一種血小板抗體檢測的免疫納米磁珠酶聯(lián)免疫檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，特別是涉及一種血小板抗體檢測的免疫納米磁珠酶聯(lián)免疫檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血小板表面具有復(fù)雜的血型抗原,包括ABO抗原、HLA-1抗原及HPA抗原(存在于血小板膜糖蛋白GP II b/IIIa，GP I a/ II a, GP I b/ IX上)。這些抗原均可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗血小板抗體,使血小板遭破壞，導(dǎo)致患者血小板減少而出現(xiàn)紫癜、出血甚至死亡，引發(fā)的臨床相關(guān)疾病包括腫瘤、白血病、特發(fā)性血小板減少癥、新生兒血小板減少癥及血小板輸注無效等。
[0003]血小板輸血是目前治療血小板減少癥和上述多種疾病的最主要手段之一。大量研究結(jié)果表明，患者輸注血小板前進(jìn)行抗體檢測和交叉配型以篩選相容性的血小板進(jìn)行輸注，輸血有效率大于70%,而僅ABO血型相同的隨機(jī)輸注血小板有效率低于30%。這不僅僅浪費了寶貴的血液,而且不相容血小板使病人體內(nèi)生成血小板抗體,導(dǎo)致免疫反應(yīng),造成輸血無效，患者也幾乎無例外地病情加重。
[0004]目前在英國、法國和美國等少數(shù)發(fā)達(dá)國家，臨床一般應(yīng)用昂貴的試驗程序、繁雜的HLA和血小板基因分型技術(shù)對患者HLA-1基因和血小板血型即HPA基因全系列譜抗原基因定型，選擇合適血型的獻(xiàn)血員血小板，之后再對少數(shù)患者應(yīng)用。
[0005]而在我國，至今沒有建立血小板獻(xiàn)血員庫，臨床很難開展血型基因型相容性血小板輸血，只有少數(shù)臨床機(jī)構(gòu)采用血清學(xué)方法進(jìn)行血小板抗體檢測和交叉配型，但效果仍不理想。其主要原因在于現(xiàn)有檢測方法仍存在諸多缺點和不足，如血小板抗體檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”方法-單克隆抗體固著血小板抗原分析技術(shù)(The monoclonal antibody immobilizat1nof platelet antigen assay, MAIPA)需要將血小板裂解,易引起抗原結(jié)構(gòu)破壞而出現(xiàn)抗體漏檢，同時操作步驟繁瑣，樣本檢測量受限。而常見的紅細(xì)胞免疫吸附試驗(solid-phasered cell adherence, SPRCA)對實驗操作人員技術(shù)要求高,弱陽性結(jié)果有時難以判定,并且所采用的指示紅細(xì)胞保存時間短，難以推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種血小板抗體檢測的免疫納米磁珠酶聯(lián)免疫檢測方法，該檢測方法簡便、高效，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是:提供一種血小板抗體檢測的免疫納米磁珠酶聯(lián)免疫檢測方法，包括步驟為:(I)將磁化血小板與待檢樣本混合反應(yīng)；(2)用磁力分離步驟(I)中已反應(yīng)的磁化血小板并洗滌；(3)加入酶標(biāo)抗人二抗反應(yīng)；(4)加入底物顯色并終止反應(yīng)，得到檢測結(jié)果。
[0008]在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(I)中所述磁化血小板是免疫納米磁珠通過抗人血小板單克隆抗體與血小板結(jié)合得到的。
[0009]在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(I)中所述免疫納米磁珠的制備過程為:在Fe3O4納米磁性顆粒表面包覆S1 2層得到Fe 304@Si02微球，通過硅烷化反應(yīng)對Fe 304iSi02微球的表面修飾氨丙基三甲氧基硅烷(NH2-CH2-CH2-CH2-Si (0CH3)3> APS)得到免疫納米磁珠，所述Fe3O4納米磁性顆粒是通過高溫?zé)峤夥ê铣傻模鯢e 304納米磁性顆粒的大小為50-200nm且是飽和磁化強(qiáng)度。
[0010]在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(I)中所述磁化血小板的濃度為100~200X 109/L,加樣體積為50~100 μ L0
[0011]在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(I)中所述待檢樣本為患者的血清或血漿，加樣體積為50~100μ L。
[0012]在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(2 )中所述磁力為磁棒或磁粒板所具有的磁力，所述洗滌是用含體積分?jǐn)?shù)為0.03-0.06%的Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌。
[0013]在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(2)中所述酶標(biāo)抗人二抗為羊抗人IgG、兔抗人IgG或雞抗人IgG，所述酶標(biāo)抗人二抗中采用的標(biāo)記物為辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸BI(AP)0
[0014]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述酶標(biāo)抗人二抗中采用的標(biāo)記物為堿性磷酸酶，所述堿性磷酸酶是通過戊二醛法或過碘酸法交聯(lián)在抗人二抗Fe段得到的。
[0015]在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(4)中所述顯色用的底物為0.5-1.5mg/mL的4-硝基苯磷酸二鈉(PNPP)，所述終止采用的終止液為2~3mol/L的NaOH溶液，所述檢測結(jié)果的測定為:終止反應(yīng)后，測定OD值，根據(jù)公式臨界值(C.0.)=陰性對照平均A值+0.09判定，若待檢樣本A值>臨界值(C.0.)為血小板抗體陽性，待檢樣本A值<臨界值(C.0.)為血小板抗體陰性。
[0016]在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟(I)至(4)中反應(yīng)條件為在37°C下反應(yīng)30?40mino
[0017]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的血小板抗體檢測的免疫納米磁珠酶聯(lián)免疫檢測方法，檢測過程簡便、高效，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，對臨床診斷血小板相關(guān)免疫性疾病和預(yù)防血小板輸注無效具有較高的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0018]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1為免疫納米磁珠的表征結(jié)果圖，a為SEM電鏡圖、b為粒徑分布圖、c為紅外光譜圖；
圖2為血小板和磁化血小板的SEM電鏡圖，a為血小板的SEM電鏡圖、b為磁化血小板的SEM電鏡圖。
【具體實施方式】
[0019]下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0020]實施例一:抗人血小板單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立及單抗的制備與純化一、小鼠免疫
1、采集新鮮O型全血，900rpm離心1min,提取上層富血小板血衆(zhòng)。然后3800rpm離心lOmin，棄上清，留取壓積血小板，用0.0lM PBS緩沖液(含0.5% EDTA)洗滌2次并最終調(diào)節(jié)血小板濃度至108/mL。
[0021]2、取0.5 ml上述血小板懸液通過腹腔、背部皮下等途徑多點免疫小鼠，共免疫4次，間隔期為10天。
[0022]3.融合前2天用0.2 ml血小板懸液經(jīng)鼠尾靜脈加強(qiáng)注射I次。
[0023]二、細(xì)胞融合
1、取免疫后的小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，并將小鼠脾細(xì)胞和培養(yǎng)好的NSl骨髓瘤細(xì)胞按體積比為10:1的比例混合。
[0024]2、采用質(zhì)量比50% PEG 4000作融合劑，將小鼠脾細(xì)胞和NSl骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融八口 ο
[0025]3、融合細(xì)胞懸于含體積比為20%新生牛血清的選擇培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)數(shù)日。
[0026]三、克隆篩選
1、將兔抗人血小板多抗用0.05M pH為9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至10 μ g/ml，包被酶標(biāo)板10yL/孔，在4°C下過夜。
[0027]2、次日用含體積分?jǐn)?shù)為0.03-0.06%的Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌5次，控干。
[0028]3、加入50 μ L/孔O型血小板懸液，200g離心5min后洗滌3次。
[0029]4、加入待檢的細(xì)胞培養(yǎng)上清，37°C下孵育后采用間接ELISA法進(jìn)行檢測。
[0030]5、Cutoff值設(shè)為陰性對照值的2.1倍，高于Cutoff值為陽性結(jié)果。
[0031]6、選取檢測結(jié)果陽性孔內(nèi)的融合細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法進(jìn)行多次單克隆培養(yǎng)。待單細(xì)胞生長成亞克隆后再進(jìn)行測定，陽性克隆擴(kuò)大后液氮冷凍保存。
[0032]四、單抗制備及純化
1、培養(yǎng)經(jīng)克隆篩選的雜交瘤細(xì)胞株，注射至經(jīng)致敏的小鼠腹腔內(nèi)，每只約106個細(xì)胞。
[0033]2、觀察小鼠腹腔，并在約5~10天內(nèi)采集小鼠腹水。
[0034]3、取小鼠腹水，邊攪拌邊緩慢加入等體積比的飽和硫酸銨溶液，攪拌Ih后在4°C下靜置過夜。