專利名稱：一種檢測TEL-AML1融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的熒光定量PCR技術(shù)，特別涉及一種檢測TEL-AMLl融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒。
背景技術(shù)：
TEL-AMLl融合基因是兒童白血病常見的融合基因，由其所致的白血病占兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia, ALL) 20% 25%,由 t (12; 21) (pl3;q22) 形成，即位于12號染色體上的TEL (Translocation Ets Leukemia)螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)域融合到位于21號染色體上AMLl (Acute Myeloid Leukemia I)的DNA結(jié)合和激活區(qū)域而成。其見于12-28%的B系A(chǔ)LL，但僅見于B前體細(xì)胞ALL(BCP-ALL)，未見于成熟B-ALL及 T-ALL。TEL-AMLl融合基因在成人中的檢出率只有2°/Γ4%，兒童ALL多發(fā)生在f 10歲，其中 Γ5歲患者占76. 2%ο
TEL基因易位導(dǎo)致其下游的⑶-KNIB基因不能編碼周期素依賴激酶抑制蛋白P27， 細(xì)胞從Gl期進(jìn)入S期，增殖能力增加，白血病細(xì)胞過度生長。異常的TEL-AMLl融合蛋白也可通過Runt同源結(jié)構(gòu)域與野生型AMLl競爭DNA結(jié)合位點(diǎn)而與核心增強(qiáng)序列結(jié)合，活化組蛋白去乙?；?，從而使AMLl由轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)錄抑制因子，顯著負(fù)性抑制野生型 AMLl功能，抑制轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致AMLl調(diào)節(jié)靶基因(M-CSF受體、IL-3和GM-CSF受體基因等) 的表達(dá)受阻，影響造血干細(xì)胞的自我更新和分化能力。
檢測TEL-AMLl融合基因的mRNA表達(dá)可以檢測白血病細(xì)胞的微小殘留，TEL-AMLl 融合基因的mRNA表達(dá)快速降低至消失提示無殘留白血病細(xì)胞，而TEL-AMLl融合基因的 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢預(yù)示ALL復(fù)發(fā)。因此，TEL-AMLl融合基因表達(dá)的檢測對預(yù)測兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病的預(yù)后以及危險(xiǎn)分層具有指導(dǎo)意義。實(shí)時熒光定量PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到真正意義的定量的飛躍，為人類疾病基因的定量檢測提供了一個行之有效的檢測工具，與普通PCR相比具有特異性增強(qiáng)、靈敏度提高和檢測快速、降低了污染等特點(diǎn)，但目前尚未有實(shí)時熒光定量 PCR方法檢測急性淋巴細(xì)胞白血病中TEL-AMLl融合基因的相關(guān)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)空缺的問題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種檢測TEL-AMLl融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，所述技術(shù)方案如下
本發(fā)明實(shí)施例提供了一種檢測TEL-AMLl融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括TEL-AMLI融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中
TEL-AMLl融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；
TEL-AMLl融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；
TEL-AMLl融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示；
ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；
ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所不；
ABL基因Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；
所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、 Oligo (dT) 15、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽性控制序列、內(nèi)部陽性控制序列的引物和 Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示；內(nèi)部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內(nèi)部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID NO:9所示；內(nèi)部陽性控制序列的Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
進(jìn)一步地，所述TEL-AMLl融合基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA ;所述內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)TET，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán) TAMRA0
具體地，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。
具體地，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有TEL-AMLl融合基因的總 RNA樣品。
具體地，所述的cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/L MgCl2 4 μ L，IOX逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP 2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶I.5U和無RNase去離子水,總體積11 μ L。
具體地，所述熒光定量PCR的混合液(以反應(yīng)體系終濃度表示)為1Χ的PCR預(yù)混合液(原液為 2 XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、?！?2-0. 4mM 的 dNTPs,O. 3-0. 6mM 的 dUTP、O.2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及無RNase去離子水。
本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果如下
(I)敏感性高可重復(fù)敏感度為O. 01%,即10000個細(xì)胞中有一個含TEL-AMLl融合基因就可以被檢測出。
(2)特異性強(qiáng)使用特異性探針對定量分子進(jìn)行識別，準(zhǔn)確性高。同時，靶序列由弓I物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。
(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高而且防止污染。擴(kuò)增和檢測可以在同一管內(nèi)檢測，不需要開蓋，不易被污染；同時擴(kuò)增和檢測一步完成，不需要后期處理，無需要擔(dān)心放射性污染。
(4)全程監(jiān)控本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑盒引入了內(nèi)部陽性控制質(zhì)量控制體系，對檢測過程進(jìn)行全程質(zhì)量監(jiān)控，有效避免假陽性或者假陰性。
(5)快速速度快、高通量，可在3-4小時完成。
本發(fā)明的試劑盒能快速、準(zhǔn)確、定量檢測TEL-AMLl融合基因mRNA水平，有效杜絕了假陽性和假陰性的發(fā)生，用于急性淋巴細(xì)胞白血病的診斷及治療過程中微小殘留病的監(jiān)測，為急性淋巴細(xì)胞白血病的診斷、制定治療方案及療效評價和預(yù)后提供了重要的檢測手段。


為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
圖IA是本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增I.OxlO6-L OxlO3拷貝的內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖IB是由本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增I.OxlO6-L OxlO3拷貝的內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2A是本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增 I. OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖2B是由本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增I.OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標(biāo)準(zhǔn)品熒光曲線圖得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。
實(shí)施例I.本發(fā)明試劑盒的制備
I、特異性的引物和熒光探針的設(shè)計(jì)
根據(jù)基因序列(ABL基因序列、AMLl基因序列和TEL基因序列來源于美國國家生物技術(shù)信息中心核酸數(shù)據(jù)庫，其中ABL基因ID分別為25，參考序列號為匪005157. 4 ;AML1 基因ID分別為861，參考序列號為NM 001001890. 2 ;TEL基因ID分別為2120，參考序列號為NG 011443. I)分別設(shè)計(jì)對上述各基因序列特異的引物和熒光探針。
2、按照下列試劑盒的組成配制試劑盒的各組分
本發(fā)明試劑盒組成如下
①RNA 提取試劑=Trizol 試劑(Invitrogen 公司，產(chǎn)品貨號15596-026/100ml), 每Iml骨髓組織加入ImlTrizol快速提取兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病患者骨髓組織RNA。
②cDNA 第一鏈合成試劑盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，產(chǎn)品貨號K1622):25mmol/ LMgCl2 4 μ L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP 2 μ L, RNA 酶抑制劑(RNasin，一種酸性糖蛋白)O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無RNase去離子水。
③引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)品包括融合基因TEL-AMLl引物、內(nèi)參基因ABL引物、內(nèi)部陽性控制序列引物及與引物對應(yīng)的Taqman熒光探針，具體如下
TEL-AMLl融合基因上游引物序列為5’-CCCATTGGGAGAATAGCAGAAT-3’(序列表中序列I);
TEL-AMLl融合基因下游引物序列為5’-TGGCATCGTGGACGTCTCTA-3’(序列表中序列2)；
TEL-AMLl 融合基因 Taqman 熒光探針FAM 5’-ATACTTGGAATGAATCCTT-3’TAMRA(序列表中序列3)；
內(nèi)部陽性控制序列為5’ -CCCAUUGGGAGAAUAGCAGAUAGCAUACUUGGUAAGAAUCCUUCAUG AGACGUCCACGAUGCCA-3，(序列表中序列 7)；
內(nèi)部陽性控制序列上游引物序列為5’ -CCCATTGGGAGAATAGCAGATA-3’(序列表中序列8)；
內(nèi)部陽性控制序列下游引物序列為5’ -TGGCATCGTGGACGTCTCAT-3’(序列表中序列9)；
內(nèi)部陽性控制序列Taqman 熒光探針TET 5’-ATACTTGGTAAGAATCCTT-3’TAMRA (序列表中序列10)；
ABL 基因序列為5，-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCT GGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCAT AACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCC AAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCC CGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGG C-3’(序列表中序列11);
ABL基因上游引物序列為5’ -CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3，(序列表中序列4)；
ABL基因下游引物序列為5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；
ABL 基因 Taqman 熒光探針FAM 5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 6);
其中，內(nèi)部陽性控制序列為人工合成序列，包含一部分已知的TEL-AMLl融合基因序列和一部分人工合成序列；內(nèi)部陽性控制序列和ABL基因序列分別用作標(biāo)準(zhǔn)品。
上述引物序列、控制序列、基因序列、基因序列、探針序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
④陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有TEL-AMLl融合基因的總RNA樣品為陽性對照，采用上述實(shí)施例I中提供的本發(fā)明試劑盒組成①RNA提取試劑 Trizol試劑(Invitrogen公司，產(chǎn)品貨號15596-026/100ml),按每Iml骨髓組織加入Iml Trizol試劑的比例，快速提取已經(jīng)確診的含有TEL-AMLl融合基因的兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病患者的骨髓組織RNA，作為陽性對照。
⑤TEL-AMLl融合基因熒光定量PCR的反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測TEL-AMLl融合基因的引物、探針組成1X的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號 210212，2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、 O. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶、O. 25pmol/μ L 的 TEL-AMLl 融合基因上游引物(序列表中序列1)、0. 25pmol/yL的TEL-AMLl融合基因下游引物(序列表中序列2)、 O. 3pmol/ μ L的TEL-AML1融合基因Taqman突光探針(序列表中序列3)、0. 25pmol/ μ L的內(nèi)部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列下游引物 (序列表中序列9)、0. 3pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10) (以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被測樣品RNA 反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA),其余為無RNase去離子水，反應(yīng)總體積通常為20 μ L。
⑥ABL內(nèi)參基因熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測ABL內(nèi)參基因的引物、探針組成=IX的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212，2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/y L的ABL內(nèi)參基因上游引物(序列表中序列4)、 O. 25pmol/ μ L的ABL內(nèi)參基因下游引物(序列表中序列5)、0. 3pmol/ μ L的ABL基因Taqman 熒光探針(序列表中序列6)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。檢測時，加入ABL基因標(biāo)準(zhǔn)品模板2 μ L,其余為無RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 μ L。
⑦內(nèi)部陽性控制序列熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測內(nèi)部陽性控制序列的引物、探針組成ix的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號=210212, 2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/yL的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。檢測時，通常取1-2 μ L的模板(內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)， 其余為無RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 μ L。
3、PCR擴(kuò)增程序的設(shè)定在Iightcycler儀器上先經(jīng)過50°C 10s, 95°C IOmin,然后再經(jīng)過95°C 15s，60°C lmin，共40個循環(huán)。
實(shí)施例2.用實(shí)施例I制備的試劑盒檢測TEL-AMLl融合基因mRNA的表達(dá)量
以檢測30例兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病骨髓組織標(biāo)本結(jié)果為例。
用實(shí)施例I提供的本發(fā)明的試劑盒檢測TEL-AMLl融合基因mRNA表達(dá)量的檢測流程為首先根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針。其次獲取臨床兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患者骨髓組織樣本，快速提取組織RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA第一鏈；先配制 ABL內(nèi)參基因和內(nèi)部陽性控制序列的熒光定量PCR反應(yīng)液，將內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品和 ABL標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分別制作內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖IA和圖IB所ττΟ和ABL標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2Α和圖2Β 所示)，然后再配制TEL-AMLl融合基因熒光定量PCR反應(yīng)液，進(jìn)行熒光定量PCR檢測樣品，在熒光定量PCR儀數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中讀出CT值結(jié)果。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，首先分析內(nèi)部陽性控制序列擴(kuò)增結(jié)果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，提示檢測失敗，則需要重新進(jìn)行檢測，如果其Ct值位于33 35之間，需要重復(fù)檢測。當(dāng)內(nèi)部陽性控制序列Ct值小于33時，將實(shí)時熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，分別計(jì)算TEL-AMLl融合基因及ABL基因的Ct值，兩者之差即為ACt值。最后，熒光定量PCR結(jié)果采用軟件分析， 并標(biāo)化計(jì)算樣本數(shù)據(jù)。
具體步驟如下
①兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病骨髓組織總RNA的抽提按RNA抽提純化的方法抽提兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病骨髓組織樣品的總RNA。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計(jì)測定260nm與280nm光密度值計(jì)算RNA的純度與濃度，用 O. 1% DEPC處理的水調(diào)節(jié)抽提的各樣品RNA至相同濃度。
②反轉(zhuǎn)錄合成cDNA :取2 μ L上述RNA提取液，在70°C保溫lOmin，隨后加入實(shí)施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl2 4 μ L，10X 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2yL，10mmol/L dNTPs 2 μ L，RNA 酶抑制劑 0. 5 μ L，Oligo (dT) 15 0.5yg 和 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U,補(bǔ)加無RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。
取I μ L濃度為2 μ g/ml內(nèi)部陽性控制序列RNA(序列表中序列7)，在70°C保溫 IOmin,隨后加入實(shí)施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/ L MgCl24y L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2μ L，10mmol/L dNTPs 2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L， Oligo (dT) 15 0. 5 μ g和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U，補(bǔ)加無RNase去離子水至總體積20 μ L，于42°C 保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后,加熱至99°C, 5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶， 加20 μ L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。
取I μ L濃度為2 μ g/ml的陽性對照RNA，在70°C保溫lOmin，隨后加入實(shí)施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl2 4 μ L, IOX逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs 2 μ L, RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L, Oligo (dT) 15 O. 5 μ g 和 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U,補(bǔ)加無RNase去離子水至總體積20 μ L,于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 μ L無菌水混勻置冰箱-20°C保存。
③將內(nèi)部陽性控制基因序列標(biāo)準(zhǔn)品和ABL標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為 I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用實(shí)施例I提供的內(nèi)部陽性控制序列和ABL內(nèi)參基因的熒光定量PCR反應(yīng)液，分別制作內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2A和圖2B所示)。
④TEL-AMLl融合基因熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20yL :含IXPCR預(yù)混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號210212，2XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、 0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，TEL-AMLl融合基因上游引物終濃度0. 2mol/L, TEL-AMLl融合基因下游引物終濃度 0. 2 μ mol/L, TEL-AMLl融合基因Taqman熒光探針終濃度0. 3 μ mol/L,被測樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNAl. 0μ L，同時加入內(nèi)部陽性控制序列的上、下游引物終濃度為均為0. 2 μ mol/ L，內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針終濃度0. 3 μ mol/L,終濃度為0. 2 μ mol/L的內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA (②中反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)，加入超純水至總體積20yL。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為95°C IOmin預(yù)變性，然后 950C 15s,60°C Imin擴(kuò)增40個循環(huán)，擴(kuò)增過程中儀器自動收集熒光信號。
⑤ABL內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μ L :含2XPCR混合液 (Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號210212，2XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因上、下游引物終濃度均為0. 2 μ mol/L, ABL基因的Taqman熒光探針終濃度0. 2 μ mol/L, ABL 基因cDNAl. O μ L,加入無RNase去離子水補(bǔ)至總體積20 μ L。在Iightcycler突光定量PCR 儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為950C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s, 60°C Imin擴(kuò)增40個循環(huán)，擴(kuò)增過程中儀器自動收集熒光信號。
⑥陽性對照、陰性對照熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，TEL-AMLl 融合基因上、下游引物終濃度均為0. 2 μ mol/L, TEL-AMLl融合基因Taqman熒光探針終濃度O. 3 μ mol/L,陽性對照RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA LOyL或者陰性對照去離子水I. O μ L，加入無RNase去離子水補(bǔ)至總體積20 μ L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s，60°C Imin擴(kuò)增40個循環(huán)，擴(kuò)增過程中儀器自動收集突光信號。
⑦數(shù)據(jù)收集處理和分析PCR擴(kuò)增結(jié)束后，首先分析內(nèi)部陽性控制序列擴(kuò)增結(jié)果， 如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進(jìn)行檢測。當(dāng)內(nèi)部陽性控制序列Ct值小于33時，將實(shí)時熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得出 TEL-AMLl融合基因相對于ABL內(nèi)參基因的相對表達(dá)量后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以比值大于或等于O. 0001為陽性表達(dá)，小于O. 0001為陰性表達(dá)(具體參見表I)
表I為熒光定量PCR分析TEL-AMLl融合基因在兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病的表達(dá)
權(quán)利要求
1.一種檢測TEL-AMLl融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，其特征在于，所述檢測用引物、熒光探針包括TEL-AMLl融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中 TEL-AMLl融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示； TEL-AMLl融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示； TEL-AMLl融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:3所示； ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所不； ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所不； ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6 ； 所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，還包括內(nèi)部陽性控制序列、內(nèi)部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQ ID N0:7所示；內(nèi)部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內(nèi)部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針如序列表中SEQIDNO: 10 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述TEL-AMLl融合基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA ;所述內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)TET，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有TEL-AMLl融合基因的總RNA樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/LMgCl2 4μ L，IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2μ L，10mmol/L dNTP 2 μ L，RNA 酶抑制劑 O. 5 μ L，Oligo (dT) 15 0. 5 μ g, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的混合液為1X的PCR 預(yù)混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和無RNase去離子水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測TEL-AML1融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述試劑盒包括檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括TEL-AML1融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針。TEL的螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)域與AML1的DNA結(jié)合和激活區(qū)域融合，從而抑制AML1的轉(zhuǎn)錄活性，使造血干細(xì)胞分化能力減低，白血病細(xì)胞增殖增加。采用敏感性及特異性均較高的熒光定量PCR檢測TEL-AML1 mRNA水平，其檢測結(jié)果的特異性和敏感度均顯著提高。該試劑盒為臨床評估兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病的預(yù)后以及復(fù)發(fā)周期提供了一種全新的快速簡便的基因診斷技術(shù)。
文檔編號C12Q1/68GK102925575SQ201210443569
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者李艷, 童永清 申請人:李艷, 童永清