Alk基因重排檢測探針、試劑盒以及方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及醫(yī)學和生物技術，具體的是涉及ALK基因重排 檢測探針、試劑盒以及方法。
【背景技術】
[0002] ALK基因編碼的間變性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase, ALK)首先發(fā)現(xiàn) 于間變性大細胞淋巴瘤中，是靶向治療的重要靶標之一。ALK基因位于2號染色體上（位置 為2p23)，長度為728kb，全長cDNA含有29個外顯子，全長ALK蛋白含有1620個氨基酸，分 子量為177千道爾頓（kDa)，254個氨基酸激酶結構域由1123至1376位氨基酸殘基組成，在 此之前是一個由氨基酸組成的短跨膜區(qū)。ALK基因重排的斷裂點位于外顯子19和20之間， ALK基因發(fā)生重排后多具有生物學功能，其表達產物為嵌合酪氨酸激酶，通過Coiled Coil 結構域形成多聚體，引起組成性的ALK激活，ALK信號可通過激活RAS-MEK-ERK，JAK3-STAT3 和PI3K-AKT等下游信號通路持續(xù)地促進細胞增殖，導致腫瘤的產生和轉移。
[0003] 臨床研究表明，針對ALK基因開發(fā)的靶向藥物克唑替尼，對于ALK基因重排陽性 的NSCLC患者，表現(xiàn)出顯著的治療活性，并可延長患者的生存期。目前，克唑替尼已獲得國 家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA)的批準，在中國用于治療間變性淋巴瘤激酶（ALK)陽性的 NSCLC患者。因此，與克唑替尼治療配套的ALK基因重排檢測具有明確的臨床意義與檢測必 要性。
[0004] 常用的ALK基因重排檢測方法分為以下三種：熒光原位雜交（FISH)技術、免疫組 織化學（IHC)和基于PCR的方法（包括qRT-PCR、RACE-PCR或特異性RT-PCR聯(lián)合測序技 術）。但上述技術尚存在一些不足，如熒光原位雜交探針主要使用人工染色體制備，由于在 人工染色體中重復序列在整個基因組中不斷出現(xiàn)，從而導致非特異性的熒光信號，大大降 低了 FISH檢測的特異性和靈敏度；常規(guī)IHC的陽性標準判定尚未統(tǒng)一；RT-PCR法檢測ALK 融合基因雖然快速、簡便易行、能同時明確ALK已知的融合變體的類型，但無法檢測未知的 融合型是其最大的不足之處。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是ALK基因重排檢測試劑盒，該檢測試劑盒可用于高特異性和 高準確性檢測ALK基因重排的情況。
[0006] 實現(xiàn)上述目的的技術方案如下：
[0007] ALK基因重排檢測試劑盒，包括有標記熒光染料的、針對斷裂點上游的第一組探針 和針對斷裂點下游的第二組探針，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中 的至少一條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少一條探 針；上述兩組探針所標記的熒光染料顏色不一樣。
[0008] 在其中一個實施例中，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少五條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少五條探針。
[0009] 在其中一個實施例中，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少八條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少八條探針。
[0010] 在其中一個實施例中，所述第一組探針為SEQ ID NO. 41 - SEQ ID NO. 50,所述第 二組探針為 SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60。
[0011] 在其中一個實施例中，所述SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50依次分別由以下引物擴 增制備得到：SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20。
[0012] 在其中一個實施例中，所述SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60依次分別由以下引物擴 增制備得到：SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 和 SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33 和 SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35 和 SEQ ID NO. 36、 SEQ ID NO. 37 和 SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO. 39 和 SEQ ID NO. 40。
[0013] 本發(fā)明的另一目的是提供一種ALK基因重排檢測探針。
[0014] 實現(xiàn)上述目的技術方案如下：
[0015] ALK基因重排檢測探針，針對斷裂點上游的第一組探針和針對斷裂點下游的第二 組探針，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41 - SEQ ID NO. 50中的至少一條探針，所述第 二組探針為選自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少一條探針。
[0016] 在其中一個實施例中，所述第一組探針為選自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少五條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少五條探針。
[0017] 本發(fā)明的另一目的是提供一種ALK基因重排檢測方法。
[0018] 實現(xiàn)上述目的的技術方案如下。
[0019] 一種ALK基因重排檢測方法，包括
[0020] 待檢測樣品切片預處理；
[0021] 利用上述ALK基因重排檢測試劑盒進行雜交檢測；
[0022] 復染后在顯微鏡下觀察熒光信號。
[0023] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0024] 1.本發(fā)明所提供的ALK基因重排檢測試劑盒的檢測結果與Cytocell公司產品 ALK檢測產品的吻合率高達100%。
[0025] 2.本發(fā)明制備的檢測ALK基因重排的FISH探針，不含有重復序列，能夠避免交叉 反應，與染色體中ALK目標檢測片段進行識別雜交，具有準確性高，特異性好、及假陽性