的樣品粘度，用SOP測(cè)定，y 使用1. 9mPas作為假定的 樣品粘度，用SOP測(cè)定。圖6用圖形描述了流體動(dòng)力學(xué)直徑(峰單體)和阿達(dá)木單抗?jié)舛?溶于WFI)的 關(guān)系。X 使用1. IrnPas作為假定的樣品粘度，用SOP測(cè)定，y 使用1. 9mPas作為假定的樣 品粘度，用SOP測(cè)定。圖7用圖形描述了流體動(dòng)力學(xué)直徑(ζ-平均值)和J695濃度(溶于WFI)的關(guān)系。 X 使用1. ImPas作為假定的樣品粘度，用SOP測(cè)定，y 使用1. 9mPas作為假定的樣品粘度， 用SOP測(cè)定。圖8用圖形描述了流體動(dòng)力學(xué)直徑(峰單體)和J695濃度(溶于WFI)的關(guān)系。 X 使用1. ImPas作為假定的樣品粘度，用SOP測(cè)定，y 使用1. 9mPas作為假定的樣品粘度， 用SOP測(cè)定。圖9顯示了依賴于注射用水中阿達(dá)木單抗?jié)舛鹊陌⑦_(dá)木單抗的賴氨酸0、1和2的 總和]。圖10顯示了依賴于注射用水中J695濃度的J695的峰1_7的總和]。圖11顯示了依賴于注射用水中J695濃度的J695的酸性峰的總和]。圖12顯示了依賴于注射用水(WFI)中J695濃度的J695的堿性峰的總和]。圖13顯示了在實(shí)施例12中進(jìn)行的滲析的效率，顯示出組分的減少導(dǎo)致的制劑的 重量摩爾滲透壓濃度和電導(dǎo)率(BDS，74mg/ml，IOml樣品體積，SpectraPor7 MWCO 10k)。圖14顯示了滲析的阿達(dá)木單抗本體溶液的PH水平的穩(wěn)定性。顯示出在相對(duì)于 去離子水滲析(1 1，000，000)之前和之后的pH水平(BDS，74mg/ml，10ml樣品體積， SpectraPor7 MWCO10k)。圖15顯示了冷凍融化后250mg/ml和200mg/ml低離子型阿達(dá)木單抗溶液的瓶子
圖譜密度數(shù)據(jù)。圖16顯示了冷凍融化后250mg/ml和200mg/ml低離子型阿達(dá)木單抗溶液的瓶子 圖譜PH數(shù)據(jù)。圖17顯示了冷凍融化后250mg/ml和200mg/ml低離子型阿達(dá)木單抗溶液的瓶子圖譜濃度數(shù)據(jù)。圖18顯示了冷凍融化后250mg/ml和200mg/ml低離子型阿達(dá)木單抗溶液的瓶子
圖譜重量摩爾滲透壓濃度數(shù)據(jù)。圖19顯示了冷凍融化后250mg/ml和200mg/ml低離子型阿達(dá)木單抗溶液的瓶子
圖譜電導(dǎo)率數(shù)據(jù)。圖20顯示了在DF/UF后在2-8°C儲(chǔ)存8. 5個(gè)月(下面曲線)或在DF/UF后在_80°C 儲(chǔ)存4. 5個(gè)月(上面曲線)的低離子型阿達(dá)木單抗(在圖20中稱作D2E7)溶液的SEC分 析。圖21顯示了在冷凍-融化程序之前(TO)和在4次冷凍-融化的每一次之后(Tl， T2，T3和T4)在不同溶液和在水中配制的單克隆抗體1D4. 7的穩(wěn)定性。圖22顯示了在冷凍-融化程序之前(TO)和在4次冷凍-融化的每一次之后(Tl， T2，T3和T4)在水中和用不同緩沖劑配制的單克隆抗體13C5. 5的穩(wěn)定性?？瞻?WFI對(duì) 照樣品。圖23顯示了在冷凍-融化程序之前(TO)和在4次冷凍-融化的每一次之后(Tl， T2，T3和Τ4)在水中和添加不同賦形劑配制的單克隆抗體13C5. 5的穩(wěn)定性?？瞻?WFI對(duì) 照樣品。圖24顯示了阿達(dá)木單抗?jié)舛?WFI制劑)和溶液ρΗ對(duì)溶液粘度的影響。圖25顯示了不同濃度和ρΗ值的阿達(dá)木單抗溶液(WFI制劑)的濁度數(shù)據(jù)。圖26顯示了不同PH值和濃度的阿達(dá)木單抗溶液(WFI制劑)的流體動(dòng)力學(xué)直徑 (Dh)數(shù)據(jù)。圖27顯示了不同濃度的阿達(dá)木單抗在ρΗ5水溶液中的按強(qiáng)度的大小分布圖(Dh測(cè)
量)O圖28顯示了 lOOmg/mL阿達(dá)木單抗在不同ρΗ水平的水中的按強(qiáng)度的大小分布。圖29也顯示了 100mg/mL阿達(dá)木單抗在不同ρΗ水平的水中的按強(qiáng)度的大小分布。圖30顯示了水中阿達(dá)木單抗的單體含量(SEC)。圖31顯示了水中阿達(dá)木單抗的聚集體含量(SEC)。圖32顯示了作為溶液溫度的函數(shù)的2種J695溶液(WFI制劑)的粘度。圖33用圖形描述了在許多不同制劑的重復(fù)冷凍/融化(f/t)循環(huán)過(guò)程中通過(guò)在 顯微鏡下才能看得見的顆粒(> 1 μ m)測(cè)量的1D4. 7抗體穩(wěn)定性。圖34用圖形描述了在許多不同制劑的重復(fù)冷凍/融化(f/t)循環(huán)過(guò)程中通過(guò)在 顯微鏡下才能看得見的顆粒(> 10 μ m)測(cè)量的13C5. 5抗體穩(wěn)定性。圖35用圖形描述了在許多不同制劑的重復(fù)冷凍/融化(f/t)循環(huán)過(guò)程中通過(guò)在 顯微鏡下才能看得見的顆粒(> 1 μ m)測(cè)量的13C5. 5抗體穩(wěn)定性。圖36用圖形描述了在許多不同制劑的重復(fù)冷凍/融化(f/t)循環(huán)過(guò)程中通過(guò)在 顯微鏡下才能看得見的顆粒(> 1 μ m)測(cè)量的7C6抗體穩(wěn)定性。發(fā)明詳述I.定義為了更容易地理解本發(fā)明，首先定義一些術(shù)語(yǔ)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"酸性組分"是指具有酸性pH(即小于7. 0)的試劑，包括溶液。酸性組分的實(shí)例包括磷酸，鹽酸，醋酸，檸檬酸，草酸，琥珀酸，酒石酸，乳酸，蘋果酸，羥乙酸 和富馬酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的水制劑不包含酸性組分。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗氧化劑“意在表示會(huì)抑制氧化并從而用于預(yù)防氧化過(guò)程對(duì) 制品的破壞的試劑。這樣的化合物包括，作為實(shí)例且不限于，丙酮，硫酸氫鈉，抗壞血酸，抗 壞血酸棕櫚酸酯，檸檬酸，丁基化的羥基茴香醚，丁基化的羥基甲苯，氫化亞磷酸，單硫代甘 油，沒食子酸丙酯，蛋氨酸，抗壞血酸鈉，檸檬酸鈉，硫化鈉，亞硫酸鈉，亞硫酸氫鈉，甲醛合 次硫酸氫鈉，巰基乙酸，偏亞硫酸氫鈉，EDTA(乙二胺四乙酸鹽)，三胺五乙酸和本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員已知的其它抗氧化劑。術(shù)語(yǔ)"水制劑"是指其中溶劑是水的溶液。本文使用的術(shù)語(yǔ)"堿性組分"是指堿性(即PH大于7. 0)的試劑。堿性組分的實(shí) 例包括氫氧化鉀(KOH)和氫氧化鈉(NaOH)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"填充劑"意在表示用于增加可重配的固體的體積和/或在制 備過(guò)程中輔助控制制劑的性質(zhì)的化合物。這樣的化合物包括，作為實(shí)例且不限于，葡聚糖， 海藻糖，蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮，乳糖，肌醇，山梨醇，二甲基亞砜，甘油，白蛋白，乳糖醛酸 鈣，和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它填充劑。本文使用的術(shù)語(yǔ)"電導(dǎo)率"是指水溶液在兩個(gè)電極之間傳導(dǎo)電流的能力。一般而 言，導(dǎo)電性或比導(dǎo)電率是物質(zhì)的傳導(dǎo)電流的度量。在溶液中，電流通過(guò)離子運(yùn)輸來(lái)流動(dòng)。因 此，隨著水溶液中存在的離子數(shù)量的增加，溶液會(huì)具有更高的電導(dǎo)率。電導(dǎo)率的度量單位 是mmhos(mS/cm)，可以使用出售的電導(dǎo)率計(jì)量器來(lái)測(cè)量，例如，購(gòu)自O(shè)rionResearch，Inc. (Beverly,MA)0通過(guò)改變其中的離子濃度，可以改變?nèi)芤旱碾妼?dǎo)率。例如，可以改變?nèi)芤褐?離子型賦形劑的濃度，以便實(shí)現(xiàn)希望的電導(dǎo)率。本文使用的術(shù)語(yǔ)“冷凍保護(hù)劑“概括地包括為蛋白提供對(duì)抗冷凍誘發(fā)的應(yīng)激的 穩(wěn)定性的試劑。冷凍保護(hù)劑的實(shí)例包括多元醇例如甘露醇，且包括糖例如蔗糖，以及包括表 面活性劑例如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或聚乙二醇，等。冷凍保護(hù)劑也有助于制劑的張力。本文使用的術(shù)語(yǔ)"超濾"或"UF"是指其中對(duì)溶液或懸浮液進(jìn)行半透膜處理的 任意技術(shù)，所述半透膜截留下大分子并允許溶劑和小溶質(zhì)分子穿過(guò)。超濾可以用于增加溶 液或懸浮液中大分子的濃度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，超濾用于增加蛋白在水中的濃度。本文使用的術(shù)語(yǔ)"滲濾"或"DF"用于指一類專門的過(guò)濾，其中用溶劑稀釋滲余 物，并再次過(guò)濾，以降低可溶的滲透物組分的濃度。滲濾可以導(dǎo)致或不導(dǎo)致截留組分(包 括，例如，蛋白)的濃度的增加。例如，在連續(xù)滲濾中，以與產(chǎn)生濾液相同的速率將溶劑連續(xù) 加入滲余物。在該情況下，滲余物體積和截留組分的濃度在過(guò)程中不變。另一方面，在不連 續(xù)的或序貫的稀釋滲濾中，在超濾步驟之后是向滲余物側(cè)加入溶劑；如果加入滲余物側(cè)的 溶劑的體積不等于或大于產(chǎn)生的濾液的體積，則截留組分會(huì)具有高濃度。滲濾可以用于改 變大分子溶液或懸浮液的PH、離子強(qiáng)度、鹽組成、緩沖液組成或其它性質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"滲濾/超濾"或"DF/UF"是指序貫或同時(shí)完成超濾和/或滲 濾的任意過(guò)程、技術(shù)或技術(shù)組合。本文使用的術(shù)語(yǔ)"滲濾步驟"是指在滲濾處理中總體積交換。術(shù)語(yǔ)"賦形劑"是指可以加入制劑中來(lái)提供希望的稠度(例如，改變?nèi)莘e性質(zhì))、 提高穩(wěn)定性和/或調(diào)節(jié)重量摩爾滲透壓濃度的試劑。常用的賦形劑的實(shí)例包括、但不限于，
13糖，多元醇，氨基酸，表面活性劑，和聚合物。在本文中可互換使用的術(shù)語(yǔ)"離子型賦形劑" 或"可離子化賦形劑"是指具有凈電荷的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，離子型賦形劑在某些 制劑條件(例如PH)下具有凈電荷。離子型賦形劑的實(shí)例包括、但不限于，組氨酸，精氨酸， 和氯化鈉。在本文中可互換使用的術(shù)語(yǔ)"非離子型賦形劑"或"非可離子化賦形劑"是指 不具有凈電荷的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，非離子型賦形劑在某些制劑條件(例如PH)下 不具有凈電荷。非離子型賦形劑的實(shí)例包括、但不限于，糖(例如，蔗糖)，糖醇(例如，甘露 醇)，和非離子型表面活性劑(例如，聚山梨醇酯80)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"第一蛋白溶液"或"第一溶液"是指用于本發(fā)明的方法中的 起始蛋白溶液或原料，即滲濾進(jìn)水的起始蛋白溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一蛋白溶液包含 離子型賦形劑、非離子型賦形劑和/或緩沖系統(tǒng)。術(shù)語(yǔ)顆粒的"流體動(dòng)力學(xué)直徑"或"Dh"是指具有水的密度和與顆粒相同的速 度的球的直徑。因而，本文使用的術(shù)語(yǔ)"蛋白的流體動(dòng)力學(xué)直徑"是指使用動(dòng)態(tài)光散射 (DLS)測(cè)得的溶液中蛋白的大小。DLS-測(cè)量?jī)x器會(huì)以固定的散射角測(cè)量從溶液中的蛋白散 射的光的強(qiáng)度的時(shí)間依賴性波動(dòng)。從強(qiáng)度的時(shí)間依賴性波動(dòng)的強(qiáng)度自相關(guān)函數(shù)確定蛋白 Dh。使用DLS儀器軟件處理散射強(qiáng)度數(shù)據(jù)，以確定散射分子(即蛋白樣本)的流體動(dòng)力學(xué) 直徑的值和尺寸分布。本文使用的術(shù)語(yǔ)"凍干保護(hù)劑"包括在干燥或冷凍干燥過(guò)程中去除水時(shí)為蛋白 提供穩(wěn)定性的試劑，例如，通過(guò)維持蛋白的適當(dāng)構(gòu)象。凍干保護(hù)劑的實(shí)例包括糖，尤其二糖 或三糖。冷凍保護(hù)劑也可以提供凍干保護(hù)劑效應(yīng)。當(dāng)提及組合物例如水制劑時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)"藥物"可以用于治療疾病或病癥。術(shù)語(yǔ)"蛋白"意在包括這樣的氨基酸序列，其鏈長(zhǎng)度足以產(chǎn)生更高水平的二級(jí)和 /或三級(jí)和/或四級(jí)結(jié)構(gòu)。這是為了區(qū)別于不具有這種結(jié)構(gòu)的"肽"或其它小分子量藥物。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文使用的蛋白具有至少約47kD的分子量。在本文使用的定義中包含 的蛋白的實(shí)例包括治療蛋白?！爸委熁钚缘牡鞍?或"治療蛋白"是指可以用于治療目的 (即用于治療受試者的病癥)的蛋白。應(yīng)當(dāng)指出，盡管治療蛋白可以用于治療目的，本發(fā)明 不限于這樣的用途，因?yàn)樗龅鞍滓部梢杂糜隗w外研究。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療蛋 白是融合蛋白或抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物包含 至少兩種不同的蛋白，它們定義為具有不同氨基酸序列的兩種蛋白。其它不同的蛋白不包 括蛋白的降解產(chǎn)物。本文使用的短語(yǔ)"將蛋白溶于水"是指蛋白制劑，其中將蛋白溶于已經(jīng)通過(guò)DF/ UF處理減少其中小分子(例如，緩沖劑，賦形劑，鹽，表面活性劑)的數(shù)量的水溶液。盡管通 過(guò)DF/UF處理不能在絕對(duì)意義上完全消除小分子，通過(guò)應(yīng)用DF/UF可實(shí)現(xiàn)的理論上的賦形 劑減少足以排它地主要在水中建立蛋白制劑。例如，以連續(xù)模式DF/UF方法使用6體積交 換，理論上的賦形劑減少是 99. 8% (ci = e_x，其中ci是起始賦形劑濃度，χ是體積交換 數(shù)目)。術(shù)語(yǔ)"藥物制劑"是指這樣的制品，其形式允許活性成分的生物活性有效、且因 此可以施用給受試者用于治療用途?！胺€(wěn)定的"制劑是這樣的制劑，其中的蛋白在儲(chǔ)存后基本上保留它的物理穩(wěn)定性
14和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性。用于測(cè)量蛋白穩(wěn)定性的各種分析技術(shù)可從本領(lǐng)域獲 知，評(píng)論見，例如，P 印 tide and ProteinDrug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed. ,Marcel Dekker, Inc. , NewYork, N. Y. , Pubs. (1991)禾口 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10 29-90(1993)。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)溶液中單體蛋白的百分比，降解的(例如，破碎的) 和/或聚集的蛋白的低百分比，確定蛋白的穩(wěn)定性。例如，包含穩(wěn)定蛋白的水制劑可以包括 至少95%單體蛋白?；蛘?，本發(fā)明的水制劑可以包括不超過(guò)5%聚集體和/或降解的蛋白。術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定劑"是指提高或另外地增強(qiáng)穩(wěn)定性的賦形劑。穩(wěn)定劑包括、但不限于， α -硫辛酸，α -生育酚，抗壞血酸棕櫚酸酯，苯甲醇，生物素，重亞硫酸鹽，硼，丁基化的羥 基茴香醚(BHA)，丁基化的羥基甲苯(BHT)，抗壞血酸和它的酯，類胡蘿卜素，檸檬酸鈣，乙 ?；?L-肉堿，螯合劑，軟骨素，鉻，檸檬酸，輔酶Q-10，半胱氨酸，半胱氨酸鹽酸鹽，3-去氫 莽草酸(DHS)，EDTA(乙二胺四乙酸；乙二胺四乙酸二鈉)，硫酸亞鐵，葉酸，富馬酸，沒食子 酸烷基酯，大蒜，葡糖胺，葡萄籽提取物，gugul，鎂，蘋果酸，偏亞硫酸氫鹽，N-乙?；腚装?酸，煙酸，煙酰胺，蕁麻根，鳥氨酸，沒食子酸丙酯，pycnogenol，沙巴棕，硒，亞硫酸氫鈉，偏 重亞硫酸鈉，亞硫酸鈉，亞硫酸鉀，酒石酸，硫代硫酸鹽，硫代甘油，硫代山梨醇，生育酚和它 們的酯，例如，生育酚醋酸酯，生育酚琥珀酸酯，tocotrienal, d_ α -生育酚醋酸酯，維生素 A和它的酯，維生素B和它的酯，維生素C和它的酯，維生素D和它的酯，維生素E和它的酯， 例如，維生素E醋酸酯，鋅，和它們的組合。術(shù)語(yǔ)"表面活性劑"概括地包括這樣的試劑，它們保護(hù)蛋白免受空氣/溶液界面 誘發(fā)的應(yīng)激和溶液/表面誘發(fā)的應(yīng)激。例如表面活性劑可以保護(hù)蛋白免于聚集。合適的 表面活性劑可以包括，例如，聚山梨醇酯，聚氧乙烯烷基醚例如Brij 35. RTM.或泊洛沙姆 例如吐溫20，吐溫80或泊洛沙姆188。優(yōu)選的去污劑是泊洛沙姆，例如，泊洛沙姆188，泊 洛沙姆407 ；聚氧乙烯烷基醚，例如Brij 35. RTM.，克列莫佛(Cremophor)Α25, Sympatens ALM/230 ；和聚山梨醇酯/吐溫，例如，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80，和泊洛沙姆，例如，泊 洛沙姆188，和吐溫，例如，吐溫20和吐溫80。本文使用的術(shù)語(yǔ)"張力調(diào)節(jié)劑"意在表示可以用于調(diào)節(jié)液體制劑的張力的一種 或復(fù)數(shù)種化合物。合適的張力調(diào)節(jié)劑包括甘油，乳糖，甘露醇，右旋糖，氯化鈉，硫酸鎂，氯化 鎂，硫酸鈉，山梨醇，海藻糖，蔗糖，棉子糖，麥芽糖和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它物質(zhì)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，液體制劑的張力接近血液或血漿的張力。術(shù)語(yǔ)"水"意在表示已經(jīng)純化(通常通過(guò)蒸餾或反滲透)去除污染物的水，在本 文中也指"純水"。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法和組合物中使用的水不含 有賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，水包括適合施用給受試者的無(wú)菌水。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 水意在包括注射用水(WFI)。在一個(gè)實(shí)施方案中，水是指蒸餾水或適用于體外試驗(yàn)的水。在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，僅使用水作為滲濾介質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行滲濾。本文使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"包括完整抗體和其任意抗原結(jié)合片段(即"抗原結(jié)合 部分")或單鏈?！翱贵w"是指包含通過(guò)二硫鍵相互連接的至少2個(gè)重(H)鏈和2個(gè)輕(L) 鏈的糖蛋白或其抗原結(jié)合部分。每個(gè)重鏈包含一個(gè)重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為Vh)和一 個(gè)重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，CH1，CH2和CH3。每個(gè)輕鏈包含一個(gè)輕鏈可變 區(qū)(在本文中縮寫為VJ和一個(gè)輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL。Vh和八區(qū) 域可以進(jìn)一步細(xì)分成稱作互補(bǔ)性守的區(qū)域中。每個(gè)Vh和\由3個(gè)CDR和4個(gè)FR組成，它們按照下述次序從氨基端向羧基 端排列=FRl，CDRl，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用 的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，所述因子包 括免疫系統(tǒng)的不同細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。本文使用的術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分"(或簡(jiǎn)稱"抗體部分")是指抗體的一 個(gè)或更多個(gè)片段，其保留特異性地結(jié)合抗原(例如，TNFa，IL_12)的能力。已經(jīng)證實(shí)，抗體 的抗原結(jié)合功能可以由全長(zhǎng)抗體的片段來(lái)實(shí)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"所包含的結(jié) 合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由\、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab' )2 片段，包含在鉸鏈區(qū)通過(guò)二硫橋連接的2個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由Vh和Cm結(jié)構(gòu)域 組成的Fd片段；(iv)由抗體的單個(gè)臂的\和Vh結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(v) dAb片段(Ward 等人，(1989)Nature341 544-546)，它由Vh或八結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)分離的互補(bǔ)性決定區(qū) (CDR)。此外，盡管Fv片段的2個(gè)結(jié)構(gòu)域\和Vh由分開的基因編碼，使用重組方法，可以通 過(guò)合成的連接物使它們結(jié)合，將它們制成單個(gè)蛋白鏈，其中\(zhòng)和Vh區(qū)域配對(duì)，形成單價(jià)分子 (稱作單鏈 Fv(scFv)；參見例如，Bird 等人(1988) Science 242 :423_426 ；和 Huston 等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 =5879-5883)。這樣的單鏈抗體也包含在術(shù)語(yǔ)抗體的" 抗原結(jié)合部分"中。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，得到這些抗體片段，并以與完整 抗體相同的方式，篩選片段的效用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段選自Fab，F(xiàn)d， Fd'，單鏈 Fv (scFv)，scFva,和結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)。更進(jìn)一步，抗體或其抗原結(jié)合部分可以是更大的免疫粘附分子的一部分，所述更 大的免疫吸附分子由抗體或抗體部分與一個(gè)或更多個(gè)其它蛋白或肽的共價(jià)或非共價(jià)締 合來(lái)形成。這些其它蛋白或肽可以具有下述功能，即允許純化抗體或其抗原結(jié)合部分或 允許它們彼此或與其它分子締合。因而，這樣的免疫粘附分子的實(shí)例包括使用抗生蛋白 鏈菌素核心區(qū)來(lái)制備四聚體單鏈可變片段(scFv)分子(Kipriyanov等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6 :93_101)和使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和C-末端聚組氨 酸標(biāo)簽來(lái)制備二價(jià)和生物素化的scFv分子(Kipriyanov等人(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058)。使用常規(guī)技術(shù)，例如分別用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗體，可以從完整 抗體制備抗體部分，例如Fab和F(ab' )2片段。此外，使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)，可以得到 抗體、抗體部分和免疫粘附分子。當(dāng)它們屬于形成同源對(duì)或組的結(jié)構(gòu)家族或源自這樣的家族且保留該特征時(shí)，2個(gè) 抗體結(jié)構(gòu)域是"互補(bǔ)的"。例如，抗體的Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域是互補(bǔ)的；2個(gè)Vh結(jié)構(gòu)域不 是互補(bǔ)的，2個(gè)\結(jié)構(gòu)域不是互補(bǔ)的。在免疫球蛋白超家族的其它成員中可以發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)結(jié) 構(gòu)域，例如T-細(xì)胞受體的V α和νβ (或γ和δ)結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)域"是指折疊的蛋白結(jié)構(gòu)，其獨(dú)立于蛋白的其它部分地保留它的三級(jí) 結(jié)構(gòu)。一般而言，結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)蛋白的獨(dú)立的功能性質(zhì)，且在許多情況下，可以添加、去除或轉(zhuǎn) 移至其它蛋白，而不喪失蛋白的剩余部分和/或結(jié)構(gòu)域的功能。單個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域是指 折疊的多肽結(jié)構(gòu)域，其包含抗體可變結(jié)構(gòu)域的序列特征。因此，它包括完整的抗體可變結(jié)構(gòu) 域和修飾的可變結(jié)構(gòu)域，例如其中一個(gè)或更多個(gè)環(huán)被替換為不是抗體可變結(jié)構(gòu)域特征性的 序列，或已經(jīng)截短的或包含N-或C-末端延伸的抗體可變結(jié)構(gòu)域，以及至少部分地保留全長(zhǎng) 結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性和特異性的折疊的可變結(jié)構(gòu)域片段。
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可以組合本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域，形成一組結(jié)構(gòu)域；例如，可以組合互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域，例 如\結(jié)構(gòu)域可以與Vh結(jié)構(gòu)域組合。也可以組合非互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域。可以以許多方式組合結(jié)構(gòu) 域，包含通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)方式連接結(jié)構(gòu)域?！?dAb"或"結(jié)構(gòu)域抗體"是指特異性地結(jié)合抗原的單個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域(Vh或 Vl)多肽。本文使用的術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合區(qū)"或"抗原結(jié)合部位"是指抗體分子的部分或其 抗原結(jié)合部分，它含有與抗原相互作用的氨基酸殘基，且賦予抗體對(duì)抗原的特異性和親和 力。
術(shù)語(yǔ)"表位"意在指能在一個(gè)或更多個(gè)抗體的抗原結(jié)合區(qū)被抗體識(shí)別和結(jié)合的 任意分子的部分。在本發(fā)明的上下文中，第一和第二"表位"理解為不同的且不被單個(gè)單 特異性抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合的表位。短語(yǔ)"重組抗體"是指通過(guò)重組方式制備的、表達(dá)的、建立的或分離的抗體，例如 使用轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體，從重組的、組合的抗體文庫(kù)分離的抗體， 從人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)分離的抗體(參見例如，Taylor等人 (1992)Nucl. AcidsRes. 20 =6287-6295)或通過(guò)任意其它方式制備、表達(dá)、建立或分離的抗 體，所述其它方式包括將特定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)剪接到 其它DNA序列。重組抗體的實(shí)例包括嵌合的、⑶R-移植的和人化的抗體。術(shù)語(yǔ)〃人抗體〃是指具有與例如Kabat等人(參見Kabat，等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版,U. S. Department of Health and Human Services,NIH公開號(hào)91-3242)所述的人種系免疫球蛋白序列相對(duì)應(yīng)的或源自它們的可變 區(qū)和恒定區(qū)的抗體。但是，本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的 氨基酸殘基(例如，通過(guò)隨機(jī)的或位點(diǎn)特異性的體外誘變或通過(guò)體內(nèi)體細(xì)胞突變引入的突 變)，例如在⑶Rs和尤其⑶R3中。本發(fā)明的重組人抗體具有可變區(qū)，也可以包含恒定區(qū)域，它們?cè)醋匀朔N系免疫球 蛋白序列(參見 Kabat 等人(1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest, 第 5 版，U. S. D^artment of Healthand Human Services，NIH
發(fā)明者A·巴特, H-J·克洛司, K·卡樂塔, M·泰斯寇普, W·福侖賀夫 申請(qǐng)人:雅培制藥有限公司