一種快速定量檢測髓過氧化物酶的均相熒光免疫試劑組及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體設(shè)及一種快速定量檢測髓過氧化物酶的均相巧光 免疫試劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[000引髓過氧化物酶（myeloperoxidase, MPO)是一種由活化的中性粒細胞、單核細胞、 巨瞻細胞分泌的相對分子質(zhì)量為150000的白細胞酶，是糖基化的四聚體的血紅素蛋白。多 形核嗜中性粒細胞是血管內(nèi)MP0最主要的細胞來源，分泌的MP0占全部細胞蛋白質(zhì)的4%， 占全部循環(huán)MP0含量的95%。MP0水平與中性粒細胞激活程度呈顯著的相關(guān)性，可作為中 性粒細胞的活化標(biāo)志物。
[0003] 目前已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在冠狀動脈粥樣硬化的斑塊中有大量具有MP0活性的中性粒 細胞巨瞻細胞的浸潤，提示其在粥樣斑塊的形成及進展中具有重要作用。已證實在急性冠 狀動脈綜合征（Acute coronary syn化omes，AC巧患者的易損斑塊中存在大量中性粒細胞 的浸潤。用免疫染色發(fā)現(xiàn)MP0大量聚集在早期動脈粥樣硬化病變富含脂質(zhì)區(qū)域的膽固醇裂 縫中。研究也證明在不穩(wěn)定斑塊中有許多含MP0陽性的巨瞻細胞，此型細胞積聚在腐蝕或 破裂斑塊中可導(dǎo)致ACS，而人脂質(zhì)條紋中的巨瞻細胞含少量或不含MP0。
[0004] 目前國際上已有兩個大型的臨床實驗揭示MP0是一個預(yù)測ACS等不良事件的強有 力的指標(biāo)，并且提示MP0作為一項炎癥指標(biāo)，它的變化是先于屯、肌的缺血性改變。從長遠而 言，該指標(biāo)的應(yīng)用將可W挽救許多常規(guī)檢查陰性或者是癥狀較輕然而病變很嚴(yán)重的患者。 對ACS患者研究發(fā)現(xiàn)與肌巧蛋白TCTnT)、C反應(yīng)蛋白（MP0)等指標(biāo)一樣，血漿MP0水平可W 獨立預(yù)測ACS患者屯、血管事件的發(fā)病危險。選擇1090例ACS患者，測量血漿MP0水平，并 進行了 6個月的隨訪，記錄非致命性屯、肌梗死和死亡事件，結(jié)果顯示，患者血漿MP0水平與 血漿化T、可溶性CD40配體、MP0水平W及ST段的改變無關(guān)。但隨著MP0水平升高（〉350g/ L，31. 3% )，患者發(fā)生觀察終點事件的風(fēng)險顯著增加.尤其對判斷TnT水平低于0. Olng/ml 的ACS患者的危險性意義更大
[0005] 采用前瞻性研究方法評價基線血漿MP0水平對胸痛患者屯、血管事件的預(yù)測價值。 研究人選了 604例胸痛發(fā)作2化內(nèi)就診的患者，從胸痛發(fā)作到就診的平均時間化。男性354 例，女性254例。就診時測定基線MP0、化T、MP0、肌酸激酶同工酶水平。并根據(jù)臨床及實驗 室檢查明確診斷。W年齡大于21歲，沒有冠狀動脈疾病臨床證據(jù)的115名志愿者為對照組 人群。預(yù)后評價指標(biāo)為主要不良屯、臟事件包括MI、再次梗死、必要的血運重建或死亡。通 過回顧醫(yī)療記錄和電話隨訪評價30d和6個月時的事件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病例組總體MP0水平比 對照組MP0顯著增加；就診后16h內(nèi)發(fā)生MI的患者比無MI患者基線MP0水平高，就診時無 明顯屯、肌壞死證據(jù)的患者，4-1化內(nèi)有TNT升高的患者比TNT持續(xù)陰性的患者，MP0明顯升 高；隨訪30d和6個月進行血運重建或發(fā)生主要不良屯、臟事件的患者與無并發(fā)癥的患者相 比，基線MP0水平升高，與570例存活的患者相比，死亡的34例患者MP0水平也升高。MP0 作為獨立風(fēng)險預(yù)測因子而言，整體人群和初始TnT陰性的患者，MI風(fēng)險隨著基線MPO四分位 數(shù)的增加而增加，MP0水平可作為30d和6個月時主要不良屯、臟事件的預(yù)測因子。研究TNT 陰性患者的臨床預(yù)后時發(fā)現(xiàn)，無屯、肌壞死證據(jù)的462例患者，隨訪30d及6個月時，發(fā)生主 要不良屯、臟事件組基線MP0水平比無事件組明顯升高。經(jīng)多因素校正分析，證實MP0水平 是30d和6個月主要冠狀動脈不良事件和血運重建的強獨立預(yù)測因子。此外在篩選試驗中 單獨應(yīng)用TnT可預(yù)測出58%主要不良屯、臟事件，但加上MP0預(yù)測準(zhǔn)確性則可達84. 5%。
[0006] 臨床實驗室MP0檢測一直采用酶聯(lián)免疫定量檢測方法，但操作步驟繁瑣，時間較 長，且需要多種檢測儀器設(shè)備，不利于ACS患者快速檢測和及時診治的臨床需求。目前發(fā)展 的金標(biāo)試紙檢測MP0的方法，雖然滿足了臨床快速檢測的要求，但不能實現(xiàn)定量檢測迫切 需求。因此，建立一種檢測時間盡量縮短，并且檢測除了能在實驗室進行外，還要求能夠進 行床旁檢測，同時能定量測定MP0的檢測方法，從而為臨床提供準(zhǔn)確的診斷依據(jù)，是十分必 要的。
[0007] 均相巧光分析法化omogeneous fluoroimmunoassay，HFIA)是在時間分辨巧光免 疫分析（time-resolued fluoroimmunoassay，TRFIA)技術(shù)的基礎(chǔ)上形成的一種新的巧光免 疫分析技術(shù)。TRFIA技術(shù)采用的巧光物質(zhì)與傳統(tǒng)的巧光染料完全不同，采用的是銅系元素 館巧U)、得（Tb)等作為巧光材料，靈敏度非常高，穩(wěn)定性好，低溫條件可保存=年，因而成 為二十一世紀(jì)最熱口的免疫分析技術(shù)。
[000引均相巧光免疫檢測法是用同一抗原的兩個抗體分別標(biāo)記化和巧光染料 Alexa647?；瘶?biāo)記抗體在游離狀態(tài)時，受到340nm光線激發(fā)，只發(fā)射平均波長為615nm 巧光，而在抗原、抗體復(fù)合物形成時，發(fā)生能量傳遞，激發(fā)巧光染料Alexa647發(fā)射出665nm 巧光。標(biāo)記抗體直接與待測樣品進行抗原、抗體反應(yīng)，如果能形成抗原、抗體復(fù)合物，則在 665nm出可測得巧光信號。該種方法省卻了酶聯(lián)免疫法反復(fù)解育和洗板等煩瑣操作步驟，幾 分鐘就能獲得結(jié)果，省時省力。并且，此法也相應(yīng)地避免了許多人為操作因素和試劑、環(huán)境 等外界因素的干擾，穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好，能較真實地反映被測物質(zhì)的含量。此外，Eu 3+和 Alexa647該對巧光物質(zhì)的最大發(fā)射光波長之間相差較大，未發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的本底巧光 值就非常低。而人血清中非特異性物質(zhì)產(chǎn)生的300-500nm巧光，不能激發(fā)Alexa647發(fā)射巧 光信號650nm激發(fā)光。因此非特異性巧光非常低。
[0009] 本發(fā)明采用均相巧光免疫快速檢測技術(shù)，利用巧光的高靈敏特點，同樣也避免了 膠體金或者巧光MP0干式免疫試紙中的硝酸纖維素膜本身孔隙不均一特性對檢測準(zhǔn)確度 和重復(fù)性的不良影響。由于均相巧光免疫檢測中樣品與巧光標(biāo)記抗體全過程都在液相中全 面接觸，反應(yīng)充分，因此可大幅度提高檢測靈敏度和線性范圍，同時反應(yīng)在液相進行也增加 了樣品的稀釋倍數(shù)，消除了樣品的基質(zhì)效應(yīng)影響，使定量結(jié)果有很好的可重復(fù)性，提高了定 量結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，可滿足臨床診斷大規(guī)模檢測的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有MP0檢測技術(shù)的不足，提供一種快速定量檢測MP0的 均相巧光免疫試劑組。本發(fā)明根據(jù)巧光免疫技術(shù)特點和MP0抗原抗體系統(tǒng)特點，設(shè)計新的 原材料，試劑和工藝流程，應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑組檢測MP0水平，具有簡單，快速，靈敏和 特異性好等特點，可同時定量檢測高值和低值樣品，并且性價比高，適用于臨床快速檢測。
[0011] 本發(fā)明的第一個方面是提供一種快速定量檢測髓過氧化物酶的均相巧光免疫試 劑組，包括稀±元素馨合物標(biāo)記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體（anti-MPO)、近紅外巧光化 合物標(biāo)記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體和系列濃度的髓過氧化物酶校準(zhǔn)品。
[0012] 優(yōu)選地，稀±元素馨合物為化馨合物。
[001 引更優(yōu)選地，稀±元素馨合物為 BHHCT-Eu3+或 1，2-二（1"，1"，1"，2"，2"，3"，3"-走 氣-4"，6"-己二酬-6"-基-對節(jié)基）-4-氯橫酷基苯與館（III)的配合物炬HHBCB-Eu3+)。
[0014] 優(yōu)選地，所述近紅外巧光化合物為Alexa系列近紅外巧光化合物、DyLi曲t系列近 紅外巧光化合物和CF系列近紅外巧光化合物中的至少一種。
[0015] 更優(yōu)選地，所述近紅外巧光化合物Alexa647、DyLi曲t-DY647和CF647中的至少一 種。
[0016] 優(yōu)選地，所述系列濃度的髓過氧化物酶校準(zhǔn)品由校準(zhǔn)品稀釋液稀釋髓過氧化物酶 配制而成，所述校準(zhǔn)品稀釋液為含0. 01-0. 5wt%陽G2000、l-5wt% BSA、0. 01-0. 05wt%表 面活性劑的磯酸鹽緩沖液。
[0017] 髓過氧化物酶校準(zhǔn)品可用塑料瓶密封包裝。
[001引本發(fā)明的第二個方面是提供本發(fā)明第一個方面所述的均相巧光免疫試劑組的制 備方法，包括W下步驟：
[0019] 1)稀±元素馨合物標(biāo)記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體的制備：
[0020] 取0. 5-5mg/ml的抗髓過氧化物酶單克隆抗體溶液，加入0. 05-0. 5mol/L的化肥化 溶液后，調(diào)抑至8. 5-10,滴加10-100 y g/ml配體化合物溶液，攬拌反應(yīng)0. 6-化，分離得 到配體化合物標(biāo)記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體，加入終濃度為0. 05-0. 5wt %的BSA和 0. 01-lwt %的NaNs，調(diào)抑至5. 5-6. 5,免疫分析前，加入Eu3+溶液，使配體化合物與化等 摩爾濃度，即得，其中，抗髓過氧化物酶單克隆抗體溶液、NaHC〇3溶液和配體化合物溶液的 體積比為 0. 1-1 : 1 : 0.01-0. 05 ;
[0021] 2)近紅外巧光化合物標(biāo)記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體的制備：
[0022] 將抗髓過氧化物酶單克隆抗體用0. 05-0. 5mol/L的NaHC〇3溶液稀釋至0. 5-5mg/ ml,加入近紅外巧光化合物溶解液，攬勻，室溫解育0. 5-化，分離得到近紅外巧光化合物標(biāo) 記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體；
[0023] 3)系列濃度的髓過氧化物酶校準(zhǔn)品的制備；
[0024] 將髓過氧化物酶用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋配制成系列濃度，即得，
[0025] 其中，1)、2)和3)的順序可W任意顛倒。
[0026] 其中，稀±元素馨合物標(biāo)記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體用于免疫分析時，用標(biāo) 記物稀釋液稀釋使用，2-8 °C分裝保存。
[0027] 其中，近紅外巧光化合物標(biāo)記的抗髓過氧化物酶單克隆抗體用磯酸鹽緩沖液稀 釋，2-6 °C保存。
[002引其中，髓過氧化物酶校準(zhǔn)品2-6°C保存。
[0029] 優(yōu)選地，抗髓過氧化物酶單克隆抗體在于配體化合物反應(yīng)之前，先進行透析處理。
[0030] 優(yōu)選地，步驟1)中配體化合物為BHHCT或BHHBCB。
[0031] 優(yōu)選地，步驟1)中分離得到配體化合物標(biāo)記的anti-MPO通過離屯、和柱層析方式 進行。柱層析采用Se地adexG-SO柱，0. 01-0. Imol/L畑4肥〇3(p服.0)洗脫。
[0032] 優(yōu)選地，步驟2)中，分離得到近紅外巧光化合物標(biāo)記的anti-MPO通過柱層析的方 式進行。
[0033] 進一步優(yōu)選地，步驟2)中，柱層析采用G25凝膠柱。
[0034] 優(yōu)選地，步驟2)中，室溫解育時，每隔10-20min混勻一次。
[0035] 本發(fā)明的均相巧光免疫試劑的使用；先將稀±元素馨合物標(biāo)記的anti-MPO溶液 加入反應(yīng)微孔中，再加入近紅外巧光化合