專利名稱：檢測貝氏柯克斯體的專用引物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測貝氏柯克斯體的專用引物。
背景技術：
貝氏柯克斯體是1935年首次從澳大利亞病人中分離到的立克次體樣病原體，屬專性胞內寄生、革蘭氏陰性嗜酸菌。貝氏柯克斯體所致疾病稱為Q熱(Q fever)。Q熱分為急性和慢性兩種臨床類型。急性Q熱表現(xiàn)為急性流感樣癥狀，以頭痛、發(fā)熱、肺炎為主要特征，而慢性Q熱主要表現(xiàn)為長期發(fā)熱，常伴有心內膜炎、肝炎、骨髓炎等。貝氏柯克斯體的感染劑量極低，單個病原體即可致病，因此該病原體已被某些國家用作生物武器、還可能被恐怖組織用作生物恐怖劑。目前已經報道的Q熱病例遍及全球各大洲幾乎所有國家，成為當前分布最廣的人獸共患病之一。傳統(tǒng)的普通PCR和實時熒光定量PCR方法等常需要花費較長時間或者需要特定的儀器，難以滿足暴發(fā)疫情快速診斷的需要。 環(huán)介導等溫擴增法(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)具有在等溫條件下即可高效、快速、高特異、高靈敏的擴增靶序列的特點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測貝氏柯克斯體的環(huán)介導等溫擴增引物組。本發(fā)明提供的檢測貝氏柯克斯體的環(huán)介導等溫擴增引物組，由引物I、引物2、引物3和引物4組成；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。上述引物組中，引物I、引物2、引物3和引物4的摩爾比為I :1:8 :8。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測貝氏柯克斯體的環(huán)介導等溫擴增試劑。本發(fā)明提供的檢測貝氏柯克斯體的環(huán)介導等溫擴增試劑，包括上述的引物組和環(huán)介導等溫擴增緩沖液。上述環(huán)介導等溫擴增試劑由上述的引物組、環(huán)介導等溫擴增緩沖液和水組成；所述引物I和所述引物2在所述環(huán)介導等溫擴增試劑中的終濃度均為5pmol/L，所述引物3和所述引物4在所述環(huán)介導等溫擴增試劑中的終濃度均為40pmol/L。本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測貝氏柯克斯體的環(huán)介導等溫擴增試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的引物組或上述的環(huán)介導等溫擴增試劑。上述的引物組、上述的環(huán)介導等溫擴增試劑、上述試劑盒在制備檢測和/或輔助檢測貝氏柯克斯體產品中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。上述應用中，所述檢測為環(huán)介導等溫擴增反應，所述環(huán)介導等溫擴增反應的條件為60-65°C反應30-90min，具體為63°C反應90min ;再80°C 5min終止反應。上述檢測和/或輔助檢測貝氏柯克斯體為用上述環(huán)介導等溫擴增試劑對待測樣本(貝氏柯克斯體)進行環(huán)介導恒溫擴增反應，檢測環(huán)介導恒溫擴增反應產物；
上述檢測環(huán)介導恒溫擴增反應產物可通過如下方法判斷I)通過反應液的池度進行分析判定核酸大量合成時，dNTP會析出大量的焦磷酸根離子，焦磷酸根離子與LAMP體系中的Mg2+ (或Mn2+)結合，產生焦磷酸鎂或焦磷酸錳沉淀，從而引起反應液的濁度變化；基于該原理，可以根據(jù)反應液的濁度變化判斷是否有核酸大量合成，從而判斷模板是否為靶序列；若渾濁，則為陽性，反之為陰性；2)采用實時濁度儀及其配套程序軟件實時檢測反應液，若實時濁度儀上觀察到典型的擴增曲線，則表明待測樣本來自貝氏柯克斯體，為陽性，反之為陰性。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 4條專用引物，采用環(huán)介導等溫擴增法可對貝氏柯克斯體進行特異性檢測和定量分析，本發(fā)明的引物和方法具有如下優(yōu)點(1)只需在恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊設備；(2)特異性高；(3)快速高效，擴增反應在60分鐘內即可完成；(4)靈敏度高；(5)鑒定方便簡單。本發(fā)明的引物適用于臨床標本的快速檢測。


圖I為實施例2的靈敏度檢測的實時濁度儀擴增結果和擴增曲線。圖2為實施例2的特異性檢測的實時濁度儀擴增結果。圖3為實施例2的重復性檢測的實時濁度儀擴增結果(A)以及擴增曲線(B)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下列實例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆操作手冊，或按照制造廠商所建議的條件。所用無機化學試劑和有機試劑均符合分子生物學實驗的要求。引物由上海生物工程技術公司合成，LAMP試劑盒DNA Amplification Kit,日本榮研公司，CodeNo :LMP204。LAMP 突光檢測試劑Fluorescent Detection Reagent,日本榮研公司，CodeNo:LMP221。LAMP反應專用離心管Reaction Tube，日本榮研公司，CodeNo:LMP905。日本DNA提取試劑盒DNeasy Blood & Tissue Kit，QIAgen 公司產品，Cat No. 69506。LA-320C 實時濁度儀，日本榮研公司產品。下述實施例中部分材料如下，括號的數(shù)字代表下述文獻編號貝氏柯克斯體新橋株(I)、立氏立克次體(2)、普氏立克次體(2)、莫氏立克次體
(2)、黑龍江立克次體(2)、鼠疫耶爾森菌(2)、金黃色葡萄球菌(3);公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所獲得。大腸桿菌BL2I (DE3)(購自 Novagen 公司，貨號=7O235-3XI.檢測貝氏柯克斯體的實時熒光定量PCR，中國人獸共患病雜志，第21卷，第8期，652-655，2005。2.實時熒光定量PCR檢測斑點熱立克次體的方法建立，解放軍醫(yī)學雜志，第33卷，第 11 期，1297-1299,2008。
3.霍亂弧菌外膜蛋白W的原核表達及抗原性分析，軍事醫(yī)學，第35卷，第10期，746-748,2011 ο實施例I、檢測貝氏柯克斯體專用引物的設計和制備根據(jù)貝氏柯克斯體新橋株全基因組序列設計的特異性引物序列如下F3 (序列 I) :5，-TTCAATAAGCGTTTTATCGCT-3’ ；B3 (序列 2) :5，-ACAACCATTTAAACCGACAAG-3，；FIP (序列 3) :5，-AAGGCTTCCATCAGTGTGAATTATTTGAAGTTATCGAAAGATTGCGT-3，；BIP (序列 4) :5，-CGAATGGTGTCGCGTGTTTCCCCCTTTATCTCATTTCCGG-3，；
人工合成上述所需引物，用于下述實施例2的檢測。實施例2、檢測貝氏柯克斯體專用弓丨物的應用—、貝氏柯克斯體樣本的制備貝氏柯克斯體新橋株感染的雞胚卵黃囊膜，加入肉湯進行研磨，制備貝氏柯克斯體感染雞胚的卵黃囊膜研磨液。采用泛影葡胺密度梯度離心法進行純化，將純化后的貝氏柯克斯體采用DNeasy Blood&Tissue Kit提取組織DNA,具體提取方法見該試劑盒的說明書，最后采用NanodroplOOO測定提取的菌體DNA的濃度(ng/ μ L)。貝氏柯克斯體新橋株基因組大小為2Mbp，根據(jù)菌體DNA的濃度(ng/μ L)和基因組的大小(2Mbp)，計算出純化的貝氏柯克斯體新橋株菌體的摩爾數(shù)，最后計算所純化的貝氏柯克斯體新橋株的濃度(個基因組/mL)。使用純水將提取的菌體DNA進行梯度稀釋，得到7種不同濃度的菌體DNA稀釋液(濃度分別為I X IO6個基因組/ μ L、I X IO5個基因組/ μ L、I X IO4個基因組/ μ L、I X IO3個基因組/ μ L、I X IO2個基因組/ μ L、I X IO1個基因組/ μ L、I X 10°個基因組/ μ L)。將得到的7種菌體稀釋液和PBS (陰性對照)作為8個樣本。樣本I :濃度為I X IO6個基因組/ μ L的貝氏柯克斯體新橋株稀釋液。樣本2 :濃度為IX IO5個基因組/μ L的貝氏柯克斯體新橋株稀釋液。樣本3 :濃度為I X IO4個基因組/ μ L的貝氏柯克斯體新橋株稀釋液。樣本4 :濃度為I X IO3個基因組/ μ L的貝氏柯克斯體新橋株稀釋液。樣本5 :濃度為I X IO2個基因組/ μ L的貝氏柯克斯體新橋株稀釋液。樣本6 :濃度為I X IO1個基因組/ μ L的貝氏柯克斯體新橋株稀釋液。樣本7 :濃度為I X 10°個基因組/ μ L的貝氏柯克斯體新橋株稀釋液。樣本8:PBS緩沖液。二、專用引物檢測貝氏柯克斯體(采用LAMP試劑盒)I、靈敏度檢測用實施例I中的專用引物檢測上述一得到的待測DNA，所有反應均在專用離心管中進行；待測DNA為樣本I-樣本8。LAMP反應體系(25 μ I) F3和B3的終濃度均為5pmol/L，BIP和FIP的終濃度均為 40pmol/L，2X 反應混合液(RM，日本榮研公司，CodeNo LMP204) 12. 5 μ 1，Bst DNA 聚合酶Iy 1，待測DNAly 1，無核酸酶和脫氧核酶的去離子水定容；以上濃度均為體系中的終濃度。LAMP反應體系在63°C反應90min，然后80°C 5min終止反應。實時濁度儀擴增曲線見圖1，其中A為擴增結果，B為對應的擴增曲線，可以看出，樣本I至樣本5為陽性，樣本6至樣本8為陰性。該結果說明本發(fā)明的引物和方法的靈敏度為100個基因組/反應體系。上述4條引物或者除模板外的上述LAMP反應體系可以作為檢測貝氏柯克斯體的試劑盒中的組分。2、特異性檢測用實施例I中的專用引物檢測7種非貝氏柯克斯體基因組DNA用來評價該專用引物的特異性，7種非貝氏柯克斯體分別如下立氏立克次體、普氏立克次體、莫氏立克次體、黑龍江立克次體、鼠疫耶爾森菌、金色葡萄球菌、大腸桿菌BL21 (DE3)。待測樣本的DNA濃度均為IO4個基因組/μ L。檢測方法和體系如上述I。 結果如圖2所示，其中貝氏柯克斯體新橋株(圖2-1)、立氏立克次體(圖2-2)、普氏立克次體(圖2-3)、莫氏立克次體(圖2-4)、黑龍江立克次體(圖2-5)、鼠疫耶爾森菌(圖
2-6)、金黃色葡萄球菌(圖2-7)、大腸桿菌BL21 (DE3)(圖2_8);從圖上可以看出貝氏柯克斯體新橋株基因組DNA的LAMP擴增結果為陽性，其他基因組DNA以及陰性對照的LAMP擴增結果均為陰性。該結果說明本發(fā)明的引物和方法具有良好特異性。3、重復性檢測用實施例I中的4條專用引物重復檢測檢測樣本2(濃度為IX IO5個基因組/ μ L的貝氏柯克斯體新橋株稀釋液)。重復次數(shù)為8次。檢測方法和體系如上述1，結果見圖3，1-8分別為重復的8次，A為擴增結果，B為對應的擴增曲線；從圖上可以看出8次檢測的結果均為陽性，擴增曲線沒有明顯的差別，說明該專用引物具有較高的重復性。
權利要求
1.檢測貝氏柯克斯體的環(huán)介導等溫擴增引物組，由引物I、引物2、引物3和引物4組成； 所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根據(jù)權利要求I所述的引物組，其特征在于所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為I :1:8 :8。
3.檢測貝氏柯克斯體的環(huán)介導等溫擴增試劑，包括權利要求I或2所述的引物組和環(huán)介導等溫擴增緩沖液。
4.根據(jù)權利要求3所述的環(huán)介導等溫擴增試劑，其特征在于所述環(huán)介導等溫擴增試劑由權利要求I或2所述的引物組、環(huán)介導等溫擴增緩沖液和水組成； 所述引物I和所述引物2在所述環(huán)介導等溫擴增試劑中的終濃度均為5pmol/L， 所述引物3和所述引物4在所述環(huán)介導等溫擴增試劑中的終濃度均為40pmol/L。
5.檢測貝氏柯克斯體的環(huán)介導等溫擴增試劑盒，包括權利要求I或2所述的引物組或權利要求3或4所述的環(huán)介導等溫擴增試劑。
6.權利要求I或2所述的引物組、權利要求3或4所述的環(huán)介導等溫擴增試劑、權利要求5所述試劑盒在制備檢測和/或輔助檢測貝氏柯克斯體產品中的應用。
7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于所述檢測為環(huán)介導等溫擴增反應，所述環(huán)介導等溫擴增反應的條件為60-65°C反應30-90min，再80°C 5min終止反應。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測貝氏柯克斯體的專用引物。本發(fā)明提供的檢測貝氏柯克斯體的環(huán)介導等溫擴增引物組，包括引物1、引物2、引物3和引物4；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本發(fā)明的優(yōu)點(1)只需在恒定溫度就能擴增反應，不需要特殊設備；(2)特異性高；(3)快速高效，擴增反應在60分鐘內即可完成；(4)靈敏度高；(5)鑒定方便簡單。本發(fā)明特別適用于臨床標本的快速檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102925574SQ20121044308
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權日2012年11月8日
發(fā)明者王錫樂, 溫博海, 熊小路, 齊永, 段長松, 李佳明, 焦俊, 賈引軍, 龔文平 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所