專利名稱：：可溶性透明質(zhì)酸酶糖蛋白(sHASEGP)、制備它們的方法、它們的用途和包含它們的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般性地涉及在中性條件下具有活性的(neutral-active)可溶的透明質(zhì)酸酶糖蛋白(sHASEGP)、其中的部分，特別是透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。更特別地，本發(fā)明涉及化學(xué)修飾、藥物組合物、表達(dá)質(zhì)粒、制造方法和治療方法，其中將透明質(zhì)酸酶糖蛋白和其結(jié)構(gòu)域以及編碼核酸分子應(yīng)用于在疾病治療中糖胺聚糖的治療性的修飾以及增加直徑小于200納米的其它注射分子在動(dòng)物中的擴(kuò)散。
背景技術(shù)：
：糖胺聚糖(GAGs)是胞外基質(zhì)(ECM)中復(fù)雜的線性多糖。GAG的特征為重復(fù)的二糖結(jié)構(gòu)，二糖結(jié)構(gòu)由N-取代的氨基己糖和糖醛酸組成[透明質(zhì)酸(HA)、硫酸軟骨素(CS)、軟骨素(C)、硫酸皮膚素(DS)、硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(H)]或由N-取代的氨基己糖和半乳糖組成[硫酸角質(zhì)素(KS)]。除了HA之外,所有均共價(jià)結(jié)合于核心蛋白(coreproteins)。GAG連同它們的核心蛋白在結(jié)構(gòu)上被稱為蛋白多糖(PGs)。透明質(zhì)酸(HA)主要發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物的結(jié)締組織、皮膚、軟骨中以及滑液中。透明質(zhì)酸也是眼睛玻璃體的主要組成成分。在結(jié)締組織中，與透明質(zhì)酸相關(guān)的水合作用的水產(chǎn)生了組織之間的空間，從而為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和增殖創(chuàng)造了有利的環(huán)境。透明質(zhì)酸在與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的生物學(xué)現(xiàn)象中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這些細(xì)胞運(yùn)動(dòng)包括快速發(fā)育(rapiddevelopment)、再生、修復(fù)、胚胎發(fā)生、胚胎發(fā)育、傷口愈合、血管生成和腫瘤發(fā)生(Toole1991CellBiol.Extracell.Matrix,Hay(ed),PlenumPress,NewYork,1384-1386；Bertrandetal.1992Int.J.Cancer52:1-6;Knudsonetal,1993FASEBJ.7:1233-1241)。此夕卜，透明質(zhì)酸水平與腫瘤入侵(tumoraggressiveness)有關(guān)(Ozelloetal.1960CancerRes.20:600-604；Takeuchietal.1976,CancerRes.36:2133-2139;Kimataetal.1983CancerRes.43:1347-1354)。HA發(fā)現(xiàn)于許多細(xì)胞的胞外基質(zhì)中，尤其是軟結(jié)締組織中。已發(fā)現(xiàn)HA具有多種生理學(xué)功能，諸如在水和血漿蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡方面(LaurentTCetal(1992)FASEBJ6:2397-2404)。HA的產(chǎn)生增加了細(xì)胞繁殖，并可能在有絲分裂中發(fā)揮作用。這已在運(yùn)動(dòng)(locomotion)和細(xì)胞遷移中得到啟示。HA似乎在細(xì)胞調(diào)控、發(fā)育和分化中發(fā)揮作用(Laurentetal,supra)。HA已經(jīng)被用于臨床醫(yī)學(xué)中。它的組織保護(hù)特性和流變特性已經(jīng)證明可用于眼科手術(shù)中，以在白內(nèi)障手術(shù)中保護(hù)角膜內(nèi)皮。血清HA在肝病和各種炎癥病癥如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中具有診斷作用。由HA的積聚引起的間質(zhì)水腫可引起各種器官的功能紊亂(Laurentetal,supra)。透明質(zhì)酸蛋白質(zhì)相互作用也參與胞外基質(zhì)或“基質(zhì)(groundsubstance)”的結(jié)構(gòu)。透明質(zhì)酸酶是一組中性和酸性活性酶，在整個(gè)動(dòng)物界都能被發(fā)現(xiàn)。透明質(zhì)酸酶在底物特異性和作用機(jī)制方面有所變化。有3大類透明質(zhì)酸酶I.哺乳動(dòng)物類型透明質(zhì)酸酶(EC3.2.I.35)，其是內(nèi)-β-N-乙酰氨基己糖苷酶，以四糖和己糖作為主要的終產(chǎn)物。它們具有水解和轉(zhuǎn)糖苷酶活性，能夠降解透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素(CS)，尤其是C4-S和C6-S。2.細(xì)菌透明質(zhì)酸酶(EC4.2.99.I)降解透明質(zhì)酸，并不同程度地降解CS和DS。它們是內(nèi)-β-N-乙酰氨基己糖苷酶，它們通過β消去反應(yīng)發(fā)揮作用，主要產(chǎn)生二糖終產(chǎn)物。3.來自水蛭、其它寄生蟲和甲殼類動(dòng)物的透明質(zhì)酸酶(EC3.2.1.36)，其是內(nèi)葡糖醛酸酶，通過水解β1-3鍵產(chǎn)生四糖和己糖終產(chǎn)物。哺乳動(dòng)物透明質(zhì)酸酶可以進(jìn)一步分為兩組中性活性(neutralactive)和酸性活性(acidactive)酶。在人基因組中有六種透明質(zhì)酸酶樣基因HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPl和PH20/SPAM1。HYALPl是假基因，HYAL3對(duì)任何已知的底物都沒有顯示出具有酶活性。HYAL4是軟骨素酶(chondroitinase)，對(duì)透明質(zhì)酸缺少活性。HYALl是原型酸性活性酶，PH20是原型中性活性酶。酸性活性透明質(zhì)酸酶，諸如HYALl和HYAL2在中性pH中缺少催化活性。例如，HYALl在體外pH4.5以上無催化活性(FrostetalAnalBiochemistry,1997)。HYAL2是酸性活性酶，在體外具有非常低的比活性。透明質(zhì)酸酶樣(hyalimmidase-like)酶也可以表征為那些通過糖基磷脂酰肌醇錨鎖定到質(zhì)膜上的酶，諸如人HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova,etal.ProcNatlAcadSciUSA.2003Apr15;100(8):4580-5,Phelpsetal.,Science1988)，和那些為可溶性的酶，諸如人HYALl(Frostetal,BiochemBiophysResCommun.1997Jul9;236(I):10-5)。然而，種與種之間是有變化的例如牛PH20非常松散地附著到質(zhì)膜，而不通過憐脂酶敏感性的錨(phospholipasesensitiveanchor)被錨定(Lalancetteetal,BiolReprod.2001Aug;65(2):628-36)。牛透明質(zhì)酸酶的這一獨(dú)特特征使得可以使用可溶性牛睪丸透明質(zhì)酸酶作為提取物用于臨床應(yīng)用(Wyd^eK:、Hyahw)。其它種的PH20是脂錨定的酶，其在不應(yīng)用去污劑或脂肪酶的情況下是不具可溶性的。例如，人PH20通過GPI錨被錨定到質(zhì)膜。已經(jīng)嘗試制備不會(huì)引入脂類錨的人PH20DNA構(gòu)建物，但得到的是無催化活性的酶，或者不可溶的酶(ArmingetalEurJBiochem.1997AugI;247(3):810-4)發(fā)現(xiàn)天然存在的獼猴精子透明質(zhì)酸酶既可以是可溶性的，又可以是膜結(jié)合形式的。64kDa膜結(jié)合形式在PH7.O時(shí)具有酶活性，而54kDa形式僅在pH4.O時(shí)具有活性(Cherretal，DevBiol.1996Apr10;175(I):142-53)。因此，可溶性形式的PH20在中性條件下缺乏酶活性。軟骨素酶是在整個(gè)動(dòng)物界都能發(fā)現(xiàn)的酶。這些酶通過內(nèi)切糖苷酶反應(yīng)降解糖胺聚糖。已知的軟骨素酶的具體例子包括軟骨素酶ABC(來自普通變形桿菌(Proteusvulgaris)；日本專利特開號(hào)6-153947，T.Yamagata,H.Saito,0.Habuchi,andS.Suzuki,J.Biol.Chem.,243,1523(1968),S.Suzuki,H.Saito,T.Yamagata,K.Anno,N.Seno,Y.Kawai,andT.Furuhashi,J.Biol.Chem.,243,1543(1968));軟骨素酶AC(來自肝素黃桿菌(Flavobacteriumheparinum);T.Yamagata,H.Saito,O.Habuchi,andS.Suzuki,J.Biol.Chem.,243,1523(1968));軟骨素酶ACII(來自Arthrobacteraurescens;K.Hiyama,andS.Okada,J.Biol.Chem.,250,1824(1975),K.HiyamaandS.Okada,J.Biochem.(Tokyo),80,1201(1976));透明質(zhì)酸酶ACIII(來自黃桿菌某種Hp102;HirofumiMiyazono,HiroshiKikuchi,KeiichiYoshida,KiyoshiMorikawa,andKiyochikaTokuyasu,Seikagaku,61,1023(1989));軟骨素酶B(來自肝素黃桿菌;YM.MichelacciandC.P.Dietrich,Biochem.Biophys.Res.Commun.,56,973(1974),Y.M.MichelacciandC.P.Dietrich,Biochem.J.,151,121(1975),KenichiMaeyama,AkiraTawada,AkikoUeno,andKeiichiYoshida,Seikagaku,57,1189(1985));軟骨素酶C(來自黃桿菌某種Hp102;HirofumiMiyazono,HiroshiKikuchi,KelichiYoshida,KiyoshiMorikawa,andKiyochikaTokuyasu,Seikagaku,61,1023(1939))和類似物。糖蛋白由共價(jià)結(jié)合到一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分的多肽鏈組成。有兩大類糖蛋白，其具有通過N-糖苷鍵或O-糖苷鍵偶聯(lián)到它們的組成蛋白質(zhì)上的碳水化合物。N-連接和O-連接的聚糖分別通過天冬酰胺-N-乙酰-D-葡萄糖胺和絲氨酸(蘇氨酸)-N-乙酰-D-半乳糖胺連接附著到多肽上。復(fù)合的N-連接寡糖不含有末端甘露糖殘基。它們只含有末端N-乙酰葡糖胺、半乳糖和/或唾液酸殘基。雜合寡糖含有末端甘露糖殘基以及末端N-乙酰葡糖胺、半乳糖和/或唾液酸殘基。對(duì)于N連接的糖蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的肽合成期間，寡糖前體被附著到天冬酰胺的氨基基團(tuán)上。寡糖部分繼而由一系列特異性酶進(jìn)行加工，剔除和增加糖組成部分。該加工在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行，并在通過順面、中間和反面高爾基體的過程中繼續(xù)被加工。發(fā)明概述本文提供了可溶性的、中性活性的透明質(zhì)酸酶糖蛋白家族的成員，特別地，提供了人可溶性PH-20透明質(zhì)酸酶糖蛋白(本文中也稱為sHASEGPs)。本文中提供的sHASEGP是sHASEGP家族成員，本文中命名為sHASEGP。本文也提供了可溶性的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域及其應(yīng)用。本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即，通過導(dǎo)入人PH20cDNA的缺少一個(gè)狹窄區(qū)域(narrowregion)的核酸，可以在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中高產(chǎn)量地產(chǎn)生中性活性的透明質(zhì)酸酶活性，所述狹窄區(qū)域編碼羧基末端的氨基酸。也提供了對(duì)sHASEGP的額外的修飾，以利用非天然的前導(dǎo)肽增加分泌。本發(fā)明還提供了方法，其通過用聚乙二醇掩蔽蛋白質(zhì)和對(duì)天然的糖基化進(jìn)行翻譯后修飾來修飾sHASEGP，以延長(zhǎng)它的半衰期。先前已經(jīng)嘗試過生產(chǎn)分泌的中性活性的人sHASEGP，但都是失敗的。其結(jié)果表明，將人sHASEGP多肽截短不但導(dǎo)致中性酶活性喪失，還導(dǎo)致在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中細(xì)胞不能分泌重組蛋白質(zhì)(Arming,etalEurJBiochem1997AugI;247(3):810-4)。產(chǎn)生中性活性的分泌型sHASEGP對(duì)于透明質(zhì)酸酶的商業(yè)生產(chǎn)和治療應(yīng)用是至關(guān)重要的，本文中公開的發(fā)明了克服這些挑戰(zhàn)。本發(fā)明還包括具有催化活性的人sHASEGP糖蛋白，其中，該sHASEGP具有至少一個(gè)N-連接糖部分。本文中描述的研究證明，人PH20需要N-連接的聚糖以獲得催化活性，而牛和蜂毒透明質(zhì)酸酶在沒有這樣的N-連接聚糖的情況下仍具有活性。無N-連接部分的人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域是不具有催化活性的。因此，不像蜂毒HASEGP，其可以在大腸桿菌中產(chǎn)生，經(jīng)典的重組DNA技術(shù)不能產(chǎn)生具有催化活性的人sHASEGP。本發(fā)明包括用于產(chǎn)生N-連接的sHASEGP糖蛋白多肽的方法和細(xì)胞，其通過使用能夠引入所述N-連接糖部分的細(xì)胞來進(jìn)行，或通過在sHASEGP多肽上引入所述N-連接部分來進(jìn)行。還公開了鑒定適當(dāng)?shù)靥腔膕HASEGP的方法。本發(fā)明也提供了具有催化活性的超-唾液酸化的sHASEGP(Super-SialatedsHASEGP)糖蛋白。相比起天然發(fā)生的非唾液酸化的牛和羊睪丸sHASEGPs、超-唾液酸化sHASEGPs具有更大的血清半衰期，因此對(duì)于酶穩(wěn)定性和用作靜脈內(nèi)藥物是優(yōu)選的。本發(fā)明提供了用于制備超-唾液酸化sHASEGPs、組合物的方法及其應(yīng)用方法。本發(fā)明也提供了由天然GPI錨定缺陷型sHASEGP的拼接變體(splicevariants)編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了sHASEGP的組合物，其包括攜帶有金屬離子的可溶性sHASEGP糖蛋白，其中，該金屬離子是鈣、鎂或鈉。sHASEGPs在所述離子存在的條件下具有最佳活性。也提供了含有所述的金屬離子和sHASEGP的制劑。本發(fā)明也提供對(duì)sHASEGP所作的修飾，以進(jìn)一步延長(zhǎng)半衰期。提供了利用聚合物諸如聚乙二醇和葡聚糖對(duì)sHASEGP的化學(xué)修飾。這樣的修飾使得sHASEGP不會(huì)從循環(huán)和免疫系統(tǒng)中清除出去，作為甘露糖的糖基化受體和脫唾液酸糖蛋白。本發(fā)明還提供了方法，用來連接到特定的功能基團(tuán)諸如糖基化位點(diǎn)、帶正電荷的氨基酸和半胱氨酸。本文也提供了用于鑒定可調(diào)節(jié)sHASEGP的活化、表達(dá)或活性的效應(yīng)子(effectors)例如包括小分子在內(nèi)的化合物和諸如pH、溫度和離子強(qiáng)度的條件的分析方法。在示范性的分析方法中，評(píng)價(jià)了受測(cè)化合物對(duì)sHASEGP透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域切割已知底物的能力的影響，所述的已知底物通常是糖胺聚糖或蛋白聚糖。調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的活性的試劑，一般是化合物，特別是小分子，是調(diào)節(jié)sHASEGP的活性的候選化合物。透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域也可以被用于產(chǎn)生具有活性擾亂功能的透明質(zhì)酸酶特異抗體。本文中提供的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域包括但不限于，具有被截短的C-末端部分的N-末端糖基水解酶結(jié)構(gòu)域，其在體外顯示出催化活性。也提供了編碼蛋白質(zhì)和透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的核酸分子。提供了編碼可溶性透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分的核酸分子和那些編碼全長(zhǎng)sHASEGP的核酸分子。編碼透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的核酸和下游核酸如SEQIDNo.6所描述；sHASEGP的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域如SEQIDNo.I(氨基酸35-464)所描述。全長(zhǎng)sHASEGP的蛋白質(zhì)序列和編碼核酸序列如SEQIDNo.I和6所描述。本發(fā)明也提供了這樣的核酸分子，其沿著sHASEGP的編碼核酸的全長(zhǎng)或沿著全長(zhǎng)的至少70%、80%或90%與此sHASEGP編碼核酸雜交，提供了編碼透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其中的部分的核酸分子。雜交通常是在至少低、通常至少中等、常常是高的嚴(yán)緊(stringency)條件下完成。分離的核酸片段是DNA，包括基因組DNA或cDNA，或是RNA，或可以包括其他組分，諸如蛋白質(zhì)核酸(proteinnucleicacid)或其他核苷酸類似物。分離的核酸可以包括額外的組分，諸如異源或天然的啟動(dòng)子，以及其它的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，這些基因可以被連接至其他基因，諸如報(bào)告基因或其他指示基因(indicatorgenes)或編碼指示物的基因。本發(fā)明也提供了分離的核酸分子，其包括與編碼sHASEGP或其部分的核苷酸序列互補(bǔ)的分子的序列。本發(fā)明也提供了其片段或寡核苷酸，其可以被用作探針或引物，包含至少約10、14、16個(gè)核苷酸，一般少于1000個(gè)核苷酸或少于或等于100個(gè)核苷酸，如SEQIDNO.6(或其互補(bǔ)物)所述；或包含至少大約30個(gè)核苷酸(或其互補(bǔ)物)；或包含沿著它們的全長(zhǎng)(或其至少約70、80或90%)與任意此種片段或寡核苷酸雜交的寡核苷酸。片段的長(zhǎng)度與使用它們的目的和/或感興趣的基因組的復(fù)雜程度有關(guān)。通常，探針和引物包含少于約50、150或500個(gè)核苷酸。本發(fā)明也提供了包含本文中提供的任何核酸分子的質(zhì)粒。也提供了含有所述質(zhì)粒的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞包括但不限于，細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明也提供了增強(qiáng)的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，其應(yīng)用了能夠有效分泌sHASEGP的信號(hào)前導(dǎo)肽(signalleaders)。這樣的有效促分泌的前導(dǎo)肽氨基酸序列以及與sHASEGP形成的融合蛋白的例子參見SEQIDNos.43和46。本發(fā)明也提供了用于產(chǎn)生sHASEGP的方法，其通過將上述細(xì)胞在sHASEGP可被細(xì)胞表達(dá)的條件下培養(yǎng)，并回收表達(dá)的sHASEGP多肽或糖蛋白而進(jìn)行。用于分離編碼其它sHASEGPs的核酸的方法也被提供。本發(fā)明也提供了sHASEGP多肽表達(dá)于其表面的細(xì)胞，通常是真核細(xì)胞，諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞。這樣的細(xì)胞被用于藥物篩選分析，以鑒定可調(diào)節(jié)sHASEGP多肽的活性的化合物。這些分析方法包括體外結(jié)合分析、基于轉(zhuǎn)錄的分析，在其中，由sHASEGP直接或間接-例如通過活化原生長(zhǎng)因子(pro-growthfactors)-介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)得到評(píng)測(cè)。本發(fā)明也提供了由這樣的核酸分子編碼的肽。包括在那些多肽中的是sHASEGP透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，或具有氨基酸變化的多肽，而特異性和/或透明質(zhì)酸酶活性基本上未變化。特別地，提供了基本上純的哺乳動(dòng)物sHASEGP糖蛋白，其包括分泌型中性催化活性。本發(fā)明也包括透明質(zhì)酸酶催化結(jié)構(gòu)域，并且還可以包括其他結(jié)構(gòu)域。sHASEGP可以形成同型二聚體，也可以與一些其他蛋白諸如膜結(jié)合蛋白形成異型二聚體。本發(fā)明也提供了基本上純化的糖蛋白，包括與sHASEGP具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列，其中，百分同一'I"生應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)算法和缺口罰值(gappenalties)來確定,缺口罰值使百分同一'I"生最大化。sHASEGP的拼接變體，特別是那些具有催化活性透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的變體在本文中被考慮到。在其他實(shí)施方案中，提供了基本上純化的多肽，其包括sHASEGP多肽的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分，但不包含SEQIDNo.I中描述的整個(gè)氨基酸序列。屬于此列的多肽，包括與SEQIDNo.I或3具有至少70%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列。在特定的實(shí)施方案中，提供了編碼真核生物透明質(zhì)酸酶糖蛋白的核酸，命名為sHASEGP。特別地，所述核酸包括在SEQIDNo.6中描述的核苷酸序列，特別地，SEQIDNO.6的核苷酸106-1446所描述的核苷酸序列，或其中編碼具有催化活性的多肽的部分核苷酸序列。本發(fā)明也提供了這樣的核酸分子，其在至少低嚴(yán)緊性、通常中等嚴(yán)緊性、更經(jīng)常地為高嚴(yán)緊性的條件下與SEQIDNO.6或其簡(jiǎn)并型(degenerates)雜交。在一種實(shí)施方案中，分離的核酸片段在高嚴(yán)緊性的條件下，與包含SEQIDNo:6(或其簡(jiǎn)并型)所述的核苷酸序列的核酸分子雜交。全長(zhǎng)sHASEGP描述于SEQIDNo.I中，并由SEQIDNO.6或其簡(jiǎn)并型編碼。本發(fā)明也提供了sHASEGP的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的突變蛋白，特別是這樣的突變蛋白，其中，透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的游離Cys殘基(即，不與透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域中的任何其它Cys殘基形成二硫鍵)被另一氨基酸取代基所取代，通常，盡管不是必須的，是被保守的氨基酸取代基或不會(huì)消除活性的取代基所取代，還提供了這樣的突變蛋白，其中，特定的糖基化位點(diǎn)被去除。sHASEGP多肽，包括但不限于其拼接變體，以及編碼sHASEGPs及其結(jié)構(gòu)域、衍生物和類似物的核酸在本文中被提供。也提供了單鏈分泌型的透明質(zhì)酸酶糖蛋白，其具有在功能上與通過激活信號(hào)肽形成sHASEGP而產(chǎn)生的N-末端相等價(jià)的N-末端。在sHASEGP的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490處具有7個(gè)潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)，如SEQIDNO:I中所例示。在半胱氨酸殘基C60-C351和半胱氨酸殘基C224至C238之間形成二硫鍵，從而形成核心的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。然而，在羧基末端，額外的半胱氨酸對(duì)于中性酶催化活性是被要求的，這樣，在SEQIDNo.I中，從氨基酸36到Cys464的sHASEGP構(gòu)成了最小化的活性人sHASEGP透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。因此，N-連接糖基化位點(diǎn)N-490對(duì)于適當(dāng)?shù)膕HASEGP活性并不是必需的。sHASEGP的N-連接糖基化作用對(duì)于它們的催化活性和穩(wěn)定性是至關(guān)重要的。盡管改變修飾糖蛋白的聚糖的類型會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的抗原性、結(jié)構(gòu)折疊、溶解性和穩(wěn)定性產(chǎn)生巨大的影響，然而大部分的酶并不被認(rèn)為為了最佳酶活性而需要糖基化作用。就此而言，sHASEGPs因而是獨(dú)特的，去除N-連接糖基化作用可能導(dǎo)致透明質(zhì)酸酶活性幾乎完全失活。N-連接聚糖的存在對(duì)于產(chǎn)生活性的sHASEGP是至關(guān)重要的。本發(fā)明包括了適于將至關(guān)重要的N-連接糖基化殘基引入sHASEGP的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。此外，本發(fā)明也包括在能夠引入N-連接聚糖的提取物存在的條件下，引入去糖基化的sHASEGP多肽。在本發(fā)明的一個(gè)方面，描述了用唾液酸化(sialation)加帽的復(fù)雜糖基化作用，而用游離甘露糖殘基加帽的其它糖基化作用也被考慮到。優(yōu)選地，唾液酸殘基被發(fā)現(xiàn)于sHASEGP的N-連接糖基化作用的末端殘基中。N-連接的寡糖分為幾個(gè)主要的類型(甘露寡糖(oligomannose)、復(fù)合的、雜合的、硫酸化的)，它們都通過在-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不是Pro)中的Asn殘基的酰胺氮附著于(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核心。已經(jīng)報(bào)道過凝集蛋白C在-Asn-Xaa-Cys-位點(diǎn)的糖基化作用。在測(cè)序期間，N-連接位點(diǎn)常?？捎伞翱瞻?blank)”循環(huán)的出現(xiàn)而間接指示出來。可以在由PNGaseF釋放寡糖之后，進(jìn)行陽性鑒定，PNGaseF將糖基化Asn轉(zhuǎn)變?yōu)锳sp。PNGaseF進(jìn)行釋放之后，N-連接的寡糖可以用Bio-GelP_6層析進(jìn)行純化，對(duì)寡糖收集物進(jìn)行制備型高pH陰離子交換層析(HPAEC)(Townsendetal.，(1989)Anal.Biochem.182，1-8)。某些寡糖異構(gòu)體可以用HPAEC分離。在HPAEC層析譜中海藻糖殘基將較早地變換洗脫位置，而其他唾液酸殘基將會(huì)增加滯留時(shí)間。其寡糖結(jié)構(gòu)已知的糖蛋白(例如牛胎球蛋白、α-I酸性糖蛋白、卵白蛋白、RNAseB、轉(zhuǎn)鐵蛋白)被同時(shí)進(jìn)行處理，這將方便寡糖峰的指認(rèn)。收集到的寡糖可以用成分分析和甲基化連接分析的組合方法進(jìn)行表征(ffaegheetal.,(1983)CarbohydrRes.123，281-304.),利用NMR光譜術(shù)來測(cè)定端基異構(gòu)構(gòu)造(anomericconfigurations)(VanHalbeek(1993)inMethodsEnzymol230)。本發(fā)明也提供了sHASEGP的制劑。sHASEGPs可以配制成凍干的形式和穩(wěn)定化的溶液。含有特定的金屬離子諸如鈣、鎂或鈉的制劑，可以用于在中性PH時(shí)獲得最佳活性。除了穩(wěn)定化的溶液制劑外，緩慢釋放的制劑也被考慮到，其可以用于延長(zhǎng)去除糖胺聚糖的過程。還提供了試劑盒，其提供了帶有sHASEGP的預(yù)先包裝好的注射器，以便在眼內(nèi)外科操作和其他小體積操作中給予小體積的sHASEGP。本發(fā)明也提供了可離體用于人工再生技術(shù)程序(artificialreproductivetechnologyprocedures)的平衡鹽制劑(Balancedsaltformulations)。本發(fā)明也提供了將sHASEGP用于去除糖胺聚糖的方法。sHASEGP通過降解糖胺聚糖，在間隙中打開通道，使得尺寸小于500nm的分子得以擴(kuò)散。取決于劑量和制劑，這些通·道可保持24-48小時(shí)。此種通道可以被用來協(xié)助外源添加的分子的擴(kuò)散，所述外源添加的分子例如流體、小分子、蛋白質(zhì)、核酸和基因治療載體和其他尺寸小于500nm的分子。sHASEGPs也可以被用于去除過量的糖胺聚糖，諸如在缺血再灌注、炎癥、動(dòng)脈硬化、水腫、癌癥、脊髓損傷和其他形式的創(chuàng)傷之后出現(xiàn)的那些糖胺聚糖。在一些情況下，sHASEGP可以通過靜脈灌輸被全身性地傳送。當(dāng)局部位置不能到達(dá)時(shí)，可能是有好處的，例如心臟或腦或在播散性腫瘤的情況下，其中，疾病是全身性的。相對(duì)于缺少末端唾液酸的天然透明質(zhì)酸酶，超唾液酸化的sHASEGP可優(yōu)選用于增加血清半衰期和分布。在某些情形中，諸如在脊髓損傷、青光眼和妝容處理的情形中，優(yōu)選進(jìn)行持續(xù)的傳送。在其他適應(yīng)癥中，優(yōu)選單次短期作用劑量(singleshortactingdose)。暫時(shí)地去除糖胺聚糖可以被用來增強(qiáng)將溶液和藥物傳送入間質(zhì)空間。這對(duì)于麻醉劑的擴(kuò)散是有用的，對(duì)于治療性流體、分子和蛋白質(zhì)的給藥也是有用的。在sHASEGP存在的條件下，分子的皮下給藥和肌內(nèi)給藥也幫助它們更快地分布于全身。當(dāng)靜脈內(nèi)途徑不能被利用或需要分子更快地進(jìn)行全身性傳送時(shí)，此種方法是非常有用的。其他大分子諸如因子VIII——其在皮下給藥時(shí)的生物利用度很差——的傳送可以通過與sHASEGP—起注射來完成，從而增加它們的可利用度。也提供了使用sHASEGP來酶促地去除卵母細(xì)胞周圍的卵丘(積云)基質(zhì)(cumulusmatrix)。使用提取得到的透明質(zhì)酸酶的不含毒性污染物的純化sHASEGP來去除卵丘基質(zhì)，可使得卵母細(xì)胞以更強(qiáng)的存活能力被更溫和地收回。而且，sHASEGP可以在不使用攜帶病毒和其他病原體諸如可傳遞的海綿狀腦病的牛提取物或其他生物體的情況下進(jìn)行制備。用于眼內(nèi)用途的小體積的sHASEGP的注射，也可以應(yīng)用于較小的空間。SHASEGPs可以被注射入眼睛的眼睛前房，以去除在手術(shù)期間被施用的過量的粘彈性底物。sHASEGP的眼內(nèi)注射也可以被用于降低青光眼中的眼內(nèi)壓、溶解玻璃體聚集物或“漂浮物”、清除玻璃體出血，用于治療黃斑變性、促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變中的玻璃體視網(wǎng)膜脫離、用于與其他酶相混合來促進(jìn)角膜經(jīng)矯正鏡片的再塑。將會(huì)認(rèn)識(shí)到，在一些情況下，sHASEGP諸如聚乙二醇化的sHASEGP的持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的使用會(huì)是有利的。sHASEGP與其他物質(zhì)組成的聯(lián)合制劑(co-formulations)也被考慮用作注射筆(injectablepens)，以用于少量的或快速的皮下給藥?？梢员慌渲频睦又T如胰島素和其他流體。本發(fā)明的方法包括，在給予其他治療性分子之前、同時(shí)或之后，給予sHASEGP多肽或含有sHASEGP的藥物組合物。sHASEGP可以在與其他治療分子的給藥位點(diǎn)不同的位點(diǎn)給藥，或sHASEGP可以在與其他治療分子的給藥位點(diǎn)相同的位點(diǎn)給藥。因此，本發(fā)明提供了命名為sHASEGP的真核細(xì)胞分泌型中性活性透明質(zhì)酸酶糖蛋白家族、以及其功能結(jié)構(gòu)域，特別是其透明質(zhì)酸酶(或催化)結(jié)構(gòu)域、突變蛋白和其他衍生物和類似物。也提供了編碼sHASEGPs的核酸。此外，還提供了所述sHASEGP的制劑和所述sHASEGP在治療疾病中的治療用途和作為組織修飾酶的用途。附圖簡(jiǎn)述圖I是sHASEGP載體HZ24的載體圖。發(fā)明詳述A.定義除非另外指出，本文所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員的常規(guī)理解具有相同的含義。除非另外指出，在本文的全部公開內(nèi)容中所引用的所有專利、專利申請(qǐng)、公開的申請(qǐng)和出版物、Genbank序列、網(wǎng)址和其他公開材料通過弓I用方式將其整體并入本文。如果對(duì)于本文中的術(shù)語有許多定義，以這部分中的定義為主。當(dāng)引用URL或其他此種標(biāo)識(shí)或編址時(shí)，應(yīng)該理解的是，此種標(biāo)識(shí)可以變化，因特網(wǎng)上的特定信息可以來來往往，但是通過搜索因特網(wǎng)可以找到等同的信息。因此，所述的引用證明了信息是可利用的且是公開傳播的。如本文中所使用的，除非另外指出，任何保護(hù)基團(tuán)、氨基酸和其他化合物的縮寫依據(jù)它們的常規(guī)用法、標(biāo)識(shí)縮寫或IUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature(參見(1972)Biochem.11:942-944)。如本文中所使用的，真核透明質(zhì)酸酶是指各種不同家族的糖胺聚糖內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶，其中，透明質(zhì)酸酶中的谷氨酸殘基通過酸-堿催化機(jī)制水解透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素的β_1，4鍵。特別感興趣的是哺乳動(dòng)物的sHASEGP，包括人來源的sHASEGP。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，一般來說，在多肽的非實(shí)質(zhì)性區(qū)域的單個(gè)氨基酸替代基本上不改變生物學(xué)活性(參見如Watsonetal.,(1987)MolecularBiologyoftheGene,4thEdition,TheBenjamin/CummingsPub.co.,p.224)。如本文中所使用的，膜錨定sHASEGP(membraneanchoredsHASEGP)是指膜錨定的透明質(zhì)酸酶家族，其具有本文中描述的共同結(jié)構(gòu)特征。如本文中所使用的,可溶性透明質(zhì)酸酶(solublehyaluronidase)是指在生理?xiàng)l件下具有溶解性的多肽?？扇苄訦ASEGP例如可以通過它分配進(jìn)入加溫到37°C的TritonX-114溶液的水相而被辨別(BordieretaljBiolChem.1981Feb25;256(4):1604-7)。另一方面，脂錨定HASEGP(LipidanchoredHASEGP)將分配進(jìn)入富含去污劑的相，但在用磷脂酶C處理后，將分配進(jìn)入缺乏去污劑的相或水相中。因此，在對(duì)例如“sHASEGP”進(jìn)行引用時(shí)，包括了由sHASEGP基因家族編碼的所有糖蛋白，包括但不限于:人sHASEGP、小鼠sHASEGP，或從任何其他來源獲得的等同分子，其或者合成制備而得，或者顯示出同樣的活性。示范性的sHASEGP和/或其結(jié)構(gòu)域的編碼核酸分子序列和編碼的氨基酸序列描述于例如SEQIDN0:4中。該術(shù)語也包括具有氨基酸替代的sHASEGP，所述替代基本上不改變每一成員的活性，該術(shù)語也包含其拼接變體(splicevariants)0合適的替代，包括——盡管不一定是——氨基酸的保守替代，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已道的，并且這樣的替代可以在不消除所得分子的生物活性諸如催化活性的情況下進(jìn)行。如本文中所使用的，在本文中無論什么時(shí)候被引用時(shí)，sHASEGP都包括至少一個(gè)或所有或任何組合的下述物質(zhì)由SEQIDNO.6中闡述的核苷酸序列編碼的多肽，或由包括編碼SEQIDNo.I的氨基酸1-509的核苷酸的核苷酸序列編碼的多肽；由在低、中等或高嚴(yán)緊型條件下與SEQIDNO.6中所述的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的多肽；包括SEQIDNo.I的氨基酸1-509所述的氨基酸序列的多肽；包括與SEQIDNo.I中所述的氨基酸序列或SEQIDNo.4中的氨基酸1-448的序列具有至少約60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列的多肽。特別地，提供了sHASEGP多肽，其具有SEQIDNo.4所示的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。該多肽是單鏈多肽或雙鏈多肽。本發(fā)明也提供了保留有透明質(zhì)酸酶活性的其更小的部分。sHASEGPs的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域在尺寸上和構(gòu)成上有所變化，可以包括在表面環(huán)(surfaceloops)上的插入和缺失。因此,對(duì)于本文的目的,催化結(jié)構(gòu)域是sHASEGP的一部分，如本文中所定義，并且與先前已被鑒定的其他透明質(zhì)酸酶樣序列(hyaluronidaselikesequences)諸如HYALI、HYAL2、HYAL3的結(jié)構(gòu)域相同源；然而，還未發(fā)現(xiàn)，分離的單鏈形式的人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域能在體外測(cè)定中發(fā)揮功能。對(duì)活性而言所必需的天冬氨酸和谷氨酸殘基存在于保守的基序(motifs)中。如本文中所使用的，“可溶性sHASEGP的中性透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域(neutralhyaluronidasedomainofasolublesHASEGP)”是指sHASEGP的β-1,4內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)域，其在中性PH中顯示出透明質(zhì)酸酶活性，在所述的條件下是可溶性的，并且與透明質(zhì)酸酶糖基-水解酶家族結(jié)構(gòu)域具有同源性和共同的結(jié)構(gòu)特征，但在羧基末端含有額外的序列，這對(duì)于中性條件下的活性是必需的。因此，它至少是在標(biāo)準(zhǔn)的體外分析評(píng)價(jià)中顯示出透明質(zhì)酸酶活性并保留可溶性的結(jié)構(gòu)域的最小化的部分。本文中所考慮的是這樣的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域和其催化活性部分。本發(fā)明也提供了截短形式的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，包括其最小的片段，它以單鏈形式發(fā)揮催化作用。在本文中無論什么時(shí)候被引用，sHASEGP的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域都包括下述多肽中的至少一個(gè)或所有或任何組合或催化活性部分包括SEQIDNo.I所述的氨基酸序列的N-連接糖蛋白多肽；由在低、中等或高嚴(yán)緊型條件下與SEQIDNO.6中所述的核苷酸序列雜交的核苷酸序列編碼的多肽；包括SEQIDNo.I中所述的氨基酸序列的多肽；包括與SEQIDNo.I中所述的氨基酸序列具有至少約70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一1注的氨基酸序列的多肽，和/或由sHASEGP的拼接變體編碼的多肽的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。因此，對(duì)于本文的目的，透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域是sHASEGP的一部分，如本文中所定義，并且與其他sHASEGP的結(jié)構(gòu)域同源。對(duì)于透明質(zhì)酸酶家族的更大的分類的酶，sHASEGP催化結(jié)構(gòu)域享有高度的氨基酸序列同一性。對(duì)于活性所必需的Asp和Glu殘基存在于保守基序中。至于活性形式，是指在體內(nèi)和/或體外具有活性的形式。如本文中所描述的，透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域也能以可溶的分泌的糖蛋白的形式存在。本文已經(jīng)顯示，至少在體外，單鏈形式的sHASEGP和其催化結(jié)構(gòu)域或酶活性部分(通常C-末端截短)顯示出透明質(zhì)酸酶活性。因此，本文中提供的是分離形式的sHASEGP的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，以及它們?cè)隗w外藥物篩選分析中的應(yīng)用，所述體外藥物篩選分析用于鑒定調(diào)節(jié)其活性的試劑。如本文中所使用的，sHASEGP的催化活性結(jié)構(gòu)域是指中性活性的內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)域，如通過針對(duì)糖胺聚糖底物的體外活性所限定的。感興趣的sHASEGPs包括那些在體內(nèi)和體外對(duì)硫酸軟骨素和硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG’s)具有活性的sHASEGPs;和那些對(duì)透明質(zhì)酸具有活性的sHASEGPs。如本文中所使用的，人sHASEGP是由存在于人基因組中的核酸諸如DNA編碼的sHASEGP，包括所有的等位基因變體和保守變異，只要它們不是在其他哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的變體就可以。如本文中所使用的，編碼sHASEGP的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分的核酸可解釋為只編碼所述單鏈透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其活性部分的核酸，該核酸不編碼作為連續(xù)序列的sHASEGP的其他相鄰部分。如本文中所使用的，“疾病(disease)”或“紊亂(disorder)”指由例如感染或遺傳缺陷引起的生物體中的病理狀態(tài)，并表征為可檢測(cè)的癥狀。如本文中所使用的，拼接變體(splicevariant)是指對(duì)基因組核酸諸如DNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行不同的加工而產(chǎn)生的變體，通過所述的不同的加工可以產(chǎn)生一種以上類型的mRNA。本文中提供了sHASEGPs的拼接變體。如本文中所使用的，sHASEGP蛋白的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域是指顯示出中性內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶活性的sHASEGP透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域。因此，它至少是蛋白質(zhì)的最小的部分，其顯示出用標(biāo)準(zhǔn)的體外分析所評(píng)價(jià)的內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶活性。示范性的人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域包括SEQIDNo.4所述的氨基酸序列的至少一個(gè)足以顯示出內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶活性的部分。本發(fā)明也考慮了這樣的核酸分子，其編碼在體外透明質(zhì)酸酶分析中具有內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶活性的多肽，并且與全長(zhǎng)的sHASEGP多肽透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域具有至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，或其沿著它們的全長(zhǎng)或沿著全長(zhǎng)的至少約70%、80%或90%與編碼透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的核酸雜交，特別是在中等，通常為高嚴(yán)緊的條件下雜交。對(duì)于透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，在N-末端區(qū)域的殘基可能對(duì)活性是至關(guān)重要的，但不是充分的。本文顯示，sHASEGP的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域是具有催化活性的。因此，為了具有活性，透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域通常需要N-末端氨基酸；C-末端部分可以被截短，直到最后的半胱氨酸殘基還需要額外的氨基酸來獲得最佳活性。通過用評(píng)價(jià)催化切割的體外分析來測(cè)試多肽的透明質(zhì)酸酶活性，可以被截去的數(shù)量可以經(jīng)驗(yàn)性地被確定。因此，本發(fā)明考慮了透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域特別是單鏈結(jié)構(gòu)域的較小部分，其保留透明質(zhì)酸酶活性。這樣的較小的形式一般是透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的C-端截短形式。透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域在尺寸和構(gòu)成上有所變化，包括在表面環(huán)中的插入和缺失。這樣的結(jié)構(gòu)域顯示出保守的結(jié)構(gòu)，包括至少一個(gè)結(jié)構(gòu)特征，諸如質(zhì)子供體，和/或內(nèi)切氨基葡萄糖苷酶的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的其他特征。因此,對(duì)于本文目的,透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域是sHASEGP的一個(gè)單鏈部分，如本文中所述，但在它的結(jié)構(gòu)特征和序列類似性或同源性的保留方面與其他透明質(zhì)酸酶樣序列的透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域具有同源性。作為單鏈，該糖蛋白顯示出透明質(zhì)酸酶活性。如本文中所使用的，同源性是指約大于25%的核酸序列同一注，諸如25%、40%、60%、70%、80%、90%或95%。如果有必要的話，百分同源性將被明確說明。術(shù)語“同源性(homology)”和“同一性(identity)”常常交換使用?？傊瑢⑿蛄羞M(jìn)行聯(lián)配比對(duì)，以便獲得最高級(jí)別的匹配。(參見如ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.Μ.，ed.，OxfordUniversityPress,NewYork,1988；Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.，ed.，AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,Part/，Griffin,A.M.，andGriffin,H.G.，eds.，HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinjejG.,AcademicPress,1987和SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereuxjJ.,eds.,MStocktonPress,NewYork,1991；CarilloetAl.(1988)etal.(1988)SlamJAppliedMath48):1073)。依照序列同一性，保守氨基酸的數(shù)目通過標(biāo)準(zhǔn)的聯(lián)配算法程序而被確定，其中使用由各供應(yīng)商設(shè)立的默認(rèn)缺口罰值?；旧贤吹暮怂岱肿訉⑼ǔＱ刂信d趣的核酸分子的全長(zhǎng)或沿著全長(zhǎng)的至少約70%、80%或90%，在中等嚴(yán)緊度或高嚴(yán)緊度的條件下發(fā)生雜交。本發(fā)明也考慮了這樣的核酸分子，其包含了簡(jiǎn)并密碼子來替代雜交核酸分子中的密碼子。兩種核酸分子是否具有至少例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%“同一性”的核苷酸序列，可以使用已知的計(jì)算機(jī)算法諸如“FASTA”程序來確定，使用例如Pearsonetal(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85]:2444中的默認(rèn)參數(shù)(其它程序包括GCG程序包(Devereux,J.，etal,NucleicAcidsResearch12:387(1984)),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul,[S.][F.,][ETAL,JMOLECBIOL215]:403(1990)；GuidetoHugeComputers,MartinJ.Bishop,[ED.,!AcademicPress,SanDiego,1994,[CARILLOETA/·](1988)SIAMJAppliedMath48:1073)。例如，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)數(shù)據(jù)庫的BLAST功能可以被用于確定同一性。其他商業(yè)的或公用的程序包括DNASTAR〃MEGALIGN〃PROGRAM(Madison,WI)和威斯康星大學(xué)GeneticsComputerGroup(UWG)〃Gap〃程序(MadisonWI))。蛋白質(zhì)和/或核酸分子的百分同源性或同一性可以例如通過使用GAP計(jì)算機(jī)程序來比較序列信息而得以測(cè)定，GAP計(jì)算機(jī)程序例如Needlemanetal.(1970),JMolBiol.48:443,按照SmithandffatermanAdv.Appl.Math(1981)2:482的修改。簡(jiǎn)言之，GAP程序?qū)⑾嗨菩远x為，相似的聯(lián)配符號(hào)(即，核苷酸或氨基酸)的數(shù)目除以兩條序列中較短的一條中的符號(hào)總數(shù)。GAP程序的默認(rèn)參數(shù)可以包括(I)一元比較陣列(unarycomparisonmatrix)(對(duì)于同一的情況，所包含的值為1，對(duì)于非同一的情況，值為0)和Gribskovetal(1986)Nucl.AcidsRes.14:6745的加權(quán)比較陣列(weightedcomparisonmatrix),如SchwartzandDayhoff,eds.,AtlasOfProteinSequenceAndStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,pp.353-358(1979)描述;(2)每一缺口的罰值為3.0，每一缺口中的每一符號(hào)的附加罰值為O.10;和(3)末端缺口無罰值。因此，如本文中所使用的，術(shù)語“同一性”代表了受測(cè)和參考多肽或多核苷酸之間的比較。如本文中所使用的，術(shù)語“至少90%同一性”是指相對(duì)于參考多肽的90至99.99的百分同一性。90%或更高水平的同一性表明這樣一個(gè)事實(shí)，示例性地假設(shè)100個(gè)氨基酸長(zhǎng)的受測(cè)和參考多核苷酸被比較的話，在受測(cè)多核苷酸中不超過10%(即100個(gè)中的10個(gè))的氨基酸與參考多肽的氨基酸不同。在受測(cè)和參考多核苷酸之間，可以進(jìn)行類似的比較。這樣的差異可以體現(xiàn)為在全長(zhǎng)的氨基酸序列中隨機(jī)分布的點(diǎn)突變，或可以它們可以聚集在變化長(zhǎng)度的一個(gè)或多個(gè)位置，最高可至所允許的最大值，例如10/100的氨基酸差異(約90%同源性)。差異可以定義為核酸或氨基酸的替代或缺失。在同源性或同一性的水平超過約85-90%時(shí)，結(jié)果應(yīng)該不依賴于程序和缺口參數(shù)設(shè)置。這樣的高水平的同一性可以很容易進(jìn)行評(píng)估，通常不需要依靠軟件。如本文中所使用的，引物是指包含2個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸，通常大于3個(gè)，由所述引物可以啟動(dòng)引物延伸產(chǎn)物的合成。有助于合成的實(shí)驗(yàn)條件包括存在核苷三磷酸和用于聚合反應(yīng)和延伸的試劑，諸如DNA聚合酶，以及合適的緩沖液、溫度和pH。如本文中所使用的，動(dòng)物包括任何動(dòng)物，諸如但不限于山羊、牛、鹿、綿羊、嚙齒類動(dòng)物、豬和人。非人動(dòng)物是指除了人之外的被考慮到的動(dòng)物。所提供的sHASEGPs來自任何來源，動(dòng)物、植物、原核生物和真菌。大部分的sHASEGP來源于動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物來源。如本文中所使用的，遺傳療法涉及將異源核酸例如DNA轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物特別是人的某些細(xì)胞，即靶細(xì)胞，所述動(dòng)物具有此療法所要解決的紊亂或癥狀。核酸例如DNA以這樣的方式導(dǎo)入所選擇的靶細(xì)胞，即，使得該異源核酸例如DNA被表達(dá)并且所編碼的治療性產(chǎn)物由此產(chǎn)生。可選擇地，異源核酸，例如DNA，可以以某方式介導(dǎo)編碼治療性產(chǎn)物的DNA的表達(dá)，或它可以編碼某產(chǎn)物，例如肽或RNA，其以某方式直接或間接地介導(dǎo)治療性產(chǎn)物的表達(dá)。遺傳療法也可以被用來傳送編碼某基因產(chǎn)物的核酸，其替代缺陷的基因，或補(bǔ)充由導(dǎo)入有所述核酸的哺乳動(dòng)物或細(xì)胞產(chǎn)生的基因產(chǎn)物。導(dǎo)入的核酸可以編碼治療化合物，諸如其生長(zhǎng)因子抑制劑，或其腫瘤壞死因子或抑制劑，諸如受體，這些治療化合物一般情況下不產(chǎn)生于哺乳動(dòng)物宿主中，或不以治療上有效的量或不在治療上有用的時(shí)間產(chǎn)生。在導(dǎo)入到病痛的宿主的細(xì)胞中之前，編碼治療性產(chǎn)物的異源核酸例如DNA可以被修飾，以增強(qiáng)或改變?cè)摦a(chǎn)物或其表達(dá)。遺傳療法也可以涉及傳送基因表達(dá)的抑制劑或阻抑物或其他調(diào)節(jié)物。如本文中所使用的，異源核酸是這樣的核酸，該核酸和(如果DNA是編碼RNA)蛋白質(zhì)在正常情況下不由表達(dá)所述異源核酸的細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生，或者異源核酸介導(dǎo)內(nèi)源性核酸例如DNA的表達(dá)或編碼改變內(nèi)源性核酸例如DNA的表達(dá)的調(diào)節(jié)物，所述介導(dǎo)或改變是通過影響轉(zhuǎn)錄、翻譯或其他可調(diào)節(jié)的生物化學(xué)過程來實(shí)現(xiàn)的。異源核酸，例如DNA，也可以稱為外源核酸，例如DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將其識(shí)別為或考慮為對(duì)于表達(dá)它的細(xì)胞來說是異源的或外來的任何核酸例如DNA，均包括在本文的異源核酸之內(nèi)；異源核酸包括外源性加入的核酸，其也被內(nèi)源性表達(dá)。異源核酸的例子包括，但不限于編碼可追蹤的標(biāo)記蛋白的核酸，所述的可追蹤的標(biāo)記蛋白例如賦予藥物抗性的蛋白；編碼治療上有效的物質(zhì)的核酸，所述的治療上有效的物質(zhì)例如抗癌劑、酶和激素；和編碼其他類型的蛋白例如抗體的核酸，例如DNA。由異源核酸編碼的抗體可以分泌或表達(dá)在已經(jīng)導(dǎo)入有該異源核酸的細(xì)胞的表面。通常，異源核酸在遺傳上對(duì)于導(dǎo)入它的細(xì)胞來說不是內(nèi)源性的，但是已經(jīng)從別的細(xì)胞獲得或通過合成制備得到。一般地，盡管不是必需的，這樣的核酸編碼的RNA和蛋白質(zhì)在正常情況下不由表達(dá)它的細(xì)胞產(chǎn)生。如本文中所使用的，治療上有效的產(chǎn)物是由異源核酸——通常是DNA——編碼的產(chǎn)物，一旦將該核酸導(dǎo)入到宿主中后，產(chǎn)物被表達(dá)，可緩解或消除作為遺傳疾病或獲得性疾病的表現(xiàn)的癥狀，或者該產(chǎn)物治愈該疾病。如本文中所使用的，糖蛋白基本上由透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域組成的這一敘述是指，僅僅多肽的sHASEGP部分是透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域或其催化活性部分。該多肽可以任選地——并且一般將包括——額外的非sHASEGP衍生的氨基酸序列。如本文中所使用的，結(jié)構(gòu)域(domain)是指分子例如糖蛋白或編碼核酸的某部分，其在結(jié)構(gòu)上和/或功能上不同于該分子的其他部分。如本文中所使用的,透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)是指催化糖胺聚糖的水解的酶。為了清楚起見，引用透明質(zhì)酸酶時(shí)，是表示所有的形式，特定的形式將被特別地指出。對(duì)于本文的目的，透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域包括膜結(jié)合的和可溶形式的sHASEGP蛋白。如本文中所使用的，核酸包括DNA、RNA和其類似物，包括蛋白核酸(proteinnucleicacids,PNA)和其混合物。核酸可以是單鏈或雙鏈的。當(dāng)指探針或引物時(shí)-其用可檢測(cè)的標(biāo)記諸如熒光或放射性標(biāo)記任選地標(biāo)記，通?？紤]單鏈分子。這樣的分子通常是這樣的長(zhǎng)度，即，其使得在探察或起動(dòng)一個(gè)文庫時(shí)它們的靶標(biāo)是統(tǒng)計(jì)上獨(dú)特的或低拷貝數(shù)的(通常小于5，一般小于3)。一般地，探針或引物含有與感興趣的基因互補(bǔ)或相同的至少14、16或30個(gè)連續(xù)的序列。探針和引物的長(zhǎng)度可以是10、20、30、50、100或更多的核苷酸。如本文中所使用的，編碼sHASEGP片段或部分的核酸是指僅編碼所述的sHASEGP片段或部分，但不編碼sHASEGP的其他相鄰部分的核酸。如本文中所使用的，異源核酸與調(diào)節(jié)或效應(yīng)(effector)核苷酸序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止位點(diǎn)和其他信號(hào)序列的有效連接(operativelinkage)是指此種核酸例如DNA和此種核苷酸序列之間的關(guān)系。例如，異源DNA與啟動(dòng)子的有效連接是指DNA和啟動(dòng)子之間的一種物理關(guān)系，依據(jù)這樣的關(guān)系，此種DNA的轉(zhuǎn)錄由RNA聚合酶從啟動(dòng)子處啟動(dòng)，所述RNA聚合酶特異性地識(shí)別、結(jié)合并轉(zhuǎn)錄閱讀框中的DNA。因此，有效連接或操作性地結(jié)合是指，核酸例如DNA與調(diào)節(jié)和效應(yīng)核苷酸序列例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止位點(diǎn)或其他信號(hào)序列之間的功能關(guān)系。例如，DNA與啟動(dòng)子之間的有效連接是指DNA和啟動(dòng)子之間的物理和功能關(guān)系，依據(jù)這樣的關(guān)系，此種DNA的轉(zhuǎn)錄由RNA聚合酶從啟動(dòng)子開始啟動(dòng)，所述RNA聚合酶特異性識(shí)別、結(jié)合并轉(zhuǎn)錄DNA。為了優(yōu)化表達(dá)和/或體外轉(zhuǎn)錄，可能有必要去除、添加或改變克隆的5’非翻譯部分，以消除多余的、潛在不合適的選擇性翻譯起始(即，起始)密碼子或其他序列，這樣密碼子或其他序列或在轉(zhuǎn)錄水平或在翻譯水平干擾或減少表達(dá)?？蛇x擇地，共有的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(參見如KozakJ.Biol.Chem.266:19867-19870(1991))可以緊挨著起始密碼子的5’端插入，從而可以增強(qiáng)表達(dá)。對(duì)此種修飾的愿望(或需要)可以經(jīng)驗(yàn)性地被確定。如本文中所使用的，與RNA的至少一部分相互補(bǔ)的序列，稱為反義寡核苷酸，是指這樣的序列，其與RNA充分互補(bǔ)，能與RNA雜交，一般是在中等或高嚴(yán)緊型條件下雜交，形成穩(wěn)定的雙螺旋；在雙鏈sHASEGP反義核酸的情況下，可以測(cè)試雙螺旋DNA(或dsRNA)的單鏈，或可以分析三股螺旋的形成。雜交的能力取決于互補(bǔ)的程度和反義核酸的長(zhǎng)度。一般地，雜交核酸越長(zhǎng)，它能夠容納的與sHASEGP的編碼RNA的錯(cuò)配越多，并且依然能形成穩(wěn)定的雙螺旋(或三股螺旋，如果可能的話)。通過使用標(biāo)準(zhǔn)的程序去測(cè)定雜交復(fù)合體的熔點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定錯(cuò)配的可容忍程度。至于本文目的，只要所得到的蛋白質(zhì)顯示有透明質(zhì)酸酶活性，氨基酸替代可以在任何的sHASEGPs和其透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行。所考慮的氨基酸替代包括保守性替代，例如表I中所述的那些，其不會(huì)消除蛋白水解活性。如本文中所描述的，也考慮了改變蛋白質(zhì)的特性的替代，例如去除切割位點(diǎn)和其他此類位點(diǎn)。此類替代一般是非保守的，但會(huì)容易地被本領(lǐng)域技術(shù)人員完成。合適的氨基酸保守性替代是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，一般可以在不改變所得分子的生物活性如酶活性的情況下進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，一般來說，在多肽的非必需區(qū)域進(jìn)行的單個(gè)氨基酸的替代基本上不會(huì)改變生物學(xué)活性(參見如Watsonetal.MolecularBiologyoftheGene,4thEdition,1987,TheBenjamin/CummingsPub.CO.,p.224)。同樣包括在該限定中的是，sHASEGP的催化活性片段，特別是單鏈透明質(zhì)酸酶部分?？梢赃M(jìn)行的保守的氨基酸替代例如下面表I所述。表I原始?xì)埢Ｊ匦蕴娲鶤la(A)Gly;Ser,AbuArg(R)Lys,ornAsn(N)Gln；HisCys(C)SerGin(Q)AsnGlu(E)ASPGly(G)Ala；ProHis(H)Asn；GinHe(I)Leu；Val；Met；Nle；NvaLeu(L)；Val；Met；Nle；NvLys(K)Arg；Gin；GluMet(M)Leu；Tyr；Ile；NLeValOrnitineLys；ArgPhe(F)Met；Leu；TyrSer(S)ThrThr(T)SerTrp(W)TyrTyr(Y)Trp；PheVal(V)ILE；Leu；Met；Nle;Nv。其他的替代也是允許的，并可以經(jīng)驗(yàn)性地確定，或根據(jù)已知的保守替代來確定。如本文中所使用的，Abu是2-氨基丁酸；0rn是鳥氨酸。如本文中所使用的，本文中出現(xiàn)的各種氨基酸序列中的氨基酸是根據(jù)它們公知的三字母或一字母縮寫來表示的。出現(xiàn)在各種DNA片段中的核苷酸，是用本領(lǐng)域常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)的單字母標(biāo)識(shí)來表示的。如本文中所使用的，基于公開于本文中的核苷酸序列的探針或引物，包括SEQIDNO.6的至少10、14，通常至少16個(gè)連續(xù)的核苷酸序列，SEQIDNO.6的至少30、50或100個(gè)連續(xù)的核苷酸序列的探針。用于特定雜交的探針或引物的長(zhǎng)度是感興趣的基因組的復(fù)雜度的函數(shù)。如本文中所使用的，通過給予特定的藥物組合物而導(dǎo)致的特定紊亂的癥狀的緩解是指歸因?yàn)榻M合物的給予或與組合物的給予相關(guān)的任何的減輕，無論是永久的還是暫時(shí)的，持續(xù)的還是瞬時(shí)的。如本文中所使用的，反義多核苷酸是指合成的核苷酸堿基序列，其與mRNA或雙鏈DNA的有義鏈相互補(bǔ)。有義和反義多核苷酸的混合物在合適的條件下導(dǎo)致兩分子的結(jié)合或雜交。當(dāng)這些多核苷酸與mRNA結(jié)合(雜交)時(shí),蛋白質(zhì)合成(翻譯)的抑制發(fā)生。當(dāng)這些多核苷酸結(jié)合到雙鏈DNA時(shí)，RNA合成(轉(zhuǎn)錄)的抑制發(fā)生。所產(chǎn)生的翻譯和/或轉(zhuǎn)錄的抑制作用抑制了有義鏈編碼的蛋白質(zhì)的合成。反義核酸分子通常含有足夠數(shù)目的核苷酸來特異性地結(jié)合目標(biāo)核酸，通常有至少5個(gè)連續(xù)的核苷酸，常常至少14或16或30個(gè)連續(xù)的核苷酸或修飾的核苷酸，與編碼感興趣的基因的核酸分子的編碼區(qū)域相互補(bǔ)，例如與編碼sHASEGP的單鏈透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的核酸互補(bǔ)。如本文中所使用的，陣列是指元素例如抗體的集合，其含有3個(gè)或更多的成員。可尋址陣列(addressablearray)是這樣的陣列,在其中，陣列的成員一般可以通過在固相支持物上的位置而被鑒定。因此，一般而言，陣列的成員被固定在固相表面的離散的可鑒定的位點(diǎn)上。如本文中所使用的，抗體指免疫球蛋白，其是天然的或者部分或全部合成產(chǎn)生的，包括它們的保留有抗體特異性結(jié)合能力的任何衍生物。因此，抗體包括具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何蛋白質(zhì)，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源或基本上同源?？贵w包括任何免疫球蛋白的成員，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。如本文中所使用的，抗體片段是指抗體的任何衍生物，其小于全長(zhǎng)抗體，保留了全長(zhǎng)抗體的特異性結(jié)合能力的至少一部分。抗體片段的例子包括，但不限于Fab、Fab’、·F(AB)2、單鏈Fvs(scFV)、FV、dsFV雙功能抗體和Fd片段。片段可以包括例如通過二硫橋連接在一起的多條鏈。抗體片段通常含有至少50個(gè)氨基酸，典型地含有至少200個(gè)氨基酸。如本文中所使用的，F(xiàn)v抗體片段是由一個(gè)可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)和一個(gè)可變輕鏈結(jié)構(gòu)域通過非共價(jià)相互作用聯(lián)系在一起而組成。如本文中所使用的，dsFV是指具有工程制造的分子間二硫鍵的Fv。如本文中所使用的，F(xiàn)(AB)2片段是用胃蛋白酶在pH4.0_4.5消化免疫球蛋白而得到的抗體片段；它可以通過重組方法來表達(dá)，從而產(chǎn)生等同的片段。如本文中所使用的，F(xiàn)ab片段是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白而得到的抗體片段；它們可以通過重組方法被表達(dá)，從而產(chǎn)生等同的片段。如本文中所使用的，scFVs是指含有以任何順序通過多肽連接子共價(jià)聯(lián)系在一起的可變輕鏈V和可變重鏈(VH)的抗體片段。該連接子的長(zhǎng)度可以使兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域在基本上無干擾的情況下連接起來。所述的連接子包括(Gly-Ser)η殘基,其中遍布著一些Glu或Lys殘基，以增加溶解性。如本文中所使用的，人源化抗體是指經(jīng)修飾而包括人氨基酸序列的抗體，這樣，施用于人時(shí)不會(huì)引起免疫應(yīng)答。制備此種抗體的方法是已知的。例如，為了產(chǎn)生此種抗體，表達(dá)單克隆抗體的雜交瘤或其他原核或真核細(xì)胞諸如大腸桿菌或CHO細(xì)胞,可以用重組DNA技術(shù)來改變以表達(dá)這樣的抗體，在其中非可變區(qū)的氨基酸組成是基于人抗體。已經(jīng)設(shè)計(jì)出計(jì)算機(jī)程序來鑒定這樣的區(qū)域。如本文中所使用的,雙功能抗體(diabodies)是二聚體的scFV;雙功能抗體通常具有比scFVs短的肽連接子，且它們一般是二聚體化。如本文中所使用的，通過使用重組DNA方法的重組手段的生產(chǎn)，是指使用已知的分子生物學(xué)方法來表達(dá)由克隆DNA編碼的蛋白質(zhì)。如本文中所使用的，術(shù)語“評(píng)價(jià)(assessing)”旨在包括定量和定性測(cè)定，這是為了獲得存在于樣品中的sHASEGP或其結(jié)構(gòu)域的活性的絕對(duì)值，也可為了獲得表征活性的水平的指數(shù)、比率、百分比、視覺結(jié)果或其他值。評(píng)價(jià)可以是直接的或間接的，實(shí)際被檢測(cè)的化學(xué)物質(zhì)當(dāng)然不必一定是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物本身，可以例如是其衍生物或一些其他的物質(zhì)。如本文中所使用的，生物活性是指化合物的體內(nèi)活性或由于體內(nèi)給予化合物、組合物或其他混合物而弓I起的生理應(yīng)答。因此，生物活性包括此種化合物、組合物和混合物的治療效果和藥物學(xué)活性。生物活性可以采用被設(shè)計(jì)用來測(cè)試或應(yīng)用此種活性的體外系統(tǒng)來觀察。因此，對(duì)于本文的目的，熒光素酶的生物活性是它的加氧酶活性，一旦底物被氧化之后，便產(chǎn)生光。如本文中所使用的，功能活性是指多肽或其部分，其顯示出一種或多種與全長(zhǎng)蛋白質(zhì)相關(guān)的活性。功能活性包括，但不限于生物活性、催化或酶活性、抗原性(結(jié)合多肽或與多肽競(jìng)爭(zhēng)來結(jié)合抗多肽抗體的能力)、免疫原性、形成多聚體的能力、特異性地結(jié)合多肽的受體或配體的能力。如本文中所使用的，共軛物(conjugate)指本文中提供的包括一個(gè)或多個(gè)sHASEGP的化合物，其包括sHASEGP，特別是其單鏈透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域和一種或多種靶向試劑(targetingagents)。這些共軛物包括由重組方法產(chǎn)生的那些共軛物,如融合蛋白；由化學(xué)方法產(chǎn)生的那些共軛物，例如通過化學(xué)偶聯(lián)產(chǎn)生的，如通過偶聯(lián)到巰基基團(tuán)；以及那些由其他任何方法產(chǎn)生的，其中至少一個(gè)sHASEGP或其結(jié)構(gòu)域通過連接子直接或間接地連接至Li革巴向試劑。如本文中所使用的，革巴向試劑是任何組成部分(moiety),例如蛋白質(zhì)或其有效部分，其特異性地將該共軛物結(jié)合于細(xì)胞表面受體，這可以使該共軛物或其sHASEGP部分內(nèi)在化。靶向試劑也可以是例如促進(jìn)或幫助共軛物親合分離或純化、將共軛物附著到表面、或檢測(cè)共軛物或含有共軛物的復(fù)合物的試劑。如本文中所使用的，抗體共軛物是指其中的靶向試劑是抗體的共軛物。如本文中所使用的，分子的衍生物或類似物是指從分子衍生而來的一部分或修飾形式的分子。如本文中所使用的，用于治療特定疾病的化合物的有效量是指這樣的量，其足以改善或以某方式減少與疾病相關(guān)的癥狀。這樣的量可以以單次劑量被施給或可以依據(jù)療程被施給，并因此產(chǎn)生效果。該數(shù)量可以治愈疾病，但通常，是為了改善疾病的癥狀而施用。反復(fù)的施用可能是為了獲得理想的癥狀改善效果所必需的。如本文中所使用的，“等同的(equivalent)”,當(dāng)用于兩個(gè)核酸序列時(shí)，是指這兩條在研究中的序列編碼同樣序列的氨基酸或等同的蛋白質(zhì)。當(dāng)“等同的”一詞用于兩個(gè)蛋白質(zhì)或肽時(shí)，它是指這兩個(gè)蛋白質(zhì)或肽具有基本上相同的氨基酸序列，只有基本上不改變蛋白質(zhì)或肽的活性或功能的氨基酸替代(例如但不限于保守替代，諸如上面表I所述的)。當(dāng)“等同的”一詞用于性質(zhì)時(shí)，該性質(zhì)不必以相同的程度存在(例如，兩個(gè)肽對(duì)于相同類型的酶活性，可以顯示出不同的速率)，但活性通常是基本上相同的?！盎パa(bǔ)的(Complementary)”，當(dāng)用于兩條核苷酸序列時(shí)，是指這兩條核苷酸序列能夠雜交，通常在相對(duì)的核苷酸之間具有小于25%、15%、5%或0%的錯(cuò)配。如果必要的話，互補(bǔ)的百分比將被指明。通常，所選擇的這兩個(gè)分子可以在高嚴(yán)緊的條件下雜交。如本文中所使用的，調(diào)節(jié)蛋白的活性或者基因或核酸的表達(dá)的試劑，降低或增加或者改變蛋白質(zhì)的活性，或以某方式上調(diào)或下調(diào)或者改變核酸在細(xì)胞中的表達(dá)。如本文中所使用的，sHASEGP活性的抑制劑包括抑制或減少sHASEGP的產(chǎn)生、翻譯后加工修飾、成熟或膜定位的任何物質(zhì)，或者干擾或降低其蛋白水解效率一特別是在體外篩選分析中單鏈形式的蛋白的水解效率——的任何物質(zhì)。如本文中所使用的，用于治療或預(yù)防腫瘤性疾病的方法是指，任何的癥狀例如腫瘤、其轉(zhuǎn)移、腫瘤的血管化作用或表征該疾病的其他參數(shù)被降低、改善、預(yù)防、置于緩解的狀態(tài)、或維持在緩解的狀態(tài)。也指腫瘤性疾病和轉(zhuǎn)移的特征(hallmarks)可以通過該治療而被消除、減少或預(yù)防。所述特征的非限制性的例子包括基底膜(basementmembrane)和附近的胞外基質(zhì)不受控制的降解，內(nèi)皮細(xì)胞遷移、分裂和組織成新的功能化毛細(xì)管，以及這樣的功能化毛細(xì)管的維持。如本文中所使用的，共軛物的藥學(xué)上可接收的鹽、酯或其他衍生物包括任何的鹽、酯或衍生物，它們可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知的用于這樣的衍生化作用的方法容易地制備得到，這樣所產(chǎn)生的化合物能夠施用于動(dòng)物或人而基本上沒有毒性效應(yīng)，并且它們或者具有藥物學(xué)活性或者是藥物前體。如本文中所使用的，藥物前體是指這樣的化合物，其被體內(nèi)施用之后，被代謝或轉(zhuǎn)化為具有生物活性、藥物學(xué)活性或治療活性形式的化合物。為了產(chǎn)生藥物前體，藥物活性化合物被修飾，以便該活性化合物通過代謝過程被再生。藥物前體可以被設(shè)計(jì)以改變藥物的代謝穩(wěn)定性或運(yùn)送特征、以掩蔽副作用或毒性、以改善藥物的風(fēng)味，或者以改變藥物的其他特征或性質(zhì)。依據(jù)藥物動(dòng)力過程和體內(nèi)藥物代謝的知識(shí)，一旦知道了該藥學(xué)活性化合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員便可以設(shè)計(jì)該化合物的藥物前體(參見如Nogrady(1985)MedicinalChemistryABiochemicalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork,pages388-392)o如本文中所使用的，用本文中提供的篩選方法鑒定的藥物，是指任何化合物，其是用作治療劑或用作用于設(shè)計(jì)治療劑的先導(dǎo)化合物的候選化合物。此類化合物可以是小分子，包括小的有機(jī)分子、肽、肽模擬物、反義分子或dsRNA，例如RNAi、抗體、抗體片段、重組抗體和其他此類化合物，其可以充當(dāng)藥物候選者或先導(dǎo)化合物。如本文中所使用的，肽模擬物(peptidomimetic)是這樣的化合物,其模擬生物活性形式的特定肽的構(gòu)象和某些立體化學(xué)特征?？偟膩碚f，肽模擬物被設(shè)計(jì)用來模擬化合物的某些期望的特性，但不模擬不想要的特性，諸如可導(dǎo)致生物活性構(gòu)象喪失和鍵斷裂的柔性。肽模擬物可以通過用生物等排物(bioisosteres)取代形成不想要的特性的某些基團(tuán)或鍵，由生物活性化合物制備得到。生物等排物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，亞甲基生物等排物CH2S已在腦啡肽類似物中被用作酰胺取代(參見如Spatola(1983)pp.267_357inChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins,WeisteinjEd.volume7，MarcelDekkerjNewYork)。嗎啡，可以口服給藥，是內(nèi)啡肽的肽模擬物化合物。對(duì)于本文的目的，環(huán)狀肽被包括在肽模擬物之中。如本文中所使用的，啟動(dòng)子區(qū)域或啟動(dòng)子元件是指控制與之有效連接的DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄的DNA或RNA片段。啟動(dòng)子區(qū)域包括特異性序列，其足以被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和起始轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子區(qū)域的這一部分被稱為啟動(dòng)子。此外，啟動(dòng)子區(qū)域包括調(diào)控RNA聚合酶的這種識(shí)別、結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始活性的序列。這些序列可以是順式作用的，或可以對(duì)反式作用因子作出反應(yīng)。依據(jù)調(diào)控的性質(zhì)，啟動(dòng)子可以是組成型的或可以調(diào)控型的。被考慮用于原核生物的示范性啟動(dòng)子，包括噬菌體T7和T3啟動(dòng)子。如本文中所使用的，受體是指對(duì)于給定的配體具有親和力的分子。受體可以是天然發(fā)生的或合成的分子。受體在本領(lǐng)域也可以指抗-配體(anti-ligands)。如本文中所使用的，受體和抗-配體是可互換的。受體可以在它們的未加以改變的狀態(tài)下使用，或作為與其他物質(zhì)的聚集體使用。受體可以直接地或通過特定的結(jié)合物質(zhì)或連接物而間接地，共價(jià)地或非共價(jià)地或以物理接觸的方式附著到結(jié)合組分上。受體的例子包括但不限于抗體、細(xì)胞膜受體表面受體和內(nèi)在化受體(internalizingreceptors)、單克隆抗體和對(duì)諸如病毒、細(xì)胞或其他物質(zhì)、藥物、多核苷酸、核酸、肽、因子、凝集素、糖、多糖、細(xì)胞、細(xì)胞膜和細(xì)胞器上的特異性抗原決定簇具有活性的抗血清。受體的例子和使用此類受體的應(yīng)用的例子，包括但不限于a)酶對(duì)微生物的存活至關(guān)重要的特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或酶，其可以充當(dāng)抗生素[配體]選擇的靶標(biāo)；b)抗體抗體分子上的與感興趣的抗原的表位相結(jié)合的配體結(jié)合位點(diǎn)的鑒定可以被研究；通過模擬抗原表位的序列的測(cè)定可以開發(fā)出疫苗，其中免疫原是基于一種或多種這樣的序列，或可以開發(fā)出相關(guān)的診斷試劑或化合物，它們可以用于治療例如自免疫疾病(auto-immunediseases)；c)核酸配體的鑒定,諸如蛋白質(zhì)或RNA,結(jié)合位點(diǎn)；d)催化多肽聚合物,包括能夠促進(jìn)涉及將一種或多種反應(yīng)物轉(zhuǎn)化為一種或多種產(chǎn)物的化學(xué)反應(yīng)的多肽；這樣的多肽一般包括對(duì)至少一種反應(yīng)物或反應(yīng)中間產(chǎn)物具有特異性的結(jié)合位點(diǎn)，以及靠近該結(jié)合位點(diǎn)的功能活性，其中，該功能性能夠通過化學(xué)的方法修飾被結(jié)合的反應(yīng)物(參見美國(guó)專利5,215,899)；e)激素受體以高親和力與受體相結(jié)合的配體的確定，可以用于開發(fā)激素替代療法；例如，通過對(duì)結(jié)合此類受體的配體的鑒定可以開發(fā)出控制血壓的藥物；和f)鴉片受體在腦中結(jié)合鴉片受體的配體的確定，可以用于開發(fā)出嗎啡和相關(guān)毒品的上癮性較弱的替代品。如本文中所使用的，樣品是指含有分析物分析所期望的分析物的任何物質(zhì)。樣品可以是生物學(xué)樣品，例如生物流體或生物組織。生物流體的例子包括尿、血、血漿、血清、唾液、精液、大便、痰、腦脊髓液、眼淚、粘液、精液、羊水或類似物。生物組織是細(xì)胞的聚集體，通常是與它們的胞間物質(zhì)一起形成的特定類型，其構(gòu)成人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌或病毒結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)材料之一，包括結(jié)締組織、上皮組織、肌肉和神經(jīng)組織。生物組織的例子也包括器官、腫瘤、淋巴結(jié)、動(dòng)脈和個(gè)體細(xì)胞。如本文中所使用的在測(cè)定錯(cuò)配百分比時(shí)的雜交嚴(yán)緊度描述如下1)高嚴(yán)緊度0.1XSSPE,0.1%SDS，65°C；2)中等嚴(yán)緊度0.2XSspE,O.1%SDS,50°C；3)低嚴(yán)緊度I.OXSspE,O.1%SDS，50°C。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道選擇洗滌步驟對(duì)穩(wěn)定的雜交的選擇作用，也知道SspE的成分(參見如Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis,in:MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdspringHarborLaboratoryPress1989Vol3,p.B.13，也參見描述常規(guī)使用的實(shí)驗(yàn)室溶液的大量目錄)。SspE是pH7.4的磷酸鹽緩沖的O.18NaCl。進(jìn)一步地，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道雜交的穩(wěn)定性取決于TmT，它是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)(Tm=81.5°C-16.6+0.41(%G+C)-600/L))，這樣，在洗滌條件中僅有的對(duì)雜交穩(wěn)定性至關(guān)重要的參數(shù)是SspE(或SSC)中的鈉離子濃度和溫度。應(yīng)該理解的是，使用其它的緩沖液、鹽和溫度，可以獲得等同的嚴(yán)緊度。作為例子而不是為了限制，使用低嚴(yán)緊度的條件的程序如下(也參見ShiloandWeinberg,Proc.Natl.AcadSciUSA78:6789-6792(1981)):含有DNA的濾膜在40°C預(yù)處理6小時(shí)，預(yù)處理在含有35%甲酰胺、5XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.1%PVP、0.l%Ficoll、1%BSA和500ug/ml變性鮭魚精DNA(IOX)的溶液中進(jìn)行，SSC是I.5M氯化鈉和O.15M檸檬酸鈉，調(diào)節(jié)到pH7。雜交在同樣的溶液中進(jìn)行，作下述修改0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.2%BSA、100VG/M精子DNA、10%(Wt/vol)葡聚糖硫酸酯和使用5-20X106cpm32P-標(biāo)記的探針。濾膜在雜交混合物中40°C溫育18-20小時(shí)，然后在55°C洗滌I.5小時(shí)，洗滌在含有2XSSC、25mMTris-HCKpH7.4)、5mMEDTA和O.1%SDS的溶液中進(jìn)行。洗滌溶液用新鮮溶液更換，在60°C再溫育I.5小時(shí)。將濾膜進(jìn)行斑點(diǎn)干燥(blotteddry)并暴露以進(jìn)行放射自顯影。如果必要，濾膜可以在65-68°C進(jìn)行第三次洗滌，并再暴露于膠片?？梢允褂玫牡蛧?yán)緊度的其他條件是本領(lǐng)域已知的，例如在種間交叉雜交(cross-specieshybridizations)中所使用的。作為例子而不是為了限制，使用中等嚴(yán)緊度的條件的程序包括但不限于含有DNA的濾膜在55°C預(yù)處理6小時(shí)，預(yù)處理在含有6XSSC、5XDenhart’s溶液、O.5%SDS和100μg/ml變性鮭魚精DNA的溶液中進(jìn)行。雜交在同樣的溶液中進(jìn)行，并使用5-20X10632P標(biāo)記的探針。濾膜在55°C在雜交化合物中溫育18-20小時(shí)，然后在60V洗潘30分鐘，洗滌2次，洗滌在含有IXSSC和O.1%SDS的溶液中進(jìn)行。將濾膜進(jìn)行斑點(diǎn)干燥(blotteddry)并暴露以便放射自顯影?？梢允褂玫闹械葒?yán)緊度的其他條件是本領(lǐng)域已知的。對(duì)濾膜的洗滌在37°C進(jìn)行I小時(shí)，洗滌在含有2XSSC、0.1%SDS的溶液中進(jìn)行。作為例子而不是為了限制，使用高嚴(yán)緊度的條件的程序描述如下含有DNA的濾膜的預(yù)雜交在65°C進(jìn)行8小時(shí)至過夜，預(yù)雜交在由6XSSC、50mMTris_HCl(pH7.5)UmMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA和500ug/ml變性鮭魚精DNA組成的緩沖液中進(jìn)行。濾膜在65°C雜交48小時(shí)，雜交在含有100ug/ml變性鮭魚精DNA和5-20X106CPM32P標(biāo)記探針的預(yù)雜交混合物中進(jìn)行。濾膜的洗滌在37°C進(jìn)行I小時(shí)，洗滌在含有2XSSC、0.01%PVP、0.01%Ficoll和0.01%BSA的溶液中進(jìn)行。然后，在放射自顯影之前，在50°C在0.IXSSC中洗滌45分鐘?？梢允褂玫母邍?yán)緊型的其他條件是本領(lǐng)域熟知的。術(shù)語“基本上相同的”或“基本上同源的”或“類似的”隨上下文而有所變化，這是相關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所能理解的，一般是指至少60%或70%，優(yōu)選至少80%、85%，或更優(yōu)選的至少90%，最優(yōu)選至少95%的同一性。如本文中所使用的，與產(chǎn)物基本上相同，是指足夠地相似，以至于感興趣的特性不足以被改變，這樣，該基本上相同的產(chǎn)物可以用于替代所述產(chǎn)物。如本文中所使用的，基本上純化的是指具有足夠地勻質(zhì)的，用標(biāo)準(zhǔn)的分析方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)似乎沒有可易被檢測(cè)到的雜質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)的分析方法諸如薄層層析(TLC)、凝膠電泳和高效液相色譜(HPLC)，它們被本領(lǐng)域技術(shù)人員用來評(píng)估此類純度，或指具有足夠的純度，以至于經(jīng)過進(jìn)一步的純化作用，無法檢測(cè)到物理和化學(xué)特性的改變，諸如物質(zhì)的酶活性或生物活性的改變。對(duì)化合物進(jìn)行純化以產(chǎn)生化學(xué)上基本上純的化合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的?；瘜W(xué)上基本上純的化合物然而可以是立體異構(gòu)體或異構(gòu)體的混合物。在這樣的情況下，進(jìn)一步的純化可能增加混合物的比活性。如本文中所使用的，目標(biāo)細(xì)胞(或靶細(xì)胞)指體內(nèi)表達(dá)sHASEGP的細(xì)胞。如本文中所使用的，受測(cè)物質(zhì)(或受測(cè)化合物)是指化學(xué)上定義的化合物(例如有機(jī)分子、無機(jī)分子、有機(jī)/無機(jī)分子、蛋白質(zhì)、肽、核酸、寡核苷酸、脂、多糖、糖類，或這些分子的雜合物諸如糖蛋白等)或化合物的混合物(例如受測(cè)化合物文庫、天然提取物或培養(yǎng)上清液等)，本文中提供了它們對(duì)sHASEGP，特別是包括了透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域的單鏈形式或其具有足夠活性的部分的效應(yīng)，這可以通過體外方法例如本文所提供的分析方法進(jìn)行測(cè)定。如本文中所使用的，術(shù)語治療劑、治療方案、輻射防護(hù)劑或化學(xué)治療劑是指常規(guī)的藥物和藥物治療，包括疫苗，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。輻射防護(hù)劑是本領(lǐng)域已知的。如本文中所使用的，治療是指涉及狀況、紊亂或疾病的癥狀得以改善或發(fā)生其他有利改變的任何方式。治療也包括本文的組合物的任何藥物學(xué)應(yīng)用。如本文中所使用的，載體(或質(zhì)粒)是指用于將異源核酸導(dǎo)入到細(xì)胞中以進(jìn)行表達(dá)或復(fù)制的獨(dú)立元件。載體通常保持為附加體(印isomal)，但也可以被設(shè)計(jì)成可以使得基因或其部分被整合入基因組染色體中。也考慮到人工染色體載體，諸如酵母人工染色體和哺乳動(dòng)物人工染色體。此類載體的選擇和使用對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。表達(dá)載體包括能夠表達(dá)DNA的載體，該DNA與調(diào)控序列有效連接，所述調(diào)控序列諸如啟動(dòng)子區(qū)域，其能夠影響此類DNA片段的表達(dá)。因此，表達(dá)載體是指重組的DNA或RNA構(gòu)建物，諸如質(zhì)粒、噬菌體、重組病毒或其他載體，其一旦被導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞后，可以使克隆的DNA被表達(dá)。合適的表達(dá)載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，包括那些在原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞中可復(fù)制的載體，和那些保持為附加體的載體或那些整合入宿主細(xì)胞基因組的載體。如本文中所使用的，蛋白質(zhì)結(jié)合序列是指這樣的蛋白質(zhì)或肽序列，其能夠特異性結(jié)合到其他蛋白質(zhì)或肽序列，一般地，是結(jié)合到一組蛋白質(zhì)或肽序列，或結(jié)合到特定的蛋白質(zhì)或妝序列。如本文中所使用的,表位標(biāo)記(epitopetag)是指對(duì)應(yīng)于表位的短的氨基酸殘基鏈，它們有利于隨后對(duì)具有該表位標(biāo)記的蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行生化和免疫學(xué)分析。通過將表位標(biāo)記序列包括入合適表達(dá)載體中的蛋白質(zhì)編碼序列，可以完成對(duì)表位的標(biāo)記。表位標(biāo)記的蛋白質(zhì)可以用高特異性的抗體進(jìn)行親合純化，所述抗體是用該標(biāo)記培育獲得。如本文中所使用的，金屬結(jié)合序列是指這樣的蛋白質(zhì)或肽序列，其能夠特異性結(jié)合到金屬離子，通常是一組金屬離子，或結(jié)合到特定的金屬離子。如本文中所使用的，組合或聯(lián)合(combination)指兩個(gè)或更多個(gè)元素之間的任何彡口口。如本文中所使用的，組合物指任何混合物。它可以是溶液、懸浮液、液體、粉、糊，含水的、不含水的或其任何組合。如本文中所使用的，流體指可以流動(dòng)的任何組合物。因此流體包括半固體、膏、溶液、水混合物、膠、洗液、乳液形式的組合物，和任何其他這樣的組合物。如本文中所使用的，細(xì)胞的提取物指由裂解的或破裂的細(xì)胞制得的制劑或組分。如本文中所使用的，當(dāng)試劑是被隨意選擇而未考慮涉及單獨(dú)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)同與之聯(lián)系的底物、結(jié)合伴侶(bindingpartners)等的結(jié)合的特異性序列時(shí)，該試劑被認(rèn)為是隨意選擇的。隨意選擇的試劑的例子是使用化學(xué)文庫或肽組合文庫(peptidecombinatoriallibrary),或生物體的培養(yǎng)液或條件培養(yǎng)基。如本文中所使用的，當(dāng)試劑是在非隨機(jī)的基礎(chǔ)上被選擇并考慮到了目標(biāo)位點(diǎn)的序列和/或它的與試劑的作用相關(guān)的構(gòu)象時(shí)，該試劑被認(rèn)為是理性選擇的或設(shè)計(jì)的。如描述于實(shí)施例中的，在具有SEQIDNO:I或SEQIDNO:4的糖蛋白中，提出了透明質(zhì)酸酶結(jié)合位點(diǎn)和(催化)位點(diǎn)。通過利用構(gòu)成這些位點(diǎn)的肽序列，可以被理性地選擇或理性地設(shè)計(jì)出試齊U。例如，理性選擇的肽試劑可以是其氨基酸序列與ATP或鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域相同的肽。寡糖被認(rèn)為具有還原端和非還原端，無論在還原端的糖是否實(shí)際上是還原糖。根據(jù)公認(rèn)的命名法，本文在描述寡糖時(shí)將非還原端置于左邊，將還原端置于右邊。本文在描述所有的寡糖時(shí)，使用了非還原糖的名字或縮寫(例如Gal)，然后是糖苷鍵的構(gòu)型(α或β)、環(huán)鍵(ringbond)、在該鍵中涉及的還原糖的環(huán)位置,然后是還原糖的名字或縮寫(例如GlcNAc)。兩個(gè)糖之間的連接可以表示為例如2，3、2.fwdarw.3或(2，3)。每個(gè)糖均為吡喃糖。如本文中所使用的，N-連接糖部分(N-linkedsugarmoiety)是指通過Asn殘基的酰胺氮附著到sHASEGP的寡糖。N-連接寡糖分為幾個(gè)主要的類型(甘露寡糖、復(fù)合體、雜合物、硫酸化)，它們?nèi)纪ㄟ^Asn殘基的酰胺氮附著有(Man)3_GlcNAc_GlcNAc-核心,所述Asn殘基落入-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列中(其中，Xaa不是Pro)。在測(cè)序期間，N-連接位點(diǎn)常常可由“空白(blank)”循環(huán)的出現(xiàn)而間接指示出來?？梢栽谟蒔NGaseF釋放寡糖之后，進(jìn)行陽性鑒定，PNGaseF將糖基化Asn轉(zhuǎn)變?yōu)锳sp。PNGaseF進(jìn)行釋放之后，N-連接的寡糖可以用Bio-GelP-6層析進(jìn)行純化，對(duì)寡糖收集物進(jìn)行制備型高pH陰離子交換層析(HPAEC)(Townsendetal.,(1989)Anal.Biochem.182,1-8)。某些寡糖異構(gòu)體可以用HPAEC分離。在HPAEC層析譜中海藻糖殘基將較早地變換洗脫位置，而其他唾液酸殘基將會(huì)增加滯留時(shí)間。其寡糖結(jié)構(gòu)已知的糖蛋白(例如牛胎球蛋白、α-I酸性糖蛋白、卵白蛋白、RNAseB、轉(zhuǎn)鐵蛋白)被同時(shí)進(jìn)行處理，這將方便寡糖峰的指認(rèn)。收集到的寡糖可以用成分分析和甲基化連接分析的組合方法進(jìn)行表征(Waegheetal.,(1983)CarbohydrRes.123,281-304.),利用NMR光譜術(shù)來測(cè)定端基異構(gòu)構(gòu)造(anomericconfigurations)(VanHalbeek(1993)inMethodsEnzymol230)。可選擇地,寡糖可以用突光輔助碳水化合物電泳(FACE)進(jìn)行鑒定。Callewaertetal.(2001)Glycobiology11,275-281。如本文中所使用的，術(shù)語“唾液酸”指九碳羧基化糖(carboxylatedsugars)家族的任何成員。唾液酸家族最常見的成員是N-乙酰神經(jīng)氨酸(2-酮-5-乙酰胺-3，5-二脫氧-D-甘油基-D-galactononulopyranos-l-onicacid(常?？s寫為Neu5Ac、NeuAc或NANA)。該家族的另一個(gè)成員是N-輕乙酰-神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或NeuGc),其中，NeuAc的N-乙?；鶊F(tuán)被輕基化。唾液酸家族的第三個(gè)成員是2-酮-3-脫氧-nonulosonicacid(KDN)(Nadanoetal.(1986)J.Biol.Chem.261:11550-11557；Kanamorietal.(1990)J.Biol.Chem.265:21811-21819。該家族也包括9-取代的唾液酸，諸如9-0-C.sub.「C.sub.6酸基_Neu5Ac,如9_0_乳酸_Neu5Ac或9_0_乙酸_Neu5Ac、9_脫氧-9-氣_Neu5Ac和9-疊氮基-9-脫氧_Neu5Ac。對(duì)于唾液酸家族的綜述,參見Varki(1992)Glycobiology2:25-40；SialicAcids:Chemistry,MetabolismandFunction,R.Schauer,Ed.(Springer-Verlag,N.Y.(1992))。唾液酸化合物在唾液酸化程序中的合成和應(yīng)用公開于1992年10月I日公開的國(guó)際申請(qǐng)WO92/16640中。如本文中所使用的，PNGase是指天冬酰氨肽特異性N-糖苷酶F，諸如黃桿菌maningoseptum肽-N-糖苷酶F。PNGASE酶的特征為對(duì)N-連接寡糖而不對(duì)O-連接寡糖具有特異性。PNGASE效率的表征可以用SDSPAGE電泳或熒光輔助碳水化合物電泳來限定。如本文中所使用的,基本上末端化的唾液酸化作用(substantiallyterminatedsialation)是指用唾液酸殘基作為末端糖進(jìn)行末端化處理的N-連接寡糖。末端唾液酸可以通過用神經(jīng)氨酸苷酶處理之后對(duì)釋放的碳水化合物進(jìn)行FACE分析來鑒定。糖蛋白在血液中的循環(huán)壽命(circulatorylifetime)很大程度取決于它的N-連接碳水化合物基團(tuán)的組成和結(jié)構(gòu)。該事實(shí)與打算經(jīng)腸胃給藥的治療性糖蛋白直接相關(guān)。一般來說，糖蛋白的最大循環(huán)半衰期要求它的N-連接碳水化合物基團(tuán)以序列NeuAc-Gal-GlcNAc終止。如果沒有末端唾液酸(NeuAc)，糖蛋白通過涉及潛在的N-乙酰半乳糖胺(GaINAc)或半乳糖(Gal)殘基的識(shí)別的機(jī)制,迅速從血液中清除掉(Goocheeetal.(1991)Biol/Technology9:1347-1355)。由于該原因，確保在治療性糖蛋白的N-連接碳水化合物基團(tuán)上存在末端唾液酸，對(duì)于它們的商業(yè)開發(fā)是重要的考慮因素。循環(huán)中的糖蛋白被暴露于能去除末端唾液酸殘基的唾液酸酶(或神經(jīng)氨酸苷酶)。通常，唾液酸的去除暴露半乳糖殘基，這些殘基被肝細(xì)胞中的半乳糖特異性受體識(shí)別并結(jié)合(綜述于AshwellandHarford(1982)Ann.Rev.Biochem.51:531)月干臟也含有其他的糖特異性受體，其介導(dǎo)糖蛋白從循環(huán)中的清除。此類受體的特異性也包括N-乙酰葡糖胺、甘露糖、海藻糖和磷酸甘露糖。通過肝細(xì)胞的半乳糖受體而被清除的糖蛋白經(jīng)歷實(shí)質(zhì)性的降解作用，然后進(jìn)入膽汁；通過Kupffer細(xì)胞的甘露糖受體而被清除的糖蛋白進(jìn)入網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(綜述于AshwellandHarford(1982)Ann.Rev.Biochem.51:53)如本文中所使用的，中性活性是指在pH5和8之間，在鹽小于150mM和緩沖強(qiáng)度小于50mM的條件下，sHASEGP糖蛋白在體外對(duì)糖胺聚糖底物具有催化活性。如本文中所使用的，穩(wěn)定的溶液是指在室溫保存30天之后，保留大于60%的最初活性的sHASEGP。如本文中所使用的，除非另外特別指出，單位用池度降低單位(turbidityreducingunits,TRU)來表示。一個(gè)TRU被定義為降低透明質(zhì)酸的酸化溶液的池度所需要的透明質(zhì)酸酶活性的量，并等同于U.S.P./NationalFormulary(NFXIII)units(NFU)。本文中描述的ELISA樣酶分析可以通過經(jīng)U.S.P.標(biāo)準(zhǔn)化的透明質(zhì)酸酶樣品(例如USP或WHO標(biāo)準(zhǔn))的標(biāo)準(zhǔn)曲線而與TRU、NFU和U.S.P.單位相關(guān)聯(lián)。因此，用ELISA樣酶分析測(cè)定的酶活性實(shí)際上是相對(duì)TRU，因?yàn)槊富钚圆皇怯脻岫扔?jì)分析實(shí)際測(cè)量得到的(Dorfmanetal.，1948，J.Biol.Chem.172:367)。如本文中所使用的，效價(jià)(potency)是用在體外降解底物所需要的sHASEGP蛋白的量來定義的，其基于池度降低單位或相對(duì)池度降低單位(RelativeTurbidityReducingUnit)。如本文中所使用的，比活性是指每毫克蛋白質(zhì)的活性的單位數(shù)。sHASEGP蛋白的量定義為在280nm處sHASEGP溶液的吸光度，假定摩爾消光系數(shù)為近似I.7，單位為ΜΑπΓ1。聚乙二醇(PEG)已經(jīng)被廣泛用于生物材料、生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)中，主要是因?yàn)镻EG是生物可相容的、無毒的、無免疫原性的和水溶性的聚合物(ZhaoandHarris,ACSSymposiumSeries680:458-72,1997)在藥物傳送領(lǐng)域，PEG衍生物已經(jīng)被廣泛用于共價(jià)附著到蛋白質(zhì)(即"聚乙二醇化作用")，以減少免疫原性、蛋白水解和腎清除，并增強(qiáng)溶解性(Zalipsky，Adv.DrugDel.Rev.16:157-82，1995)。類似地，PEG已經(jīng)被附著到低分子量的、相對(duì)疏水的藥物上，以增加溶解性、減少毒性和改變生物分布(biodistribution)。通常，PEG化的藥物作為溶液被注射。緊密相關(guān)的應(yīng)用是合成交聯(lián)的可降解的PEG網(wǎng)絡(luò)或制劑以用于藥物傳送，用于設(shè)計(jì)可降解的可溶性藥物載體的化學(xué)的許多方面也可以用于設(shè)計(jì)可降解的凝膠(Sawhneyetal.,Macromolecules26:581-87,1993)。還知道，大分子間的復(fù)合體可以通過混合兩種互補(bǔ)的聚合物的溶液而形成。此類復(fù)合體一般通過所涉及的聚合物之間的靜電相互作用(聚陰離子-聚陽離子)和/或氫鍵(聚酸-聚堿)，和/或通過在水環(huán)境中聚合物之間的疏水相互作用而得以穩(wěn)定(Krupersetal.,Eur.PolymJ.32:785-790，1996)。例如，聚丙烯酸(PAAc)和聚氧乙烯(PEO)的混合溶液在合適的條件下，主要基于氫鍵而形成復(fù)合體。這些復(fù)合體在生理?xiàng)l件的解離作用已經(jīng)被用于傳送游離的(即，非PEG化的)藥物。此外，互補(bǔ)聚合物的復(fù)合體已經(jīng)由均聚物和共聚物形成?！ぴ谝粋€(gè)方面，聚乙二醇的分子量在約3kD至約50kD范圍內(nèi)，優(yōu)選約5kD至約30kD范圍內(nèi)。通過已知的化學(xué)合成技術(shù)可將PEG共價(jià)附著到藥物(稱為“PEG化”或“聚乙二醇化”)。例如，在本發(fā)明的一個(gè)方面，蛋白質(zhì)的PEG化可以通過在合適的反應(yīng)條件下，通過將NHS活化的PEG與蛋白質(zhì)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)。盡管已經(jīng)描述了無數(shù)的關(guān)于PEG化作用的反應(yīng)，那些最經(jīng)常使用的反應(yīng)是賦予了方向性、使用溫和的反應(yīng)條件、并且不需要大量的下游工藝來去除毒性催化劑或副產(chǎn)物的反應(yīng)。例如，單甲氧PEG(mPEG)只有一個(gè)活性末端羥基，因此它的使用一定程度地限制了所得到的PEG-蛋白產(chǎn)物混合物的異質(zhì)性。與末端甲氧基基團(tuán)相反的聚合物末端的羥基的激活通常是獲得有效的蛋白質(zhì)PEG化作用所必需的，目的是使得衍生的PEG更容易遭受親核攻擊。攻擊性的親核試劑通常是賴氨酰殘基的ε-氨基基團(tuán)，但是其他的胺也可以反應(yīng)(例如組氨酸的N-末端α-胺或環(huán)胺)，如果局部條件是有利的話。在含有單個(gè)賴氨酸或半胱氨酸的蛋白質(zhì)中可能發(fā)生更為定向的附著。后一殘基可以被PEG-馬來酰亞胺作為目標(biāo)，用于硫醇特異性的修飾?？蛇x擇地，PEG酰肼可以與高碘酸鹽氧化的sHASEGP反應(yīng)，并在NaCNBH3存在的條件下被還原。更特別地，PEG化的CMP糖可以與sHASEGP在合適的糖基轉(zhuǎn)移酶存在的條件下發(fā)生反應(yīng)。一種技術(shù)是“聚乙二醇化作用”技術(shù)，其中，許多聚合物分子被偶聯(lián)到被研究的多肽上。當(dāng)使用該技術(shù)時(shí)，免疫系統(tǒng)難以識(shí)別形成抗體所需的多肽表面上的表位，從而減少免疫應(yīng)答。對(duì)直接引入人體循環(huán)系統(tǒng)以給予特定的生理效應(yīng)的多肽(即藥品)，典型的潛在免疫應(yīng)答是IgG和/或IgM應(yīng)答，而通過呼吸系統(tǒng)吸入的多肽(即工業(yè)多肽)潛在地可以引起IgE應(yīng)答(即過敏應(yīng)答)。解釋減少的免疫應(yīng)答的理論之一是聚合物分子掩蔽了多肽表面上的表位，而正是這些表位對(duì)導(dǎo)致抗體形成的免疫應(yīng)答負(fù)有責(zé)任。另一理論或至少部分因素是共軛物越重，所能獲得的免疫應(yīng)答的減少程度越大。偶聯(lián)到多肽的聚合物分子可以是任何合適的聚合物分子，具有依據(jù)本發(fā)明所限定的分子量，包括天然的和合成的均聚物，諸如多元醇(即聚-0H)、聚胺(即聚-NH2)和聚羧酸(即聚-C00H)，以及進(jìn)一步地，雜聚物，即包括一個(gè)或多個(gè)不同的偶聯(lián)基團(tuán)如羥基基團(tuán)或胺基團(tuán)的聚合物。合適的聚合物分子的例子包括選自下列的聚合物分子聚環(huán)氧烷烴(ΡΑ0)，諸如聚亞烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇、PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)支鏈聚乙二醇(PEGs)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-D，L-氨基酸、聚乙烯順丁烯二酸酸酐共聚物、聚苯乙烯蘋果酸酸酐共聚物、葡聚糖包括羧甲基-葡聚糖、肝素、同源白蛋白、纖維素，包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羧乙基纖維素和羥丙基纖維素，殼聚糖的水解物，淀粉諸如羥乙基-淀粉和羥丙基-淀粉、糖原、瓊脂糖和其衍生物，瓜爾豆膠、短醒霉多糖、菊糖、黃原膠、卡拉膠、果膠、海藻酸水解產(chǎn)物和生物多聚物。優(yōu)選的聚合物分子是無毒性的聚合物分子，諸如(m)聚乙二醇(mPEG)，進(jìn)一步地，它們需要相對(duì)簡(jiǎn)單的化學(xué)過程便能夠共價(jià)偶聯(lián)到酶表面上的附著基團(tuán)。常見的聚環(huán)氧烷烴(PAO)，諸如聚環(huán)氧乙烷，例如PEG，特別是mPEG，是優(yōu)選的聚合物分子，這是因?yàn)檫@些聚合物分子相比起多糖例如葡聚糖、短醒霉多糖和類似物，具有更少的能夠發(fā)生交聯(lián)的活性基團(tuán)，而交聯(lián)是不利的。B.sHASEGP的組織表達(dá)情況盡管先前認(rèn)為sHASEGP是睪丸特異性的，但當(dāng)使用更靈敏的技術(shù)如RT-PCR時(shí)，發(fā)現(xiàn)人sHASEGP表達(dá)在人的多種組織中。sHASEGP轉(zhuǎn)錄物被發(fā)現(xiàn)于髓質(zhì)(腦)、微血管內(nèi)皮、前列腺、胸、視網(wǎng)膜、收集的人黑素細(xì)胞、胎兒心臟和懷孕子宮中。sHASEGP也表達(dá)在生殖細(xì)胞腫瘤中。sHASEGP轉(zhuǎn)錄物的RT-PCR檢測(cè)通常是檢測(cè)在除睪丸之外的組織中的水平所必需的。C.sHASEGP酶活性的分析透明質(zhì)酸酶活性的濁度法微量滴定測(cè)定透明質(zhì)酸酶活性可以通過修飾的濁度法分析在酸化的血清溶液中進(jìn)行檢測(cè)。所需要的試劑如下JU作灌冼的UV火睛的2X去離f水或尤I為水iraunR5000-01HylumedMedical-透明成酸鈉，GeniymeAdvmiced4876BiomateriaIs透明質(zhì)酸_參考極難Up31200乙酸鉀，粒狀，USP,ACSJTBaker2914-01^冰fill酸，99+%SigmaA-6283.....:.......麗-麗-USP；—麗MallinkrodtTm權(quán)利要求1.純化的透明質(zhì)酸酶糖蛋白，其中所述糖蛋白包含至少一個(gè)糖部分，所述糖部分共價(jià)連接于所述透明質(zhì)酸酶多肽的天冬酰胺(N)殘基上；所述糖蛋白由與如下多肽具有至少98%氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成，所述多肽由SEQIDNO.4顯示的氨基酸序列組成，所述SEQIDNO.4顯示的氨基酸序列是SEQIDNO.I的氨基酸殘基36-483；所述糖蛋白是可溶性的；以及所述糖蛋白是中性活性的。2.如權(quán)利要求I所述的純化的透明質(zhì)酸酶糖蛋白，其包含透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，所述透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域由SEQIDNO:I的殘基36-464組成。3.如權(quán)利要求I所述的純化的透明質(zhì)酸酶糖蛋白，其中所述多肽在CHO細(xì)胞中被分泌。4.如權(quán)利要求I所述的純化的透明質(zhì)酸酶糖蛋白，其中，所述的糖部分被共價(jià)連接到天冬酰胺殘基上，所述天冬酰胺殘基選自SEQIDNO.I中所示的氨基酸82、166、235、254、368或393。5.如權(quán)利要求I所述的透明質(zhì)酸酶糖蛋白，由與如下多肽具有至少99%序列同一性的氨基酸序列組成，所述多肽由SEQIDNO.4顯示的氨基酸序列組成。6.如權(quán)利要求5所述的純化的透明質(zhì)酸酶糖蛋白，其包含透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域，所述透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)域由SEQIDNO:I的殘基36-464組成。7.純化的透明質(zhì)酸酶糖蛋白，其中所述糖蛋白包含至少一個(gè)糖部分，所述糖部分共價(jià)連接于所述透明質(zhì)酸酶多肽的天冬酰胺(N)殘基上；所述糖蛋白包含SEQIDNO:I的殘基36-464，并且在選自SEQIDNO:I的殘基477、478、479、480、481、482或483的殘基處被截短；所述糖蛋白是可溶性的；以及所述糖蛋白是中性活性的。8.如權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的透明質(zhì)酸酶糖蛋白多肽，其中，所述多肽用聚合物修飾。9.如權(quán)利要求8所述的透明質(zhì)酸酶糖蛋白多肽，其中，所述聚合物是PEG或葡聚糖。10.組合物，其包括權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的透明質(zhì)酸酶糖蛋白。11.組合物，其包括權(quán)利要求8所述的透明質(zhì)酸酶糖蛋白。12.核酸分子，其包括編碼權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的透明質(zhì)酸酶糖蛋白多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括終止密碼子，由此，在細(xì)胞中表達(dá)和分泌后，權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的多肽被產(chǎn)生。13.如權(quán)利要求12所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列編碼用于分泌所述被編碼多肽的信號(hào)序列。14.如權(quán)利要求13所述的核酸分子，其中所述信號(hào)序列是IgGK鏈前導(dǎo)肽。15.如權(quán)利要求14所述的核酸分子，其中所述IgGK鏈前導(dǎo)肽具有SEQIDNO:43所示的核苷酸序列。16.載體，其包含權(quán)利要求12所述的核酸分子。17.如權(quán)利要求16所述的載體，其包含SEQIDNO:51中所示的核苷酸序列。18.如權(quán)利要求16所述的載體，其為表達(dá)載體。19.如權(quán)利要求16所述的載體，其為真核生物載體。20.如權(quán)利要求16所述的載體，其包括核苷酸序列，該核苷酸序列指導(dǎo)由有效連接到其上的核苷酸序列編碼的任何多肽的分泌。21.如權(quán)利要求16所述的載體,其為畢赤酵母(Pichia)載體、大腸桿菌(E.coli)載體或病毒載體。22.分離的細(xì)胞，其包含權(quán)利要求16所述的載體。23.如權(quán)利要求22所述的細(xì)胞，其為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。24.如權(quán)利要求22所述的細(xì)胞，其選自細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。25.如權(quán)利要求22所述的細(xì)胞，其為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。26.如權(quán)利要求25所述的細(xì)胞，其為中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。27.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的可溶性透明質(zhì)酸酶糖蛋白多肽的方法，包括將被有效地連接于啟動(dòng)子的、編碼權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的多肽的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，所述細(xì)胞將N-連接的糖部分整合到所述多肽中；在被編碼的多肽被所述細(xì)胞表達(dá)和分泌的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞；和回收所述的被表達(dá)的多肽。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中，真核細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。31.用于產(chǎn)生可溶性透明質(zhì)酸酶多肽的方法，包括在被編碼的多肽被細(xì)胞表達(dá)和分泌的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求22所述的細(xì)胞；和回收所述的被表達(dá)的多肽。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述細(xì)胞在適合于產(chǎn)生所述多肽的條件下、在O.I-ImM丁酸鈉存在下被培養(yǎng)。33.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的透明質(zhì)酸酶多肽糖蛋白。34.權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其包含藥物載體。35.如權(quán)利要求33所述的藥物組合物，進(jìn)一步包含藥物活性試劑。36.如權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其中，所述藥物活性試劑選自化療劑、止痛劑、抗炎劑、抗微生物劑、抗阿米巴蟲劑、殺毛滴蟲劑、抗帕金森劑、抗痢疾劑、抗痙攣劑、抗抑郁劑、抗風(fēng)濕劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、退熱劑、抗寄生蟲劑、抗組胺劑、α-腎上腺素激動(dòng)齊U、α封阻劑、麻醉劑、支氣管擴(kuò)張劑、殺生物劑、殺菌劑、抑菌劑、β腎上腺素封阻劑、鈣通道封阻劑、心血管藥劑、避孕藥劑、解充血藥劑、利尿劑、鎮(zhèn)靜劑、診斷試劑、電解質(zhì)試劑、催眠藥劑、激素、促血糖增高藥劑、肌松弛劑、肌收縮劑、眼用藥劑、擬副交感神經(jīng)藥、心理興奮齊U、鎮(zhèn)定劑、擬交感神經(jīng)藥、安定劑、泌尿劑、陰道用藥劑、殺病毒劑、維生素藥劑、非類固醇類抗炎藥劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、藥物、有機(jī)分子和促睡眠劑。37.如權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其中，所述藥物活性試劑選自胰島素、細(xì)胞因子、抗體和單克隆抗體。38.如權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其中，所述藥物活性試劑是化療劑，所述化療劑是毒素或腫瘤壞死因子。39.如權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其中，所述藥物活性試劑是麻醉劑，所述麻醉劑是利多卡因或布比卡因。40.如權(quán)利要求35所述的藥物組合物，進(jìn)一步包括激素試劑。41.如權(quán)利要求40所述的藥物組合物，其中，所述激素試劑是腎上腺素。42.如權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其為凍干粉末或?yàn)橐后w。43.共軛物，其包括如權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)所述的可溶性多肽或包括如權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的可溶性多肽的結(jié)構(gòu)域。44.如權(quán)利要求33所述的藥物組合物，用于治療糖胺聚糖過量、用于治療腫瘤、用于治療心血管紊亂、用于增加化療劑向?qū)嶓w瘤中的滲透、用于誘導(dǎo)玻璃體液液化、用于促進(jìn)壞死組織的血管再造、或用于將尺寸小于500nm的分子傳送給含有過量糖胺聚糖的組織。45.權(quán)利要求44所述的藥物組合物，其中所述的過量的糖胺聚糖底物由瘢痕組織產(chǎn)生。46.權(quán)利要求44所述的藥物組合物，其中所述瘢痕組織是由脊髓損傷引起的神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕，是手術(shù)的結(jié)果，或是瘢痕瘤瘢痕。47.權(quán)利要求44所述的藥物組合物，其中所述底物與椎間盤突出有關(guān)。48.如權(quán)利要求33所述的藥物組合物在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療糖胺聚糖過量、用于治療腫瘤、用于治療心血管紊亂、用于增加化療劑向?qū)嶓w瘤中的滲透、用于誘導(dǎo)玻璃體液液化、用于促進(jìn)壞死組織的血管再造、或用于將尺寸小于500nm的分子傳送給含有過量糖胺聚糖的組織。49.如權(quán)利要求48所述的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用用于治療由瘢痕組織產(chǎn)生的過量的糖胺聚糖底物。50.如權(quán)利要求49所述的應(yīng)用，其中，所述的瘢痕組織是由脊髓損傷引起的神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕，是手術(shù)的結(jié)果，或是瘢痕瘤瘢痕。51.如權(quán)利要求49所述的應(yīng)用，其中，所述底物與椎間盤突出有關(guān)。全文摘要本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)新的可溶性中性活性透明質(zhì)酸酶糖蛋白(sHASEGP's)、制備方法，和它們幫助其他分子的給藥或者緩解糖胺聚糖相關(guān)的病理的用途。描述了可溶性中性活性sHASEGP結(jié)構(gòu)域的最小化的活性多肽結(jié)構(gòu)域，其包括對(duì)于功能性的中性活性透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)域而言所必需的天冬酰胺-連接的糖部分。本發(fā)明包括了經(jīng)修飾的可增強(qiáng)sHASEGP的分泌的氨基末端前導(dǎo)肽。本發(fā)明進(jìn)一步包括重組sHASEGP的唾液酸化和聚乙二醇化形式，以增強(qiáng)其穩(wěn)定性和血清藥物動(dòng)力學(xué)，使其優(yōu)于天然發(fā)生的來自屠宰場(chǎng)的酶。進(jìn)一步描述了基本上純的重組sHASEGP糖蛋白的合適制劑，所述的重組sHASEGP糖蛋白來自于可產(chǎn)生適當(dāng)?shù)奶腔恼婧思?xì)胞，而該糖基化對(duì)于該蛋白的最佳活性是必需的。文檔編號(hào)C12N9/00GK102943067SQ201210442499公開日2013年2月27日申請(qǐng)日期2004年3月5日優(yōu)先權(quán)日2003年3月5日發(fā)明者L·H·布賓楓,A·昆度,G·I·弗羅斯特申請(qǐng)人:海洋酶公司