一種真菌毒素檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建方法、真菌毒素檢測(cè)方法、試劑盒及裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)學(xué)組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種真菌毒素檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu) 建方法、真菌毒素檢測(cè)方法、試劑盒及裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 真菌毒素（mycotoxin)是由某些真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，目 前已知的種類(lèi)有300多種，有30多種真菌毒素對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物有強(qiáng)毒性，包括黃曲霉毒素、玉 米赤霉締酬、嘔吐毒素、髓曲毒素和伏馬毒素等，該些毒素可廣泛污染食物、農(nóng)作物及其制 品等。產(chǎn)毒真菌污染食品后，可使食用者中毒，有些毒素可W誘導(dǎo)基因突變和產(chǎn)生致癌性， 有些則顯示出對(duì)特定器官的毒性。
[0003] 用來(lái)檢測(cè)真菌毒素的常用方法有LC-MS、GC-MS、HPLC等，但是該幾種方法檢測(cè)步 驟相對(duì)繁瑣，對(duì)儀器要求較高，不適合大量樣本的快速檢測(cè)。近年來(lái)應(yīng)用最廣泛的是酶聯(lián)免 疫吸附測(cè)定方法巧LISA)，該方法具有敏感、特異、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，適合真菌毒素的檢測(cè)。 但是，在化ISA檢測(cè)過(guò)程中，需要添加毒素標(biāo)準(zhǔn)品，增加了檢測(cè)人員被毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)。同 時(shí)需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算過(guò)程較復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)。
[0004] 因此，有必要提供一種能簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)真菌毒素的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種真菌毒素檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建方 法、真菌毒素檢測(cè)方法、試劑盒及裝置。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建真菌毒素檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，聯(lián)合單標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)人員 只需使用本發(fā)明提供的不含毒素的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，即可完成對(duì)待測(cè)樣品的檢測(cè)；相對(duì)傳統(tǒng) ELISA檢測(cè)技術(shù)來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供的技術(shù)方案不再需要使用含有毒素的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)，在 保證準(zhǔn)確度和靈敏度的同時(shí)，大大提高了 ELISA檢測(cè)技術(shù)的可操作性、減少了檢測(cè)試劑的 使用，具有簡(jiǎn)便、省時(shí)、快速、實(shí)用、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了一種真菌毒素檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[000引 （1)提供或配置N種真菌毒素的系列標(biāo)準(zhǔn)品，每種真菌毒素的系列標(biāo)準(zhǔn)品包括M個(gè) 濃度梯度的溶液，其中，N、M均為自然數(shù)，且M不小于5 ;
[0009] 似取每個(gè)系列標(biāo)準(zhǔn)品分別采用ELISA檢測(cè)，其中，每個(gè)系列標(biāo)準(zhǔn)品均進(jìn)行S Rg+P 次ELISA檢測(cè)，對(duì)所得的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到N* (2 Rg+P)條標(biāo) 準(zhǔn)曲線(xiàn)，構(gòu)建成真菌毒素檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)；其中，Q表示化ISA檢測(cè)中的Q種影響因素，為第Q 種影響因素中設(shè)置了斬種變量，Q、R、P均為自然數(shù)，且Q不小于2 ;
[0010] P表示Q種影響因素各取隨機(jī)變量進(jìn)行P次檢測(cè)，每次P檢測(cè)時(shí)，在Q種影響因素 中隨機(jī)設(shè)置至少2種影響因素，第Q種影響因素設(shè)置了 R%種變量，各種影響因素的1?\種 變量進(jìn)行隨機(jī)組合，P = 2 (C。2)[巧'。)]，所述（C。2)表示在Q種影響因素中隨機(jī)設(shè)置至少 2種影響因素，（R%)表示第P次檢測(cè)時(shí)，選取的各影響因素的R\的乘積，r為自然數(shù)， Z (C。2)[巧'。)]表示（C。2)種影響因素組合下的（R'。）之和。
[0011] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟（1)中，所述N種真菌毒素包括但不限于目前已知 的300多種真菌毒素。
[0012] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟（1)中，所述N種真菌毒素為糧食制品中真菌毒素 殘留。
[0013] 在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟（1)中，所述N種真菌毒素包括黃曲霉毒素、 玉米赤霉締酬、嘔吐毒素、髓曲毒素、伏馬毒素、T2毒素、椿曲霉素和展青霉素的至少一種。
[0014] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟（1)中，所述M為5?8的自然數(shù)。
[0015] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟（1)中，所述M為5或6。
[0016] 如本發(fā)明所述的，所述步驟（2)中，"Q種影響因素"為傳統(tǒng)化ISA檢測(cè)中，制備標(biāo) 準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)影響整個(gè)反應(yīng)體系OD值的因素，包括但不限于反應(yīng)體系的操作時(shí)間（比如變化解 育的時(shí)間或顯色的時(shí)間）、解育溫度（比如樣品和抗體的解育時(shí)間、顯色液的解育時(shí)間）、加 樣時(shí)間（每次加樣1?2min)、洗板方式（比如洗板的次數(shù)）W及試劑盒存放時(shí)間，其中，所 述反應(yīng)體系即化ISA間接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系，包括抗原或是二抗的包被、抗原抗體的反應(yīng)、顯色 反應(yīng)等常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟。
[0017] 如本發(fā)明所述的，所述步驟（2)中/%"表示不同影響因素設(shè)置了不同變量，比如， 影響因素Q為操作時(shí)間時(shí)，其他影響因素不變，設(shè)置操作時(shí)間為-18、-15、-12、-9、-6、-3、 0、3、6、9、12、15、18分鐘13個(gè)變量，則斬即為13,其中，負(fù)數(shù)表示比正常操作時(shí)間快（正常 操作時(shí)間為成品試劑盒給定的體系反應(yīng)時(shí)間，負(fù)數(shù)的絕對(duì)值表示快的時(shí)間），負(fù)數(shù)越大，表 示操作越快，花的時(shí)間越少；再比如，影響因素Q為加樣方式時(shí)，其他影響因素不變，設(shè)置加 樣方式為1)加完標(biāo)準(zhǔn)品W及其他試劑后，不震蕩混勻，2)加完標(biāo)準(zhǔn)品W及其他試劑后，輕 輕震蕩混勻，2個(gè)變量，則Rg即為2。
[001引如本發(fā)明所述的，所述步驟（2)中，"P"表示進(jìn)行P次檢測(cè)，每次檢測(cè)均隨機(jī)變換操 作時(shí)間（比如變化解育的時(shí)間或顯色的時(shí)間）、解育溫度（比如樣品和抗體的解育時(shí)間、顯 色液的解育時(shí)間）、加樣時(shí)間（每次加樣1?2min)、洗板方式（比如洗板的次數(shù)）W及試 劑盒存放時(shí)間中至少兩種影響因素的變量；比如，可W選取操作時(shí)間、解育溫度兩種影響因 素，隨意變化操作時(shí)間和解育溫度，其他影響因素不變，當(dāng)操作時(shí)間的變量為20、25、30分 鐘，解育溫度的變量為 35°C、36°C、37°C、38^4，P=Z(CQ2)[arQ)] = 2：a)[(3*4)] = 12次檢測(cè)，可獲得12條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
[0019] 需要注意的是：S (C。[巧'。)]中，（C。并不是要和[巧'。)]相乘，（C。是一個(gè) 標(biāo)識(shí)，表示的是有多少種組合，即巧％)要計(jì)算多少次，相應(yīng)的巧％)要求和（C。次。比如 上述距離中，（C。2)為1，即（R'。）只有1個(gè)值，12。
[0020] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟（2)中，所述線(xiàn)性回歸分析的方法為采用常規(guī)的 統(tǒng)計(jì)學(xué)中線(xiàn)性回歸分析的方法，可用excel完成。
[0021] 本發(fā)明提供的真菌毒素檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建方法，綜合考慮了檢測(cè)人員檢測(cè)習(xí)慣， 進(jìn)行多因素影響模擬實(shí)驗(yàn)，得到大量的檢測(cè)數(shù)據(jù)；其中，多因素影響包括操作時(shí)間、解育溫 度、加樣方式、加樣時(shí)間、洗板方式W及試劑盒存放時(shí)間等，該些因素來(lái)源于長(zhǎng)期的收集和 實(shí)驗(yàn)?zāi)M，最大程度地獲得了覆蓋面廣的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)集合。
[0022] 第二方面，本發(fā)明提供了 一種真菌毒素的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括試劑盒a 或試劑盒b，其中，
[002引試劑盒a包括；
[0024] (1)包被真菌毒素抗原的酶聯(lián)板；
[0025] (2)用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗；
[0026] (3)真菌毒素單克隆抗體或多克隆抗體；
[0027] (4)真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品0溶液a,所述真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品0溶液a中，真菌毒素的濃度 為0 y g/l，所述真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品0溶液a為含有血清白蛋白的磯酸鹽緩沖液；
[002引 （5)底物顯色液A液為過(guò)氧化氨或過(guò)氧化脈，底物顯色液B液為鄰苯二胺、四甲基 聯(lián)苯胺硫酸鹽或氨基水楊酸；
[0029] (6)終止液a為硫酸緩沖液或鹽酸緩沖液；
[0030] (7)洗漆液a為抑7.0?8.0,含有0. 1 %?0.5%吐溫20,0. 1 %?2%疊氮化鋼 的磯酸鹽緩沖液；
[0031] (8)抗體稀釋液為抑值7. 0?8. 0,含有2%?15%血清的磯酸鹽緩沖液；
[0032] (9)復(fù)溶液a為含有0. 5?2%小牛血清、5%?80%甲醇的磯酸鹽緩沖液；
[003引試劑盒b包括；
[0034] (1)包被二抗的酶聯(lián)板；
[0035] (2)用堿性磯酸醋酶標(biāo)記的真菌毒素抗原；
[0036] (3)真菌毒素單克隆抗體或多克隆抗體；
[0037] (4)真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品0溶液b，所述真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品0溶液b中，真菌毒素的濃度 為0 y g/l，所述真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品0溶液b為含有血清白蛋白的磯酸鹽緩沖液；
[003引 （5)底物顯色液b對(duì)硝基磯酸鹽緩沖液；
[0039] (6)終止液b為氨氧化鋼緩沖液；
[0040] (7)洗漆液b為PH 7.0?8.0,含有0.5%?2%吐溫20和0. 1 %?0.5%疊氮化 鋼的磯酸鹽緩沖液；
[0041] (8)復(fù)溶液b為含有30%?70%甲醇、0. 5%?2%血清的磯酸鹽緩沖液。
[00創(chuàng)優(yōu)選地，所述試劑盒a包括：
[0043] (1)包被真菌毒素抗原的酶聯(lián)板；
[0044] (2)用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗；
[0045] (3)真菌毒素單克隆抗體或多克隆抗體；
[0046] (4)真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品0溶a液，所述真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品0溶液a中，真菌毒素的濃度 為0 y g/l，所述真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品0溶液a為含有0. 5%?15%牛血清白蛋白的磯酸鹽緩沖 液。
[0047] (5)底物顯色液A液為過(guò)氧化氨或過(guò)氧化脈，底物顯色液B液為鄰苯二胺、四甲基 聯(lián)苯胺硫酸鹽或氨基水楊酸；
[0048] (6)終止液a為0. 1?0. 5mol/L硫酸緩沖液或鹽酸緩沖液；
[0049] (7)洗漆液a為抑7. 4,含有0. 1 %?0. 5%吐溫20,0. 5%疊氮化鋼的磯酸鹽緩沖 液；
[0050] 做抗體稀釋液為抑值7.0?8.0,