專利名稱：包被的珠的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用生物學分子包被珠的方法以及用生物學分子包被的珠。
背景技術：
診斷性免疫測定如酶聯免疫吸附測定(ELISA) 廣泛用于研究和工業(yè)，并且是許多診斷、臨床、生物化學、環(huán)境和遺傳應用的重要和靈敏的分析技術3，4。這些測定使用固定在固體支持物上的蛋白(例如，抗原和抗體)以及用生色、熒光、放射性和化學發(fā)光分子標記和/或與包括酶在內的充當報道物質的增強劑或底物的其他生物分子綴合的檢測蛋白。為了成功地制造具有大于幾天/幾周的延長保質期的免疫測定固體支持物，必需保持固定的靶抗原或抗體的物理完整性。這受到許多外部因素的影響，包括濕度、溫度、pH、鹽、金屬離子和其他污染物。例如蛋白是具有功能性三維結構的大柔性分子5。催化和/或結合位點區(qū)中氨基酸的空間排列取決于氨基酸互相之間的相互作用以及氨基酸與其他周圍分子的相互作用6Λ蛋白的獨特結構以及局部環(huán)境條件決定蛋白穩(wěn)定性。結合的性質以及這個系統中的其他分子影響免疫測定中非特異性結合的程度。因此，在這個初始水平使用的所有組分必須嚴格評價以確保沒有非特異性結合。此外，測定中使用的其他組分，包括樣品稀釋物、洗滌緩沖液和綴合的蛋白，同樣需要進行評價。添加某些蛋白和或去污劑可以顯著減少不期望的非特異性結合。在某些條件下，蛋白展開為非功能形式。暴露于高于一定限度的溫度會使得熱不穩(wěn)定蛋白展開并變性。高濃度的溶質、極端的pH、機械力和其他化學物質的存在是潛在的滅活劑。完全變性的蛋白缺少三級和二級結構，因而喪失或減少其在免疫測定中結合相應的反應物或被相應的反應物結合的能力。一級蛋白結構由特定氨基酸的線性序列組成。復雜結構通過折疊以形成二級、三級和最終的四級結構而產生，由此形成多肽鏈并相互作用9。氨基酸構件可以是親水和疏水的，更疏水的氨基酸聚集在球狀分子的內部，而親水或極性氨基酸集中在外部，這種排列導致在溶液中自發(fā)折疊1(U1。此外，靜電相互作用、氫鍵和范德華力均參與這個折疊過程。正確折疊確保適當的蛋白生物學活性，并且天然狀態(tài)的蛋白是最穩(wěn)定的12，13。因此，邏輯上在穩(wěn)定和保持蛋白的天然結構的環(huán)境中儲存和使用的蛋白會保留它們的功能和活性。儲存在溶液中的蛋白一般具有比干燥形式更短的保質期，這是由于它們以水合狀態(tài)持續(xù)與周圍的分子相互作用。干燥和冷凍最小化或中止這種相互作用，只要使用正確的穩(wěn)定條件，否則變性仍會發(fā)生。在溶液中，通常蛋白在高濃度和低溫下更穩(wěn)定。在低溫下，蛋白相互作用具有較少的動能。在較高的蛋白濃度下，較少的蛋白活性通過吸附至容器表面以及通過酶的作用和其他低水平污染物失活而喪失。通常去除蛋白來源中存在的任何蛋白水解酶(例如，水解酶和氧化酶)，因此用于包被和穩(wěn)定溶液的水通常具有高質量。許多制造這種類型的免疫測定的公司具有它們自己的包被和穩(wěn)定固體支持物的專利方法，并且因為可能希望一些表現比其他好，所以一般指導在出版的關于一般ELISA原理和應用的書中給出1’2?？贵w和抗原通常結合至微孔板的孔的內側并在室溫或4° C下溫育約12小時，在這個階段將過量的未結合原料吸出并加入封閉劑/穩(wěn)定劑，結合通常通過但不限于靜電力進行。需要時可以加入中間的洗滌步驟。名義上將封閉穩(wěn)定劑在室溫下溫育30分鐘以允許反應物結合至固體支持物上任何未被結合的位點，并且還與結合的抗體或抗原整合。在下一步中，去除過量的封閉劑/穩(wěn)定劑，從而試劑的物理膜覆蓋結合的蛋白。下一步設計為干燥固體支持物上的反應物并保持它們的完整性。通常有兩種方法用來實現這一點，第一種是在37° C下于常規(guī)實驗室培養(yǎng)箱中溫育12-24小時，或者真空干燥1-24小時，這取決于待干燥的材料的體積。在我們的經驗中，后者提供活性的最小初始損失和較長期穩(wěn)定性的顯著優(yōu)勢。真空干燥是這樣的方法，其中將材料在減壓環(huán)境中干燥，從而減少快速干燥所需的熱量，在真空干燥器中溫度不升高并且干燥更快速。這種技術允許我們實現非常高水平的干燥，使得固體支持物能夠于升高的溫度(37° C)下在超過兩年的時間中保持穩(wěn)定。我們采用的真空干燥和穩(wěn)定試劑的組合保持蛋白的完整性而不使用加熱來損傷蛋白。在市場上有許多專利封閉和穩(wěn)定溶液即用產品，已報道其有效地穩(wěn)定固體支
持物，包括SurModics Inc.StabilCoat 和Stabi IG uard 14以及有或無牛血清白蛋
白(BSA)的蔗糖和/或乳糖，此外通常使用其他蛋白封閉劑，包括明膠和復原脫脂奶粉
0.l_3%w/v。最近可以使用替代性固相支持物，其由大珠組成，如聚苯乙烯珠(2mm)，直徑范圍可以更大0.5-5_。將這些珠用抗體或抗原包被，封閉和穩(wěn)定，干燥并插入由生物學惰性塑料如聚丙烯組成的微孔板孔，從而不需要為了非特異性結合額外地封閉這個組分。公知方法的最初應用導致珠的干燥的塊，對于這種應用關鍵是獲得均勻地包被的珠，不形成固體簇并且是自由流動的。

發(fā)明內容
申請人:已發(fā)現一種產生均勻地包被的珠的方法，所述珠不形成固體簇并且是自由流動的。因此，所述方法提供:一種用生物學模塊包被珠的方法，其包括:(i)用生物學分子包被多個珠；(ii)將所述包被的珠與液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑混合；(iii)使仍然基本上被包含所述液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑的液相包圍的包被的珠分散在至少部分地液體可滲透的表面上；(iv)將所述表面上的珠干燥以基本上去除所述液相；以及任選地從所述表面移出所述干燥的珠。所述生物學分子可以是例如核酸(如DNA或RNA)、脂多糖、多糖、蛋白或肽。通常，所述生物學分子為蛋白或肽。優(yōu)選地，所述生物學分子是能夠特異性結合抗原的抗體或其片段，或者抗體?？乖梢允巧飳W分子，如蛋白或肽、核酸、脂多糖或者糖。當與包被的珠混合時，所述穩(wěn)定劑和/或封閉劑為液體。通常，去除過量的液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑。然后包被的珠仍然基本上被包含液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑的液相包圍。包被的珠周圍保留的液體量通常是液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑的原始量的約2-5%。這形成:(a)穩(wěn)定劑的物理層以形成結合的生物學材料(如抗原或抗體)上的保護殼；以及(b)液相還確保在珠周圍的多余液體與部分地液體可滲透的表面之間建立燈芯效應。所述至少部分地液體可滲透的表面通常使得液體被吸走或吸掉。如果存在不足的液體，過量的液體可能不會被吸掉，并且因為鄰近珠周圍的殘余液體干掉，所以觀察到它們在塊中粘在一起。通常，所述至少部分地液體可滲透的表面是紙或其他纖維類型表面。紙的大小通常允許紙能夠吸收液體。通常，所述紙為濾紙，如Macherery-Nagel GmbH and C0.制造的 CodeMN215。這樣的紙具有相對高的流速(85mm/10min)和相對光滑的表面。通常這類材料不含可以干擾免疫測定的殘余化學物質，特別是痕量金屬離子、酶如蛋白酶或內切核酸酶、內毒素、去污劑以及疊氮化物。液體可滲透的表面的典型流速為20mm/10分鐘-100mm/10分鐘。表面的燈芯效會將液體吸走，從而在干燥濃縮時穩(wěn)定化學物質，不會使鄰近的珠互相粘附?？梢允褂闷渌牧洗婕?。通常，所述紙是基于纖維素的，如木漿。通常，所述珠在表面上干燥，例如在真空下。所用的溫度可以例如在-5° C和37° C之間，例如-5° C至30° C，并且典型為0° C至環(huán)境溫度。申請人:發(fā)現干燥不必在真空下進行。干燥可以在環(huán)境壓力以及例如環(huán)境溫度(20° C)至37° C下進行。干燥的珠可以從表面移出。然后可以將它們儲存在例如-40° C或4° C下。例如，它們可以與硅膠干燥劑一起儲存以去除來自周圍空氣的水分和保持穩(wěn)定性，并且理想地儲存于密閉容器中。所述珠還可以通過施加熱來干燥，或者在低濕度環(huán)境中于環(huán)境溫度下干燥。液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑可以是選自糖、多元醇、表面活性劑、鹽、聚乙二醇(PEG)、聚合物、金屬離子、蛋白和氨基酸的一種或多種化合物。這類化合物一般描述于1&1^，胃的文章12’13。最典型地使用蛋白。其他封閉材料包括純化的牛乳蛋白Block Ace (Snow Brand Milk ProductsC0.Ltd, Japan)、甘油、Lipidure 、可獲得自 NOF Corporation, Japan 的 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿的水溶性聚合物(參見Park，J-W3)。其他穩(wěn)定劑和/或封閉劑包括甘露醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、環(huán)糊精、羥烷基纖維素和乳糖。優(yōu)選地，所述穩(wěn)定劑和/或封閉劑選自Stabilcoat (包含牛蛋白的制劑，通常稀釋入鹽水溶液)和Stabi I guard (不含蛋白的物質，通常稀釋入鹽水溶液)，這兩者均可獲得自SurModicsInc, Eden Prairie, United States of America。還可以使用鹿糖和乳糖。
通常使用Stabilcoat 或 Stabi I guard 的 50%v/v 溶液。通常，所述液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑包含BSA。
所述珠可以是聚合的或非聚合的。例如，所述珠可以是二氧化硅珠，或者最優(yōu)選聚苯乙烯珠，它們可以是未衍生化的以用于被動吸附，或者可以包含特定的官能團以用于共價偶聯，或包含特定的接頭蛋白以結合期望的配體。這類衍生化方法是本領域公知的。典型地，所述珠的直徑為0.5mm-5mm, 最典型地,直徑為2mm。所述珠可以是聚苯乙烯珠，其具有用于共價偶聯蛋白或其他配體的表面官能團如
羧基或氨基。所述珠可以是聚苯乙烯珠，其具有結合蛋白如G蛋白、鏈霉親和素或生物素以用于連接蛋白或其他配體。 本發(fā)明還提供可通過本發(fā)明的方法獲得的珠。本發(fā)明的另一方面提供用生物學材料包被的多個珠，它們包含穩(wěn)定劑和/或封閉劑，其特征在于所述珠基本上不聚集。即，所述珠基本上是自由流動的，并且基本上不附著至其他珠。生物學分子、穩(wěn)定劑和/或封閉劑以及珠通常如上文所定義。本發(fā)明的另一方面提供一種進行免疫測定的方法，所述方法包括提供本發(fā)明的一個珠或多個珠。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的一個珠或多個珠的免疫診斷裝置。


現在通過示例的方式僅參考以下的圖描述本發(fā)明:
圖1示出在聚苯乙烯皿中干燥的珠，觀察到這些珠聚集成塊并粘附至皿和鄰近的珠。圖2示出在硅化紙上干燥的珠，其中珠聚集成塊并粘附至紙和鄰近的珠。圖3示出在濾紙上干燥的珠，其中珠是游離的并且可移動。
具體實施例方式珠的包被是常規(guī)和本領域公知的。即，將諸如聚苯乙烯珠的珠用適當的緩沖液包被，如pH7.2的磷酸鹽緩沖鹽水或碳酸鹽pH9.6，其包含典型濃度為0.5_20ug/mL (取決于蛋白)的所需抗原或抗體，并且在室溫下溫和混合8-12小時。緩沖液的體積等于50 μ L/珠，因此對于100，000珠，這等于50001^。然后通常將過量的包被溶液吸出。隨后加入通常包含50%Stabilcoat 或Stabilguard 的封閉/穩(wěn)定緩沖液，并在室溫下混合30分鐘,再次使用50μ!7珠。然后將大部分殘余的封閉/穩(wěn)定緩沖液倒掉。然而，通常保留小百分比的液體，例如2-5%。據發(fā)現這是必需的，以允許穩(wěn)定劑的物理層在結合的抗原/抗體上形成保護殼。將珠以及剩余的液體鋪在表面上，然后鋪入淺的敞口盤，在這里通常將它們在環(huán)境溫度下真空干燥。當所述表面是聚苯乙烯皿時，觀察到珠聚集成塊并粘附至皿和鄰近的珠(圖1)。觀察到在具有硅化包衣以從紙排斥水分的硅化紙上干燥的珠粘附至紙和鄰近的珠(圖2)。然而，發(fā)現在具有一定吸收性并允許從珠吸掉液體的濾紙上干燥的珠是游離的并且可移動(圖3)。通常，將珠真空干燥4-18小時，這取決于批量大小。然后將干燥的珠倒入合適大小的容器用于立即使用，或者在插入例如微孔板之前儲存在-40° C或4° C下，并用具有硅膠干燥劑小袋的鋁箔袋密封以最小化水分進入和保持穩(wěn)定性?？蛇x干燥方法如加熱或低濕度環(huán)境中的環(huán)境溫度干燥也是可行的，但是干燥時間延長。參考文獻1.David Geoffrey Wild,The Immunoassay Handbook published by ElsevierISBN:0-08-044526-8 (2008)2.John R.Crowtherj The ELISA Theory and Practice.Humana PressISBN:0-89603-279-5(1995)3.Park, J-W et al., Sensors and Actuators B，91:158-162 (2003)4.Engvallj E.And P.Perlmannj Immunochemistry，8:871-873 (1971).
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權利要求
1.一種用生物學分子包被珠的方法，其包括: (i)用所述生物學分子包被多個珠； (ii)將所述包被的珠與液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑混合； (iii)使仍然基本上被包含所述液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑的液相包圍的包被的珠分散在至少部分地液體可滲透的表面上； (iv)將所述表面上的珠干燥以基本上去除所述液相；以及 (v)從所述表面移出所述干燥的珠。
2.權利要求1的方法，其中所述生物學分子是能夠特異性結合抗原的抗體或其片段，或者抗體。
3.權利要求1或2的方法，其中所述至少部分地可滲透的表面為紙。
4.前述權利要求中任一項的方法，其中在將所述包被的珠分散在所述至少部分地液體可滲透的表面上之前去除過量的液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑。
5.前述權利要求中任一項的方法，其中所述液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑包含選自糖、多元醇、表面活性劑、鹽、聚乙二醇(PEG)、聚合物、金屬離子、蛋白和氨基酸的一種或多種化合物。
6.權利要求5的方法，其中所述穩(wěn)定劑和/或封閉劑選自Stabilcoat 、Stabi I guard 、鹿糖和乳糖。
7.前述權利要求中 任一項的方法，其中所述液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑包含牛血清白蛋白(BSA)。
8.前述權利要求中任一項的方法，其中所述珠直徑為0.特別是最優(yōu)選直徑為2mm。
9.前述權利要求中任一項的方法，其中所述珠為聚苯乙烯珠以用于蛋白或其他配體的被動吸附。
10.前述權利要求中任一項的方法，其中所述珠為聚苯乙烯珠，其具有用于共價偶聯蛋白或其他配體的表面官能團如羧基或氨基。
11.前述權利要求中任一項的方法，其中所述珠為聚苯乙烯珠，其具有結合蛋白如G蛋白、鏈霉親和素或生物素以用于連接蛋白或其他配體。
12.前述權利要求中任一項的方法，其中在步驟(iv)中，將所述珠在真空下干燥。
13.前述權利要求中任一項的方法，其中所述干燥步驟(iv)在-5°C至37° C下進行。
14.可通過前述權利要求中任一項的方法獲得的珠。
15.用生物學分子包被并包含穩(wěn)定劑和/或封閉劑的多個珠，其特征在于所述珠基本上不聚集。
16.權利要求15的多個珠，其直徑為0.5-5mm，優(yōu)選直徑為l_3mm，最優(yōu)選直徑為2mm。
17.權利要求15或16的多個珠，其中所述珠為聚苯乙烯珠。
18.權利要求14-17的多個珠，其中所述生物學分子是能夠特異性結合抗原的抗體或其片段，或者抗原。
19.權利要求15-18的多個包被的珠，其中所述液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑包含選自糖、多元醇、表面活性劑、鹽、聚乙二醇(PEG)、聚合物、金屬離子、蛋白和氨基酸的一種或多種化合物。
20.權利要求19的多個包被的珠，其中所述穩(wěn)定劑和/或封閉劑選自Stabilcoat 、Stabi I guard 、鹿糖和乳糖。
21.權利要求15-19的多個包被的珠，其中所述液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑包含牛血清白蛋白(BSA)。
22.—種進行免疫測定的方法，其包括提供權利要求14-19的一個珠或多個珠。
23.—種包含權利要 求14-19的一個珠或多個珠的免疫診斷裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用生物學分子包被珠的方法，其包括(i)用生物學分子包被多個珠；(ii)將所述包被的珠與液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑混合；(iii)使仍然基本上被包含所述液體穩(wěn)定劑和/或封閉劑的液相包圍的包被的珠分散在至少部分地液體可滲透的表面上；(iv)將所述表面上的珠干燥以基本上去除所述液相；以及(v)從所述表面移出所述干燥的珠。
文檔編號G01N33/543GK103168237SQ201180050457
公開日2013年6月19日 申請日期2011年10月26日 優(yōu)先權日2010年10月27日
發(fā)明者R·布德, D·泰勒 申請人:結合點集團有限公司