檢測水稻高粒重等位基因的特異性pcr分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水稻育種中的檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是檢測水稻粒重QTL qTGWl.2a^WqTGWl.上密陽46高千粒重等位基因的8個(gè)特異性PCR標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，世界人口的增長速率高于糧食增產(chǎn)速率，食物短缺已成為全球性安全問題。水稻作為世界上一半人口的主食，提高其產(chǎn)量對解決糧食安全問題具有重大意義。水稻的增產(chǎn)在經(jīng)歷了矮桿化和雜種優(yōu)勢利用之后，一直處于緩慢增長狀態(tài)，近30年我國水稻新品種產(chǎn)量年提高幅度僅為1_2%，其中部分類型甚至低于1%。在該緩慢增產(chǎn)階段，千粒重對產(chǎn)量提高發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。因此，在水稻新品種的選育過程中，千粒重的高低是育種家們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。高千粒重品種的培育常將需改良的品種和高千粒重的材料進(jìn)行雜交而獲得，千粒重的測定需等種子完全成熟后測量較為精確，且選育過程中待測樣本數(shù)量龐大，阻礙了育種進(jìn)程以及加大育種成本。隨著分子標(biāo)記的快速發(fā)展，借助分子標(biāo)記輔助選擇，利用合適的分子標(biāo)記能在水稻全生育期鑒定對千粒重起增效作用的等位基因在受體品種中的導(dǎo)入，從而從后代中選育出高千粒重的水稻品種。目前，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)已經(jīng)在水稻抗病性，抗蟲性以及耐鹽等性狀廣泛應(yīng)用。
[0003]申請人前期在水稻第I染色體上定位到3個(gè)控制水稻千粒重的QTUWang L-L, etal.Dissect1n of qTGWl.2 to three QTLs for grain weight and grain size in rice(Oryza sativa L.).Euphytica, DOI 10.1007/sl0681-014-1237_7)。在這 3 個(gè)QTL 區(qū)間，來源于水稻品種密陽46的等位基因均具有提高千粒重的作用，而定位精度則以qTGWl.2a和qTGWl.2b為高。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上，根據(jù)水稻品種密陽46和珍汕97的重測序結(jié)果，針對qTGWl.2am qTGWl.所在區(qū)間進(jìn)行序列比對，設(shè)計(jì)序標(biāo)位(STS)標(biāo)記，并從中挑選出可特異性鑒定密陽46等位基因的標(biāo)記。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記對水稻粒重QTL qTGWl.2a^qTGWl.上密陽46增效等位基因的檢測具有普遍應(yīng)用價(jià)值，可以廣泛地應(yīng)用于qTGWl.2a和qTGWl.上密陽46增效等位基因的轉(zhuǎn)育研究中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了檢測qTGWl.為和qTGWl.上密陽46高千粒重等位基因的特異性分子標(biāo)記8個(gè)，其中，檢測qTGWl.為的7個(gè)，檢測qTGWl.%的I個(gè)。
[0005]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:根據(jù)密陽46和珍汕97的重測序結(jié)果，對qTGWl.2a$\
在區(qū)間及其緊密連鎖區(qū)間的序列進(jìn)行比對，根據(jù)插入和缺失情況，在該區(qū)段設(shè)計(jì)了 12個(gè)STS標(biāo)記，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定驗(yàn)證，篩選出8個(gè)在兩個(gè)品種中具有多態(tài)性的標(biāo)記。
[0006]用于檢測qTGWl.為上密陽46高千粒重等位基因的標(biāo)記有7個(gè)，分別命名為Wn32837、Wn32886、Wn32893、Wn33185、Wn33186、Wn33304b 和 Wn33252，具體序列如下:
Wn32837的上游引物序列為5’ - CGTCCTGCGTTTCGACATGACT-3’，所述核苷酸序列為SEQID NO:1所示的核苷酸序列； Wn32837的下游引物序列為5’ - TATTTCTACCACTCCAAGCACCA-3’，所述核苷酸序列為SEQID NO:2所示的核苷酸序列；
Wn32886的上游引物序列為5’ - CGTGTTACTAACCCAGTCAACTCAGG-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
Wn32886的下游引物序列為5’ - CAATAGTAGCAGCTAAATTGGCGTTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
Wn32893的上游引物序列為5’ - TTCCGATTTTGTTTTCTTGGTCCC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
Wn32893的下游引物序列為5’ - GCCGCACATTTATTACCTTAATCCTG-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；
Wn33185的上游引物序列為5’- GGAGGATAACGCAAGCAAACTTGA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:7的所示核苷酸序列；
Wn33185的下游引物序列為5’ - CCATAGCTTGTAAAAGACAGTGCC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDN0:8所示的核苷酸序列；
Wn33186的上游引物序列為5’- AGTTAGTGCAGCAATCTACGTCCT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:9的所示核苷酸序列；
Wn33186的下游引物序列為5’ - AGCTCCTCCAGTGACGATACGG-3’，所述核苷酸序列為SEQIDNO: 10所示的核苷酸序列；
Wn33304b的上游引物序列為5’- AAGCAACATAACTTATTCTACTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 11的所示核苷酸序列；
Wn33304b的下游引物序列為5’ - ACGACATCCACTTCGCACC-3’，所述核苷酸序列為SEQIDNO: 12所示的核苷酸序列；
Wn33252的上游引物序列為5’- GCATGTATCAAAGATTCGATGAGA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 13的所示核苷酸序列；
Wn33252的下游引物序列為5’ - TGAAAACTCATGGCTACGCT-3’，所述核苷酸序列為SEQIDNO: 14所示的核苷酸序列。
[0007]用于檢測qTGWl.上密陽46高千粒重等位基因的標(biāo)記有I個(gè)，命名為Wn34526，具體序列如下:
Wn34526的上游引物序列為5’- TCATCATCTGTTCGTGGGTT-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 15的所示核苷酸序列；
Wn34526的下游引物序列為5’ - TTGAAATATAAACTCTATACAATCTGCT-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 16所示的核苷酸序列。
[0008]8個(gè)STS標(biāo)記的PCR擴(kuò)增體系一致。擴(kuò)增體系為，Tris-HCL (pH 8.8)33.5 mM,(NH4)2SO4 8.0 mM,MgCl2 1.5 mM, TWEEN-20 0.05%, dNTPs 0.2 mM，上、下游引物各3.3 ng/μ?，Ti^DNA聚合酶2.0單位，模版DNA 50 ng ;PCR反應(yīng)條件除退火溫度外其它一致，預(yù)變性溫度94°C 2分鐘；變性溫度94°C 45秒、退火溫度50-55°C (Wn33815、Wn33252和Wn34526為50°C，其余5個(gè)標(biāo)記皆為55°C ) 45秒、72°C I分鐘，30個(gè)循環(huán)；72°C 8分鐘。
【附圖說明】
[0009]圖1 STS標(biāo)記Wn32886的檢測結(jié)果。
[0010]M:分子量對照；P1:珍汕97 ；P2:密陽46 ；1~16:待測樣品圖2兩套近等基因系兩地種植的千粒重分布。
[0011]A.2014年春海南陵水為
B.2014年春海南陵水qTGWl.2b
C.2014年夏浙江富陽776￥7.為
D.2014年夏浙江富陽光。
【具體實(shí)施方式】
[0012]以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0013]實(shí)施例1水稻千粒重QTL qTGWl.2a熱上密陽46特異性分子標(biāo)記的開發(fā)
利用序列比對軟件DNASTAR MegAlign模塊(Lasergene)對QTL定位群體的親本珍汕97和密陽46在千粒重QTL qTGWl.為和qTGWl.%所在區(qū)間的堿基序列進(jìn)行比對，根據(jù)2個(gè)品種在比對中表現(xiàn)出的插入或缺失位點(diǎn)，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 7.0開發(fā)了 12個(gè)分別用于檢測qTGWl.2am qTGWl.增效等位基因密陽46特異片段的STS標(biāo)記。通過下述步驟鑒定這些開發(fā)的標(biāo)記是否在珍汕97和密陽46之間存在特異性，且在分離群體中是否能準(zhǔn)確的鑒定出攜帶密陽46等位基因。本發(fā)明以STS標(biāo)記Wn32886為例詳細(xì)介紹檢測方法:
1.DNA微量提取