專利名稱：修飾植物中的糖蛋白產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾植物中糖蛋白產(chǎn)生的方法。本發(fā)明還提供了具有經(jīng)修飾的糖蛋白 產(chǎn)生的植物。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白(IgG)是對多種性質(zhì)的特異性抗原對應物具有特征性親和力的復合 異多亞基蛋白。目前，對IgG生產(chǎn)細胞系的常規(guī)分離和IgG定向進化與分子工程技術(shù)的 出現(xiàn)極大地影響了它們作為生物治療劑和在一般生命科學市場中的發(fā)展。治療性單克隆 IgG (單克隆抗體，mAb)主宰著目前的新抗炎藥和抗癌藥市場，并且目前有數(shù)百種新的候選 者處于針對改進應用或新應用的研究和臨床開發(fā)中。每年的mAb市場需求從數(shù)克(診斷 學)、數(shù)千克(抗毒素)到多達一百或數(shù)百千克(生物防御、抗癌、抗感染、抗炎藥)。盡管CHO細胞培養(yǎng)物仍然是它們優(yōu)選的商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)宿主，但目前公認的是，為 了讓mAb在生命科學市場中完全發(fā)揮作用，必須開發(fā)替代性的生產(chǎn)系統(tǒng)，因為這些培養(yǎng)物 需要的設(shè)備不容易大規(guī)模調(diào)控，它們的建造和維護成本極高并且逐漸提高，而且其GMP認 證在建設(shè)后仍然平均需要三年。即便是雇早期開發(fā)階段，對具有可接受的產(chǎn)率和生產(chǎn)力的 CHO細胞系的選擇仍然是一個昂貴和長期的過程。會降低上游成本(更高的產(chǎn)率、更簡單的 技術(shù)和基礎(chǔ)設(shè)施)，具有更短的前導時間、在容量方面更加靈活而同時滿足現(xiàn)有細胞培養(yǎng)系 統(tǒng)目前的生產(chǎn)力、品質(zhì)和安全特性的新生產(chǎn)系統(tǒng)很可能在每個開發(fā)階段對用于生命科學市 場之mAb和疫苗的開發(fā)具有重大影響。對mAb和目前應用于生命科學中的若干其他蛋白質(zhì)的生產(chǎn)而言，植物是合適的宿 主(近期綜述見Ko和Koprowski 2005 ；Ma等，2005 ；Yusibov等，2006)。MAb已在穩(wěn)定的轉(zhuǎn) 基因植物株系中以多達200mg/kg鮮重(FW)的產(chǎn)量生產(chǎn)，并且通過瞬時表達以多達20mg/kg Fff 的產(chǎn)量生產(chǎn)(Kathuria，2002)。Giritch 等(2006)報道了對 IgG 而言 200_300mg/kg 葉 重量的表達水平，其中一個列舉的最大值為500mg/kg，其通過使用基于多病毒的瞬時表達 系統(tǒng)獲得。植物和哺乳動物N-糖基化過程有差異。哺乳動物中N-糖基化的較后步驟為向復 合聚糖上添加β 1，4半乳糖、α 1，6巖藻糖(卩-丨，彳半乳糖^-丨力巖藻糖彳和末端唾液酸 殘基。然而在植物中添加的是β 1，3半乳糖、α 1，3巖藻糖(β-1，3半乳糖、α_1，3巖藻 糖)，α 1，4巖藻糖和β 1，2木糖(α-1，4巖藻糖和β_1，2木糖)殘基。α 1，3_巖藻糖和 β 1，2木糖是一些植物變應原的糖表位組分，這些殘基被認為可能是免疫原性的，并且不期 望它們出現(xiàn)在治療性蛋白質(zhì)(包括抗體)上。對肽的C端添加KDEL序列通常被用于確保肽從高爾基體上回收至ER。該方法 被用于使用煙草葉的農(nóng)桿菌滲入法生產(chǎn)非巖藻糖基化和非木糖基化的抗體(Sriraman等， 2004)。然而，所添加的KDEL肽可能是免疫原性的，并且該方法對于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的適 用性有限。還通過修飾巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和木糖基轉(zhuǎn)移酶的表達，實現(xiàn)了對al，3巖藻糖 (^-1，3巖藻糖)和β 1，2木糖(β-1，2木糖)添加的控制。在苔蘚(Physcomitrella
5patens ；Koprivova 等，2004)禾Π 擬南芥(Arabidopsisthaliana) (Strasser 等，2004)中 產(chǎn)生了不能在復合聚糖上添加al，3巖藻糖和β1，2木糖的突變體。還通過在浮萍 (Lemna minor)中表達靶向α 1，3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和β 1，2木糖木糖基轉(zhuǎn)移酶基因的干 擾RNA(RNAi)，實現(xiàn)了對植物巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和木糖基轉(zhuǎn)移酶表達的部分抑制(Cox等， 2004)。然而，這些酶活性的完全抑制對若干植物物種具有有害影響，因為它們干擾關(guān)鍵的 發(fā)育事件，例如花粉形成或結(jié)籽。RNAi誘導的mRNA特異性降解可能不是隨時間穩(wěn)定的，并 且可能不適合用于生產(chǎn)治療性藥物的多種基于植物的平臺，因為其被報道為對環(huán)境因素敏 感。WO 03/078637公開了人半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化植物聚糖上添加末端β 1，4半乳糖 (GalT)的用途。通過使用與木糖基轉(zhuǎn)移酶跨膜結(jié)構(gòu)域的融合物得到的GalT表達并將其活 性靶向順面高爾基體導致末端半乳糖的添加和帶有植物特異性殘基的N-聚糖的減少(還 見Bakker等，2006)。將這些植物與含有重組IgG的植物育種，導致含有巖藻糖和木糖的聚 糖的顯著但不定量的減少。通過N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III (GnT-III ；EC 2.4. 1. 144)催化將β_1，4_連接 的N-乙酰葡糖胺(GlnNAc)殘基與β -連接的甘露糖結(jié)合，產(chǎn)生平分(bisected)的GlcNac。 已描述了將該酶引入植物中(Rouwendal等，2007)，并且植物表達的包含GnT-III的、具有 復合N-聚糖的蛋白質(zhì)被對切并帶有兩個GlnAc殘基。發(fā)明概述本發(fā)明涉及修飾植物中糖蛋白產(chǎn)生的方法。本發(fā)明還提供了具有經(jīng)修飾的糖蛋白 產(chǎn)生的植物。提供用于修飾植物中糖蛋白產(chǎn)生的改進方法是本發(fā)明的一個目的。本文中提供了具有核苷酸序列㈧的核酸，所述核苷酸序列㈧包含SEQ ID NO 17 (GNTl-GalT ；圖5d)的1-1077位核苷酸，或包含與SEQ ID NO 17的1-1077位核苷酸顯 示約80%到100%同一性的核苷酸序列，所述同一性使用以下參數(shù)測定程序blaStn ；數(shù) 據(jù)庫nr ；預期10 ；過濾低復雜度；比對成對；字長11，其中所述核苷酸序列編碼修飾目 的蛋白質(zhì)糖基化的蛋白質(zhì)。還提供了具有核苷酸序列(B)的核酸，所述核苷酸序列(B)包含第一核酸序列，所 述第一核酸序列包含SEQ ID NO 14 (GalT)的5-1198位核苷酸，或包含與SEQ ID N0:14的 5-1198位核苷酸顯示約80%到100%同一性的序列，所述同一性使用以下參數(shù)測定程序 blastn ；數(shù)據(jù)庫nr ；預期10 ；過濾低復雜度；比對成對；字長11，其中所述第一核酸序 列編碼修飾目的蛋白質(zhì)糖基化的蛋白質(zhì)，所述第一核酸序列與包含35S啟動子或質(zhì)體藍素 啟動子的第二核酸序列有效連接。本發(fā)明描述了具有下述核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列包含SEQID NO 26 (GNTl-GnT-III)的1-1641位核苷酸，或包含與SEQ ID NO 26的1-1641位核苷酸顯示 約80%到100%同一性的核苷酸序列，所述同一性使用以下參數(shù)測定程序blaStn ；數(shù)據(jù) 庫nr ；預期10 ；過濾低復雜度；比對成對；字長11，其中所述核苷酸序列編碼修飾目的 蛋白質(zhì)糖基化的蛋白質(zhì)。還描述了具有下述核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列包含第一核酸序列，所述 第一核酸序列包含SEQ ID NO 16 (GnT-III)的1-1460位核苷酸，或包含與SEQ ID NO:16的1-1460位核苷酸約80%到100%相似的序列，所述相似性使用以下參數(shù)測定程序 blastn ；數(shù)據(jù)庫nr ；預期10 ；過濾低復雜度；比對成對；字長11，其中所述第一核酸序 列編碼修飾目的蛋白質(zhì)糖基化的蛋白質(zhì)，所述第一核酸序列與包含35S啟動子或質(zhì)體藍素 啟動子的第二核酸序列有效連接。還提供了包含上文所述(A)、(B)、(C)或(D)核苷酸序列的植物、植物細胞或種子。本發(fā)明還涉及雜合蛋白GNTl-GalT，其包含與β _1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域 融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶CTS結(jié)構(gòu)域，并且包含序列SEQ ID N0:18。SEQ ID NO 18 的氨基酸序列可以由SEQ ID NO :17的核苷酸序列編碼。還提供了包含上述雜合蛋白的植 物、植物細胞或種子。還提供了包含下述核酸的植物、植物細胞或種子，所述核酸包含核苷 酸序列 SEQ ID NO :17ο本發(fā)明包括雜合蛋白GNTl-GnT-III，所述雜合蛋白包含與N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移 酶III催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶CTS結(jié)構(gòu)域，并且包含氨基酸序列SEQ ID N0:20。SEQ ID NO :21的氨基酸序列可以由核苷酸序列SEQ ID N0:26編碼。還提供了包 含上述雜合蛋白的植物、植物細胞或種子。還提供了包含下述核酸的植物、植物細胞或種 子，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID N0:26。根據(jù)本發(fā)明，提供了用于合成目的蛋白質(zhì)的方法(1)，包括在植物或植物部分中表 達編碼第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋 白GNTl-GalT，所述雜合蛋白包含與β _1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)催化結(jié)構(gòu)域融合的 N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(GNTl)CTS結(jié)構(gòu)域，所述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的 第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所 述植物中有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；該方法還包括表達所述第一和第二核苷酸序列， 從而合成包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化的聚糖的目的蛋白質(zhì)。如上所述的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以在植物中瞬時表達，或者它們 可以穩(wěn)定表達。另外，第一調(diào)節(jié)區(qū)可以是第一組織特異性啟動子，第二調(diào)節(jié)區(qū)是第二組織特 異性啟動子。第一和第二組織特異性啟動子各自可以是質(zhì)體藍素啟動子。本發(fā)明還提供了用于合成目的蛋白質(zhì)的方法(2)。所述方法如上文所述(方法1)， 其中目的蛋白質(zhì)可以是抗體。如果目的蛋白質(zhì)是抗體，則編碼目的蛋白質(zhì)的第二核苷酸序 列包含與在植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)2Α有效連接的核苷酸序列2Α，以及與在植物中有活性 的調(diào)節(jié)區(qū)2Β有效連接的核苷酸序列2Β，并且2Α和2Β各自編碼的產(chǎn)物組合產(chǎn)生抗體。調(diào)節(jié) 區(qū)2Α可以是質(zhì)體藍素啟動子，調(diào)節(jié)區(qū)2Β可以是質(zhì)體藍素啟動子。本發(fā)明還提供了如上所述的方法(1)或(2)，其中在植物中表達第三核苷酸序 列，所述第三核苷酸序列編碼沉默性抑制基因，與在植物中有活性的第三調(diào)節(jié)區(qū)有效連 接。編碼沉默性抑制基因的第三核苷酸序列可以是例如HcPro、TEV-p 1/HC-Pro、BYV_p21、 TBSV pl9、TCV-CP, CMV_2b、PVX_p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV_pl6、CTV_p23、GLRaV_2p24、 GBV-p 14, HLV-p 10, GCLV_pl6或GVA-plO。第三組織特異性啟動子可以是質(zhì)體藍素啟動子。本發(fā)明提供了用于驅(qū)動目的蛋白質(zhì)在植物中表達的植物表達系統(tǒng)，其中所述目的 蛋白質(zhì)包含經(jīng)修飾的糖基化模式。例如，目的蛋白質(zhì)可包含減少的巖藻糖基化、木糖基化或 者巖藻糖基化和木糖基化都減少的N-聚糖。或者，目的蛋白質(zhì)可包含經(jīng)修飾的糖基化模 式，其中所述蛋白質(zhì)缺乏巖藻糖基化、木糖基化或者巖藻糖基化和木糖基化都缺乏的殘基，
7并且顯示增加的半乳糖基化。另外，可以添加末端半乳糖，其導致與在野生型植物中產(chǎn)生的 相同目的蛋白質(zhì)相比減少或消除了目的蛋白質(zhì)的巖藻糖基化和木糖基化。本發(fā)明提供了用于合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的目的蛋白質(zhì)的方法(3)，包括 在植物、植物部分或植物細胞中共表達編碼第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的核苷酸序 列，所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋白GNTl-GnT-III，所述雜合蛋白包含與N-乙酰葡糖氨 基轉(zhuǎn)移酶III (GnT-III)催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(GNTl) CTS結(jié)構(gòu)域，所 述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序列編 碼目的蛋白質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；該方 法還包括共表達所述第一和第二核苷酸序列，從而合成包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的 聚糖的目的蛋白質(zhì)。上述(方法3)第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以在植物中瞬時表達，或者它 們可以穩(wěn)定表達。另外，第一調(diào)節(jié)區(qū)可以是第一組織特異性啟動子，第二調(diào)節(jié)區(qū)是第二組織 特異性啟動子。第一和第二組織特異性啟動子各自可以是質(zhì)體藍素啟動子。還提供了用于合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的目的蛋白質(zhì)的方法⑷，包括在 植物、植物部分或植物細胞中共表達編碼第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸 序列的核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋白GNTl-GalT，所述雜合蛋白包含與 β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(GNTl) CTS結(jié)構(gòu) 域，所述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸 序列編碼β _1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的第二調(diào) 節(jié)區(qū)有效連接，所述第三核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第三核苷酸序列與在所述植物 中有活性的第三調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；該方法還包括共表達所述第一、第二和第三核苷酸序列， 從而合成包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的聚糖的目的蛋白質(zhì)。如上文所述(4)的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以在植物中瞬時表達，或 者它們可以穩(wěn)定表達。另外，第一調(diào)節(jié)區(qū)可以是第一組織特異性啟動子，第二調(diào)節(jié)區(qū)是第二 組織特異性啟動子。第一和第二組織特異性啟動子各自可以是質(zhì)體藍素啟動子。本發(fā)明描述了用于合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的目的蛋白質(zhì)的方法(5)，包 括在植物、植物部分或植物細胞中共表達編碼第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核 苷酸序列的核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋白GNTl-GnT-III，所述雜合蛋白 包含與N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III (GnT-III)催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶 (GNTl)CTS結(jié)構(gòu)域，所述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所 述第二核苷酸序列編碼N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III，所述第二核苷酸序列與在所述植物中 有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第三核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第三核苷酸序 列與在所述植物中有活性的第三調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；該方法還包括共表達所述第一、第二和 第三核苷酸序列，從而合成包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的聚糖的目的蛋白質(zhì)。上述方法(5)中所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列可以在 植物中瞬時表達，或者它們可以穩(wěn)定表達。另外，第一、第二和第三調(diào)節(jié)區(qū)可以是組織特異 性啟動子。例如，組織特異性啟動子各自可以是質(zhì)體藍素啟動子。根據(jù)本文所述的方法，可以因此以高產(chǎn)率生產(chǎn)缺乏下述聚糖的目的蛋白質(zhì)，所述 聚糖已知涉及超敏反應，或者以其他方式涉及變態(tài)反應。這通過共表達經(jīng)糖改造的酶和目的蛋白質(zhì)來完成，這導致產(chǎn)生比野生型植物中所生產(chǎn)的免疫原性更低的蛋白質(zhì)。如本文所述，可以使用利用瞬時表達系統(tǒng)產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的簡化表達系統(tǒng)，然而， 本發(fā)明方法也可以與穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)一起使用。本發(fā)明因此不限于瞬時表達系統(tǒng)。通過使用瞬時共表達，本文所述系統(tǒng)避免了過長的生產(chǎn)時間，以及優(yōu)良突變體或 經(jīng)糖改造的轉(zhuǎn)基因株系及其隨后作為親本株系用途的選擇過程(例如如Bakker，2005所 述)。其還避免了突變體或經(jīng)糖改造的植物在生產(chǎn)力、花粉生產(chǎn)、結(jié)籽(Bakker等2005)和 生存力(Boisson等，2005)方面通常遇到的其他問題。如本文中所述，目的蛋白質(zhì)與修飾性 嵌合人半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的共表達對生產(chǎn)動力學或產(chǎn)量沒有影響。本文所述的瞬時表達系統(tǒng)產(chǎn)生達到每千克葉鮮重1. 5g高品質(zhì)抗體的表達水平， 超過了使用其他表達系統(tǒng)的植物中針對任何抗體報道的累積水平，所述其他表達系統(tǒng)包括 基于多病毒的系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因植物。本文所述方法(例如涉及表達GalT或GalT-GNTl)也可以用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。 盡管顯示上文所述的許多優(yōu)點，但是本發(fā)明不限于瞬時表達系統(tǒng)。本發(fā)明的概述不必然描述本發(fā)明的所有特征。附圖簡述通過以下的描述可以更明白本發(fā)明的這些特征和其他特征，所述描述參照附圖， 其中圖IA展示了為了 C5-1表達而裝配的基于質(zhì)體藍素的盒。R610包含編碼C5-1 LC 和C5-1 HC-KDEL的核苷酸序列；R612包含編碼C5-1 LC和C5-1 HC的核苷酸序列。C5-1 LC :C5-1輕鏈編碼序列；C5-1 HC :C5_1重鏈編碼序列。圖IB展示了質(zhì)體藍素啟動子和 5' UTR的核苷酸序列(SEQID NO :23)，轉(zhuǎn)錄起點用粗體顯示，翻譯起始密碼子加有下劃線。 圖IC展示了質(zhì)體藍素3' UTR和終止子的核苷酸序列(SEQ ID NO :24)，終止密碼子加有下 劃線。圖2展示了在用與或不與沉默性HcPro抑制基因共表達的R610和R612(基于質(zhì) 體藍素的表達盒)滲入的本生煙(Nicotiana benthamiana)葉中，C5_l抗體的累積。展示 的數(shù)值對應于平均累積水平和標準差，其得自對3株植物(注射器)的6次測量，或?qū)s12 株植物(250g)的各個滲入批次的6次測量。圖3展示了注射器滲入和真空滲入植物的提取物中，C5-1累積的蛋白質(zhì)印跡分 析。圖3A展示了使用與過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(H+L)對來自用R612(用于分泌， 泳道1)或用R610(用于ER停留，泳道2)滲入之植物的提取物進行的免疫印跡。C1 =IOOng 市售小鼠IgGl (SigmaM9269)，作為電泳遷移率的對照上樣；C2 12 μ g從模擬滲入的生物量 中提取的總蛋白質(zhì)(空載體)。C3:與從模擬滲入的生物量中提取的12 μ g總蛋白質(zhì)(空載 體)混合的IOOng市售鼠IgGl (Sigma M9269)。圖3B展示了使用與過氧化物酶綴合的人 IgGl，對來自用R612(用于分泌，泳道1)或用R610(用于ER停留，泳道2)滲入之植物的提 取物進行的活性免疫印跡。C1 從雜交瘤中純化的2 μ g對照C5-1 (Khoudi等，1997) ;C2 從 模擬滲入的生物量中提取的75 μ g總蛋白質(zhì)(空載體)。圖4展示了抗體分析，所述抗體從用R612 (用于分泌，泳道1)或R610 (用于ER停 留，泳道2)滲入的植物中純化。圖4A展示了在非還原條件下進行的粗提物和純化抗體的 SDS-PAGE。圖4B展示了在還原條件下進行的純化抗體的SDS-PAGE。圖4C展示了用與過
9氧化物酶綴合的人IgGl進行的純化抗體的活性免疫印跡。圖4D展示了來自不同滲入批次 的6批次純化C5-1中污染物的比較。C :2. 5 μ g市售小鼠IgGl (SigmaM9269)，作為電泳遷 移率的對照上樣。圖5A展示了為表達天然(R622)和雜合(R621)形式半乳糖基轉(zhuǎn)移酶而裝配的 盒的代表性例子。GNTI-CTS =N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶I的CTS結(jié)構(gòu)域；GalT-Cat β 1，4 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的催化結(jié)構(gòu)域；(R622的)GalT:人β 1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。圖5Β展示了 GalT (UDP-Gal β GlcNac β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶多肽1，β _1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I)的核 苷酸序列(SEQ IDNO :14)，ATG起點加有下劃線；跨膜結(jié)構(gòu)域加有下劃線并且為斜體；加粗 序列對應于人β l，4GalT的催化結(jié)構(gòu)域；FLAG表位為斜體。圖5C展示了 GalT (UDP-Gal β GlcNac β 1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶多肽1，β _1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶I)的氨基酸序列(SEQ ID Ν0:15)。跨膜結(jié)構(gòu)域加有下劃線并且是斜體；加粗序列對應于人β l，4GalT的催化結(jié) 構(gòu)域；FLAG表位為斜體。圖5D展示了 GNTIGalT的核苷酸序列(SEQ ID NO 17)，其ATG起 點加有下劃線；跨膜結(jié)構(gòu)域(CTS)加有下劃線并且為斜體；粗體序列對應于人β l,4GalT 的催化結(jié)構(gòu)域；FLAG表位為斜體。圖5E展示了 GNTIGalT的氨基酸序列(SEQ ID NO 18)。 跨膜結(jié)構(gòu)域(CTS)加有下劃線并且為斜體；粗體序列對應于人β l,4GalT的催化結(jié)構(gòu)域； FLAG表位為斜體。圖5F展示了 N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(GNT1 ；SEQ ID NO 21)的CTS結(jié)構(gòu) 域(細胞質(zhì)尾，跨膜結(jié)構(gòu)域，莖區(qū))。圖5G展示了 CTS (SEQ ID NO 22)的氨基酸。圖5H展 示了 GntI-Gnt III (SEQ ID NO 26)的核酸序列。圖 51 展示了 GntI-Gnt III (SEQ ID NO: 20)的氨基酸序列。圖5J展示了 GntIII(SEQ ID NO :16)的核酸序列。圖5K展示了 Gnt IIKSEQ ID NO 19)的氨基酸序列。圖6展示了從表達C5-1的植物中獲得的提取物的圖譜，其或者針對蛋白質(zhì)染色， 或者進行Western分析。上圖顯示考馬斯藍染色的PAGE凝膠。上數(shù)第二幅圖顯示使用雞 冠刺桐(Erythrina cristagali)凝集素(ECA)的親和檢測(affinodetection)，所述凝集 素與β 1，4半乳糖特異性結(jié)合。上數(shù)第三幅圖顯示使用抗α 1，3巖藻糖抗體的Western印 跡分析。底部圖顯示使用抗β 1，2木糖特異性抗體的Western印跡分析。R612 單獨表達 的 C5-1 ；R612+R622 與 GalT 共表達的 C5-1 (共滲入)；R612+R621 與 GNTl-GalT 共表達的 C5-1。圖7展示了 MALDI-T0F質(zhì)譜，其用于測定C5_l的經(jīng)胰蛋白酶消化的糖肽 EEQFNSTFR(SEQ ID NO 13)的N-糖基化，所述C5-1從帶有一系列構(gòu)建體的本生煙注射器 滲入植物中分離。在制備性HPLC上分離后測定糖肽的N-糖基化。在真空滲入后獲得類似 的結(jié)果。圖7A展示了在R612表達(C5-1，見

圖1)后，經(jīng)胰蛋白酶消化的糖肽的MALDI-T0F 質(zhì)譜。圖7B展示了在與天然GalT(R622，見圖5) —起表達C5_l (R612，見圖1)后，經(jīng)胰 蛋白酶消化的糖肽的MALDI-T0F質(zhì)譜。圖7C展示了與GNTIGalT(R621，見圖5) —起表達 C5-1(R612，見圖1)后，經(jīng)胰蛋白酶消化的糖肽的MALDI-T0F質(zhì)譜。圖7C插圖對應于圖 譜的m/z2650-2800放大，展示在R612植物中檢測到主要復合離子J的缺失(箭頭)。A GlcNAcMan3GlcNAc2 ；B =Man5GlcNAc2 ；C GalGlcNAcMan3GlcNAc2 ；D :GlcNAc2Man3GlcNAc2 ；E Man6GlcNAc2 ；F =GalGlcNAcMan3 (Xyl) GlcNAc2 ；G =GlcNAcMan5GlcNAc2 ；H GlcNAc2Man3 (Fuc) GlcNAc2 ；I =Man7GlcNAc2 J =GlcNAc2Man3(Xyl) (Fuc)GIcNAc2 ；K :GalGlcNAcMan5GlcNAc2 ；L Man8GlcNAc2 ；M :Man9GlcNAc2。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及修飾植物中糖蛋白產(chǎn)生的方法。本發(fā)明還提供了具有修飾的糖蛋白產(chǎn) 生的植物。本發(fā)明描述了驅(qū)動目的蛋白質(zhì)在植物中表達的植物表達系統(tǒng)。使用所述的表達系 統(tǒng)，可以獲得包含經(jīng)修飾的糖基化模式(例如N-聚糖的巖藻糖基化、木糖基化減少或兩者 皆減少)的目的蛋白質(zhì)?；蛘撸梢垣@得包含經(jīng)修飾的糖基化模式的目的蛋白質(zhì)，其中所述 蛋白質(zhì)缺乏巖藻糖基化、木糖基化或二者皆缺乏，并且包含提高的半乳糖基化。另外，如本 文所述，末端半乳糖的添加導致所表達目的蛋白質(zhì)的巖藻糖基化和木糖基化減少，例如與 在野生型植物中產(chǎn)生的相同目的蛋白質(zhì)相比，目的蛋白質(zhì)可包含少于10%的巖藻糖基化和 木糖基化(即少于10%的N-聚糖殘基被巖藻糖基化和木糖基化)，或少于5%的巖藻糖基 化和木糖基化(即少于5 %的N-聚糖殘基被巖藻糖基化和木糖基化)，少于1 %的巖藻糖基 化和木糖基化(即少于1 %的N-聚糖殘基被巖藻糖基化和木糖基化)，約0. 1 %到約2 %的 N-聚糖殘基被巖藻糖基化和木糖基化，約0. 5%到約1. 5%的N-聚糖殘基被巖藻糖基化和 木糖基化，或約0.7%到約1.0%的N-聚糖殘基被巖藻糖基化和木糖基化。因此，目的蛋白 質(zhì)可以以高產(chǎn)率生產(chǎn)，并且缺乏可能引起超敏反應或以其他方式涉及變態(tài)反應的聚糖。待表達的目的蛋白質(zhì)的非限制性例子包括復合蛋白質(zhì)，例如抗體。這樣的復合蛋 白質(zhì)在農(nóng)桿菌滲入的植物(例如本生煙)中的表達產(chǎn)生水平達到1. 5g/kg FW(約25% TSP) 的蛋白質(zhì)。分泌形式和ER停留形式的目的蛋白質(zhì)分別獲得558和757mg/kg/FW的平均水 平。在提供的非限制性例子中，獲得了與使用多病毒瞬時表達系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體相比高三倍 的抗體表達水平(Giritch等2006)。植物和典型的哺乳動物N-糖基化之間差異的影響是在使用植物用于治療性生產(chǎn) 這一構(gòu)思中的主要問題。植物特異性聚糖的存在可縮短植物制造的蛋白質(zhì)在血流中的半衰 期，或者相同的聚糖在患者中激發(fā)超敏反應。在植物中產(chǎn)生的糖蛋白上核心α 1，3巖藻糖和β 1，2木糖的存在被認為是工業(yè)中 的常規(guī)挑戰(zhàn)，因為它們還存在于一些植物變應原上。另外，已經(jīng)證明，去除可見于來自CHO 細胞之IgG上的核心巖藻糖(甚至^1，6巖藻糖)會提高ADCC活性。本文所述系統(tǒng)的一 個特征是能夠完成翻譯后修飾的調(diào)控，例如同時添加末端半乳糖并減少或抑制巖藻糖基化 和木糖基化(與在野生型植物中產(chǎn)生的相同蛋白質(zhì)相比)?；蛘?，可以降低巖藻糖基化程度 同時提高半乳糖基化的量，這也是與在野生型植物中產(chǎn)生的相同蛋白質(zhì)相比?？梢允褂萌魏魏线m的方法(例如使用抗α -1，3巖藻糖抗體檢測巖藻糖特異性免 疫信號的存在與否(巖藻糖基化)，和抗β 1，2木糖抗體檢測木糖基化或木糖特異性免疫信 號的存在與否)來測定對巖藻糖基化、木糖基化或半乳糖基化之量的調(diào)控，例如如圖6中所 示。或者，可以使用MALDI-T0F質(zhì)譜法測定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分的N-糖基化譜，如圖7中 所示。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分N-糖基化譜的其他方 法。如下文更詳細描述的，使用基于真空的農(nóng)桿菌滲入系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)其在數(shù)量、品質(zhì)和生 產(chǎn)力方面適用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)(例如抗體)。規(guī)模可變滲入技術(shù)的獲得允許在小研究單 位中每天產(chǎn)生數(shù)克該抗體(這允許使用這類瞬時表達系統(tǒng)在極短的時間框架中產(chǎn)生用于 臨床試驗的材料)，以及用于以高達每年數(shù)千克的市場容量提供被許可的產(chǎn)品。在單次親和
11層析步驟后從滲入的葉中獲得高品質(zhì)的抗體。然而，應當理解，本文所述方法還適用于被穩(wěn) 定轉(zhuǎn)化的植物。轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgene silencing, PTGS)可涉及限制植 物中轉(zhuǎn)基因的表達，并且可共表達沉默性抑制基因(使用來自馬鈴薯病毒Y)來抵抗轉(zhuǎn)基 因mRNA的特異性降解(Brigneti等，1998)，所述沉默性抑制基因例如但不限于HcPro。其 他沉默性抑制基因是本領(lǐng)域公知的，并可如本文所述使用(Chiba等，2006，Virology 346 7-14 ；其通過參考并入本文)，例如但不限于TEV-pl/HC-Pro (煙草蝕紋病毒-pl/HC-Pro)、 BYV-p21、番茄叢矮病毒(TBSV pl9)、番茄皺縮病毒的衣殼蛋白質(zhì)(TCV-CP)、黃瓜花葉病毒 的2b(CMV-2b)、馬鈴薯病毒X的p25(PVX-p25)、馬鈴薯病毒M的pll (PVM-pll)、馬鈴薯病 毒S的pll (PVS-pll)、藍莓枯萎病毒ρ 16 (BScV-p 16)、柑橘速衰病毒的p23 (CTV_p23)、葡萄 藤卷葉聯(lián)合病毒_2的p24(GLRaV-2p24)、葡萄藤病毒A的plO(GVA-plO)、葡萄藤病毒B的 ρ 14 (GVB-pl4)、白芷潛伏病毒的plO (HLV-plO)，或大蒜普通潛伏病毒的ρ 16 (GCLV_pl6)。因 此,沉默性抑制基因(例如 HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV_p21、TBSV pl9、TCV-CP, CMV_2b、 PVX-p25、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV_p23、GLRaV-2 p24、GBV_p14、HLV_p10、GCLV-p16 或 GVA-plO)可以與 GalT、GNTl_GalT、GnT-III, GNTl-GnT-III 任一或其組合共表達，以進 一步確保植物中高水平的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。使用瞬時表達產(chǎn)生的純化產(chǎn)物的考馬斯藍染色顯示存在低豐度的多種污染物。這 些片段似乎是產(chǎn)物相關(guān)的，并且所有大于70kDa的污染物含有至少一條Fab，如活性印跡所 示(圖3B)。植物提取物中存在的產(chǎn)物相關(guān)污染物的身份和數(shù)量與在哺乳動物細胞生產(chǎn)系 統(tǒng)中觀察到的類似。因此，通常用于純化治療性抗體的純化操作(例如陰離子交換、親和交 換和陽離子交換)容易獲得用于治療性用途的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)作用所需的純度。本發(fā)明提供了用于在植物中合成目的蛋白質(zhì)的方法，所述目的蛋白質(zhì)的特征是具 有經(jīng)修飾的糖基化模式。所述方法涉及將目的蛋白質(zhì)與編碼β_1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(例 如但不限于哺乳動物GalT，或人GalT，然而也可以使用來自其他來源的GalT)的核苷酸序 列(GalT ;SEQ ID NO 14)共表達。也可以將GalT的催化結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID N0:14的 370-1194位核苷酸，圖5b中的加粗序列?；騍EQ ID NO 17的238-1062位核苷酸，圖5d 中的加粗序列)與N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(GNT1 ；例如包含SEQ ID NO 17的34-87位核 苷酸；圖5d)的和編碼包含SEQ ID NO 18的氨基酸12-29的氨基酸序列(圖5e)的CTS 結(jié)構(gòu)域(即細胞質(zhì)尾、跨膜結(jié)構(gòu)域、莖區(qū))融合，產(chǎn)生GNTl-GalT雜合酶，并且所述雜合酶可 以與目的蛋白質(zhì)共表達。還包括將目的蛋白質(zhì)與編碼N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III (例如但 不限于GnT-III或人GnT-III，也可以使用來自其他來源的GnT-III)的核苷酸序列共表達 (GnT-III ；SEQ ID NO 16 ；圖 5 j)。另外，也可以使用 GNTl-GnT-III 雜合酶(SEQ ID NO 26 ； 圖5d)，其包含與GnT-III融合的GNTl的CTS，并如下文所述。用于錨定編碼GalT mGalT或hGalT或來自其他來源的GalT的核苷酸序列的替代 性方法包括將GalT與HDEL、KDEL(均為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留序列)、涉及N-糖蛋白生物合成之蛋白 質(zhì)的CTS融合，所述CTS包括但不限于葡萄糖苷酶I的CTS、葡萄糖苷酶II的CTS、甘露糖 苷酶I的CTS、甘露糖苷酶II的CTS、β，1，2木糖基轉(zhuǎn)移酶的CTS、α，1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 的CTS。也可以將GalT的催化結(jié)構(gòu)域與HDEL、KDEL(均為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)停留序列)、葡萄糖苷酶I 的CTS、葡萄糖苷酶II的CTS、甘露糖苷酶I的CTS、甘露糖苷酶II的CTS、β,1,2木糖基轉(zhuǎn)移酶的CTS、α，1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的CTS融合。包含GNTl-GalT或GNTl-GnT-III序列的雜合酶的使用將GalT或GnT-III的催化 結(jié)構(gòu)域置于順面高爾基體中，在那里發(fā)生復合N-聚糖成熟的早期階段。不希望受理論束 縛，將GalT活性隔離在聚糖成熟的早期階段可導致成熟中的聚糖上添加β 1，4半乳糖，并 且導致對蛋白質(zhì)巖藻糖基化和木糖基化的有效抑制，否則它們會在植物中發(fā)生。類似地，將 GnT-III活性隔離在聚糖成熟的早期階段可導致β -連接的甘露糖上添加GIcNAc殘基而 產(chǎn)生平分的GlnAc，并且導致對蛋白質(zhì)巖藻糖基化和木糖基化的有效抑制，否則它們會在植 物中發(fā)生。例如，目的蛋白質(zhì)可以與雜合酶共表達，所述雜合酶包含與GalT催化結(jié)構(gòu)域例 如 GNTl-GalT (R621 ；圖 5a、5d)或 GnT-III 催化結(jié)構(gòu)域例如 GNTl-GnT-III (SEQ ID NO 26 ； 圖5h)融合的CTS結(jié)構(gòu)域。如果期望目的蛋白質(zhì)包含降低的巖藻糖基化水平，而同時仍然 包含木糖基化和半乳糖基化的蛋白質(zhì)，則可以將未經(jīng)修飾(天然)的GalT與目的蛋白質(zhì)共 表達。如果期望包含經(jīng)修飾糖基化的目的蛋白質(zhì)中包含平分GlnAc殘基，則可以將未修飾 (天然)的GnT-III與目的蛋白質(zhì)共表達。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，可以使用對植物優(yōu) 化的核酸序列產(chǎn)生未修飾或天然的GalT或GnT-III酶。因此提供了下述核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO 17 (GNTl-GalT)的 1-10662位核苷酸，或包含與SEQ ID NO 17的1-102位核苷酸顯示80 %到100 %同一性 的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼修飾目的蛋白質(zhì)之糖基化的蛋白質(zhì)。所述序列 可以是對植物優(yōu)化的。還提供了下述核苷酸序列，所述核苷酸序列包含含有SEQ ID NO 14 (GalT)的1-1224位核苷酸的核酸序列，或包含與SEQ ID NO 14的1-1224位核苷酸顯 示約80%到100%同一性的序列，其中所述核苷酸序列編碼修飾目的蛋白質(zhì)之糖基化的蛋 白質(zhì)。所述序列可以是對植物優(yōu)化的。序列同一性使用以下參數(shù)測定程序blastn ；數(shù)據(jù) 庫nr ；預期10 ；過濾低復雜度；比對成對；字長11。還公開了如SEQ ID NO 18 (GNTl-GalT ；圖 5e)或 SEQ ID NO 15 (GalT ；圖 5c)所 示的氨基酸序列。本發(fā)明提供了具有下述核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列包含SEQID NO 26 (GNTl-GnT-III)的1-1641位核苷酸，或包含與SEQ ID NO 26的1-1641位核苷酸顯示 約80%到100%同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼修飾目的蛋白質(zhì)糖基化的 蛋白質(zhì)。所述序列可以是對植物優(yōu)化的。還提供了包含下述核酸序列的核苷酸序列，所述 核苷酸序列包含SEQ ID NO :26的232-1641位核苷酸(GnT-III ；或SEQ ID NO 16的核 苷酸1-1460)，或包含與SEQ ID NO 26的232-1641位核苷酸(或SEQ IDNO 16的核苷酸 1-1460)顯示約80%到100%同一性的序列，其中所述核酸序列編碼修飾目的蛋白質(zhì)之糖 基化的酶。所述序列可以是對植物優(yōu)化的。序列同一性使用以下參數(shù)測定程序blastn; 數(shù)據(jù)庫nr ；預期10 ；過濾低復雜度；比對成對；字長11。其中所述核苷酸序列編碼修飾 目的蛋白質(zhì)糖基化的蛋白質(zhì)。還公開了如SEQ ID NO :20 (GNTl-GnT-III ；圖 5i)或 SEQ ID NO 19 (GnT-ΙΙΙ，圖 5k)中公開的氨基酸序列。目的蛋白質(zhì)的“經(jīng)修飾的糖基化”表示包含經(jīng)修飾的糖基化(例如如本文所述)之 目的蛋白質(zhì)的N-聚糖譜與在野生型植物中產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)的N-聚糖譜不同。糖基化的 修飾可包括目的蛋白質(zhì)中一種或多種聚糖的增加或減少，或者GlnAc的平分(bisecting)。例如，目的蛋白質(zhì)可以展示降低的木糖基化、降低的巖藻糖基化或既有降低的木糖基化又 有降低的巖藻糖基化?；蛘?，可以以下述方式修飾目的蛋白質(zhì)的N-聚糖譜，使得提高半乳 糖基化量，并且任選地降低木糖基化、巖藻糖基化量或二者都降低。另外，可以產(chǎn)生平分型 GlnAc，這會導致蛋白質(zhì)中巖藻糖基化和木糖基化數(shù)量的降低。目的蛋白質(zhì)中“降低的木糖基化”或“降低的巖藻糖基化”表示目的蛋白質(zhì)上可檢 測的N-聚糖的木糖基化、巖藻糖基化或者木糖基化及巖藻糖基化二者的量比在野生型植 物中產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)上可檢測的木糖基化、巖藻糖基化或二者的量少10%，并且其中使 用相同的方法分離目的蛋白質(zhì)并測定木糖基化或巖藻糖基化。例如，與在野生型植物中產(chǎn) 生的相同目的蛋白質(zhì)相比，目的蛋白質(zhì)可包含少于5%的被巖藻糖基化、木糖基化或二者兼 有的N-聚糖殘基，目的蛋白質(zhì)上可檢測的N-聚糖殘基中少于可被巖藻糖基化、木糖基 化或二者兼有，目的蛋白質(zhì)上可檢測的N-聚糖殘基中約0. 1到約2%可以被巖藻糖基化和 木糖基化，從0. 5到約1. 5 %的N-聚糖殘基被巖藻糖基化和木糖基化，或約0. 7到約1. 0 % 的N-聚糖殘基被巖藻糖基化和木糖基化。如圖6和7中所示，通過使用本文所述方法，可以產(chǎn)生顯示經(jīng)修飾的糖基化譜的 目的蛋白質(zhì)。例如，與GNTl-GalT共表達目的蛋白質(zhì)時，產(chǎn)生了具有免疫上檢不出巖藻糖 或木糖殘基的目的蛋白質(zhì)。目的蛋白質(zhì)表位的MALDI-T0F分析證明，將目的蛋白質(zhì)與GalT 或GNTl-GalT共表達時可以獲得具有經(jīng)修飾的糖基化模式的目的蛋白質(zhì)(見圖7A_C，C-插 圖)。例如，圖7A展示了野生型植物中所表達目的蛋白質(zhì)的表位的糖基化譜。目的蛋白質(zhì) 包含若干木糖基化和巖藻糖基化的殘基(分別為H和J峰，圖7A)。將目的蛋白質(zhì)與GalT 共表達時這些殘基減少或缺失(圖7B)。另外，與GalT共表達時在目的蛋白質(zhì)中觀察到新 的木糖基化殘基(F峰)以及半乳糖基化殘基的增加(見C、F、K峰，圖7B)。目的蛋白質(zhì)與 GNTl-GalT的共表達得到下述N-聚糖譜，其特征是具有少于1 %的木糖基化和巖藻糖基化 殘基(見圖7C-插圖)，以及半乳糖基化殘基的增加(K峰；圖7C)。因此，本發(fā)明提供了合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)的方法(方法A)， 其包括提供包含下述核苷酸序列的植物，所述核苷酸序列編碼第一核苷酸序列和第二核 苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼人β-1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)，所述第一核苷酸序 列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述 第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；培養(yǎng)所述植物，并且表達第一 和第二核苷酸序列，從而合成包含經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)。編碼GalT的第一序列 與編碼目的蛋白質(zhì)的第二序列的共表達導致在目的蛋白質(zhì)的成熟中聚糖上添加β_1，4半 乳糖，從而降低目的蛋白質(zhì)中聚糖的巖藻糖基化、木糖基化或二者均降低。另外，與不表達 GalT的野生型植物中產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)的半乳糖基化量相比，使用該方法可以提高目的蛋 白質(zhì)的半乳糖基化程度。還提供了用于合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)的方法(方法B)，其包 括在植物或植物部分中以瞬時方式表達下述核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼第一和第 二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼人β -1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT ；SEQ ID NO 14 ； 圖5b)，所述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序 列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；表達 所述第一和第二核苷酸序列，從而合成包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化的聚糖的目的蛋白質(zhì)。
14編碼GalT的第一序列與編碼目的蛋白質(zhì)的第二序列的共表達導致在目的蛋白質(zhì)的成熟中 聚糖上添加β _1，4半乳糖，從而降低了目的蛋白質(zhì)的聚糖的巖藻糖基化、木糖基化或二者 均降低。另外，與不表達GalT的野生型植物中產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)的半乳糖基化量相比，可 提高目的蛋白質(zhì)的半乳糖基化程度。表達步驟可包括瞬時共表達第一和第二核苷酸序列， 或者穩(wěn)定共表達第一和第二核苷酸序列。本發(fā)明還提供了合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)的替代性方法(方法 C)，其包括提供下述植物，所述植物包含第一雜合核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第 一雜合核苷酸序列編碼第一雜合蛋白質(zhì)，所述第一雜合蛋白質(zhì)包含與GalT (人β 1，4-半乳 糖基轉(zhuǎn)移酶；GNTl-GalT ；SEQ ID NO 17 ；圖5d)催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶 (GNTl)CTS結(jié)構(gòu)域，所述第一雜合核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)序列有效連接， 所述第二核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié) 區(qū)有效連接；培養(yǎng)所述植物并且表達第一雜合核苷酸序列和第二核苷酸序列，從而合成包 含經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)。編碼GNTl-GalT的第一雜合序列與編碼目的蛋白質(zhì) 的第二序列的共表達導致在目的蛋白質(zhì)的成熟中聚糖上添加β 1，4_半乳糖，從而降低目 的蛋白質(zhì)的聚糖的巖藻糖基化和木糖基化。例如，與不表達GNTl-GalT的野生型植物中產(chǎn) 生的目的蛋白質(zhì)相比，可以將巖藻糖基化、木糖基化或二者的程度降低約0. 5到約5%，或 約0. 5到約2%。提供了用于合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)的另外的替代性方法(方 法D)，其包括在植物或植物部分中以瞬時方式表達下述核苷酸序列，所述核苷酸序列編 碼第一雜合核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一雜合核苷酸序列編碼GNTl-GalT，所述 第一雜合核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序列編碼 目的蛋白質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；表達所述第 一和第二核苷酸序列，從而合成包含經(jīng)修飾的N-糖基化的蛋白質(zhì)。編碼GNTl-GalT的第 一雜合序列和編碼目的蛋白質(zhì)的第二序列的共表達導致在目的蛋白質(zhì)的成熟中的聚糖上 添加β_1，4半乳糖，從而降低目的蛋白質(zhì)的巖藻糖基化和木糖基化程度。例如，與不表達 GNTl-GalT的野生型植物中產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)相比，巖藻糖基化、木糖基化或二者的程度可 以被降低約0. 5到約5%，或約0. 5到約2%的量。表達步驟可包括瞬時共表達第一和第二 核苷酸序列，或者穩(wěn)定共表達第一和第二核苷酸序列。本發(fā)明還提供了用于合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化的蛋白質(zhì)的另外的替代性方法 (方法Ε)，其包括提供包含下述核苷酸序列的植物，所述核苷酸序列編碼第一核苷酸序 列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼人β -1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移 酶(GalT)，所述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷 酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接， 所述第三核苷酸序列編碼基因沉默性抑制基因例如HcPro，所述第三核苷酸序列與在所述 植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；培養(yǎng)所述植物，并表達所述第一、第二和第三核苷酸序列 從而合成包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化的聚糖的目的蛋白質(zhì)。編碼GalT的第一序列與編碼 目的蛋白質(zhì)的第二序列的共表達導致在目的蛋白質(zhì)的成熟中聚糖上添加β_1，4半乳糖， 從而與使用不表達GalT的野生型植物產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)相比，降低目的蛋白質(zhì)中聚糖的 巖藻糖基化和木糖基化。與不表達GalT的野生型植物中產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)的半乳糖基化量相比，可以提高目的蛋白質(zhì)的半乳糖基化程度。編碼沉默性抑制基因的第三序列的表達 確保半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和目的蛋白質(zhì)的高產(chǎn)量。還提供了合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)的方法(方法F)，其包括 在植物或植物部分中以瞬時方式表達下述核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼第一核苷酸序 列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼人β -1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移 酶(GalT)，所述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷 酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接， 所述第三核苷酸序列編碼基因沉默性抑制基因例如HcPro，所述第三核苷酸序列與在所述 植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；表達所述第一、第二和第三核苷酸序列，從而合成包含經(jīng) 修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)。編碼GalT的第一序列與編碼目的蛋白質(zhì)的第二序列的共 表達導致在目的蛋白質(zhì)的成熟中聚糖上添加β -1，4半乳糖，從而降低目的蛋白質(zhì)中聚糖 的巖藻糖基化和木糖基化。與不表達GalT的野生型植物中產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)的半乳糖基 化量相比，可以提高目的蛋白質(zhì)的半乳糖基化程度。編碼沉默性抑制基因的第三序列的表 達確保半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和目的蛋白質(zhì)的高產(chǎn)量。表達步驟可包括瞬時共表達第一和第二核 苷酸序列，或穩(wěn)定共表達第一和第二核苷酸序列。因此，本發(fā)明提供了合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)的方法(方法G)， 其包括提供包含下述核苷酸序列的植物，所述核苷酸序列編碼第一核苷酸序列和第二核 苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(GnT-III)，所述第一核苷酸 序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所 述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；培養(yǎng)所述植物，并且表達第 一和第二核苷酸序列，從而合成包含經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)。編碼GnT-III的第 一序列與編碼目的蛋白質(zhì)的第二序列的共表達導致在目的蛋白質(zhì)的成熟中聚糖上連 接甘露糖上添加β-1，4連接N-乙酰葡糖胺(GlnAc)殘基(平分型GlnAc)，從而與不表達 GnT-III的野生型植物中產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)相比時，降低目的蛋白質(zhì)中聚糖的巖藻糖基化、 木糖基化或二者均降低。編碼GnT-III (第一核苷酸序列)、目的蛋白質(zhì)(第二核苷酸序列) 的序列或者第一和第二核苷酸序列二者均可瞬時表達。如果瞬時表達所述序列，則也可以 使用編碼基因沉默性抑制基因例如HcPro的第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列與在所 述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；并且表達所述第一、第二和第三核苷酸序列，從而合成 包含經(jīng)修飾的糖基化的目的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)的替代性方法(方法 H)，其包括提供包含第一雜合核苷酸序列和第二核苷酸序列的植物，所述第一雜合核苷酸 序列編碼第一雜合蛋白，所述第一雜合蛋白編碼與GnT-III催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖 氨基轉(zhuǎn)移酶(GNTl) CTS結(jié)構(gòu)域(N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶；GNTl-GnT-III SEQ ID NO :20)，所 述第一雜合核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序列編 碼目的蛋白質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)序列有效連接；培養(yǎng)所 述植物，并表達所述第一雜合核苷酸序列和第二核苷酸序列，從而合成包含經(jīng)修飾的N-糖 基化的目的蛋白質(zhì)。編碼GNTl-GnT-III的第一雜合序列與編碼目的蛋白質(zhì)的第二序列的 共表達導致在目的蛋白質(zhì)的成熟中聚糖上添加β-1，4-連接N-乙酰葡糖胺(GlnAc)殘基 至連接甘露糖(平分GlnAc)，從而降低目的蛋白質(zhì)的聚糖的巖藻糖基化和木糖基化。例如，與不表達GNTl-GnT-III的野生型植物中產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)相比，可以將巖藻糖基 化、木糖基化或二者的程度降低約0. 5到約5%，或約0. 5到約2%的量?？梢运矔r表達編 碼GNTl-GnT-III (第一核苷酸序列)、目的蛋白質(zhì)(第二核苷酸序列)的序列，或編碼第一 和第二核苷酸序列的序列。如果瞬時表達所述序列，則也可以使用編碼基因沉默性抑制基 因例如HcPro的第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)有 效連接；并且表達所述第一、第二和第三核苷酸序列，從而合成包含經(jīng)修飾的糖基化的目的 蛋白質(zhì)?？梢詫幋a目的蛋白質(zhì)的核苷酸序列進行額外的修飾，以確保高產(chǎn)率。例如，也可 以將編碼目的蛋白質(zhì)的第二序列與下述序列融合，所述序列編碼具有使蛋白質(zhì)停留在內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)(ER)內(nèi)之活性的序列，例如但不限于KDEL(LyS-ASp-Glu-Leu)序列，或其他已知的ER停 留序列，例如HDEL或KKSS。另外，產(chǎn)生復合目的蛋白質(zhì)時，在如上文所述A-H任何方法中使用的第二核苷酸 序列可編碼復合蛋白質(zhì)的多于一個肽或結(jié)構(gòu)域。例如，在目的蛋白質(zhì)是抗體的情況下，第二 核苷酸序列可包含兩條各自編碼抗體一部分的兩個第二核苷酸序列2A和2B，例如核苷酸 2A可編碼抗體輕鏈，序列2B編碼抗體重鏈。這樣的構(gòu)建體的非限制性例子在圖1中提供，其 中各個R216和R610構(gòu)建體包含兩條核苷酸序列2A和2B，2A編碼與在所述植物中有活性的 調(diào)節(jié)區(qū)(例如但不限于質(zhì)體藍素啟動子)有效連接的C5-1 LC(C5-1的輕鏈)，2B編碼與在 所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)(例如但不限于質(zhì)體藍素啟動子)有效連接的C5-1重鏈(C5-1 HC)，所述質(zhì)體藍素啟動子包含圖Ib或SEQ ID NO 23的556-999位核苷酸；US7，125，978， 其通過參考并入本文)。如圖1中所示，并且參照R610，可以將KDEL序列與肽2A或2B之 一的C端區(qū)融合，例如但不限于，可以將KDEL序列與抗體的重鏈融合，以確?？贵w停留在ER 中。第二核苷酸序列所編碼的每種蛋白質(zhì)均可被糖基化。可以從植物中回收通過A-H中任何方法產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)。另外，可以使用本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的標準技術(shù)，部分純化或純化目的蛋白質(zhì)。在植物中共表達核苷酸序列的情況下，可以使用標準轉(zhuǎn)化技術(shù)、瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)將 每種期望的核苷酸序列引入植物中，可以將各自表達一種或多種期望的核苷酸序列的兩種 或更多植物雜交，以獲得共表達所需核苷酸序列組合的植物，或者可以合并上述技術(shù)的組 合。例如,可以使用表達編碼 GalT、GNTl-GalT、GalT 和 GNTl-GalT、GnT-III、GNTl-GnT-III、 GNTl-GnT-III和Gnt-III或其組合的序列的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物進行瞬時表達。因此，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生下述植物的方法(方法I)，所述植物可以用作產(chǎn)生具 有經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)的平臺。該方法包括提供表達一種或多種第一核苷酸 序列的植物并表達所述一種或多種核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼GalT、GNTl-GalT 或GalT和GNTl-GalT 二者。為了產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)，使用涉及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或瞬時轉(zhuǎn)化的標準技 術(shù)將編碼目的蛋白質(zhì)的第二核苷酸序列引入平臺植物中，并且表達所述第二核苷酸序列， 以使產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化的聚糖；或者將表達第一核苷酸序列 的植物與表達第二核苷酸序列的第二植物雜交，以這種方式使得產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)包含具 有經(jīng)修飾的N-糖基化的聚糖。可以從植物中提取目的蛋白質(zhì)，并且需要時可以使用標準方 法分離和純化目的蛋白質(zhì)。
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因此，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生下述植物的方法(方法J)，所述植物可以用作產(chǎn)生 具有經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)的平臺。該方法包括提供表達一種或多種第一核 苷酸序列的植物并表達所述一種或多種核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼GnT-III、 GNTl-GnT-III或表達GnT-III和GNTl-GnT-III 二者。為了產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)，使用涉及穩(wěn)定 轉(zhuǎn)化或瞬時轉(zhuǎn)化的標準技術(shù)將編碼目的蛋白質(zhì)的第二核苷酸序列引入平臺植物中，并且表 達所述第二核苷酸序列，以使產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化的聚糖；或者 將表達第一核苷酸序列的植物與表達第二核苷酸序列的第二植物雜交，以這種方式使得產(chǎn) 生的目的蛋白質(zhì)包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化的聚糖?？梢詮闹参镏刑崛∧康牡鞍踪|(zhì)，并且 需要時可以使用標準方法分離和純化目的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生下述植物的方法(方法K)，所述植物可以用作產(chǎn)生 具有經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)的平臺。該方法包括提供表達一種或多種第一 核苷酸序列的植物并表達所述一種或多種核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼GalT、 GNTl-GalT, GalT 和 GNTl-GalT、GnT-III、GNTl-GnT-III、GnT-III 和 GNTl-GnT-III 或其組 合。為了產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)，使用涉及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或瞬時轉(zhuǎn)化的標準技術(shù)將編碼目的蛋白質(zhì)的 第二核苷酸序列引入平臺植物中，并且表達所述第二核苷酸序列，使得產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì) 包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化的聚糖；或者將表達第一核苷酸序列的植物與表達第二核苷 酸序列的第二植物雜交，以這種方式使得產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化 的聚糖。可以從植物中提取目的蛋白質(zhì)，并且需要時可以使用標準方法分離和純化目的蛋 白質(zhì)?？梢詫幋aGalT、GNTl-GalT, GnT-III、GNTl-GnT-III、目的蛋白質(zhì)或其組合的核 苷酸序列進行密碼子優(yōu)化，以提高植物中的表達水平。密碼子優(yōu)化表示對結(jié)構(gòu)基因或其片 段而言，選擇合適的DNA核苷酸用于寡核苷酸構(gòu)建塊的合成及其隨后的酶促裝配，從而接 近植物中的密碼子使用。為了優(yōu)化外來序列在植物中的表達，可以根據(jù)需要使用或者改變核苷酸序列(其 可以是野生型或合成的序列)，從而與由未經(jīng)修飾的核苷酸序列編碼時產(chǎn)生的蛋白質(zhì)相比， 以更高的水平產(chǎn)生相應蛋白質(zhì)，例如GalT、GNTl-GalT, GnT-III、GNTl-GnT_III、目的蛋白 質(zhì)或其組合。例如但不限于，所述序列可以是合成的序列，針對植物中的密碼子使用而優(yōu)化 過，包含與野生型序列至少約80%的同一性，所述同一性使用序列比較技術(shù)測定，例如但不 限于BLAST (可以通過GenBank獲得；使用默認參數(shù))。還考慮可以在植物組織中表達編碼 目的蛋白質(zhì)或其衍生物之序列的片段或部分，所述片段或部分顯示有用的生物學特性，例 如但不限于抗原特性。為了使GalT、GNTl-GalT, GnT-III、GNTl-GnT-III和目的蛋白質(zhì)的表達水平和 轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)產(chǎn)生盡可能高，可以使用與Sardana等(PlantCell Reports 15:677-681; 1996)所列類似的步驟檢查核酸序列并修飾編碼區(qū)，以優(yōu)化該基因在植物中的表達。來自高 度表達的雙子葉植物基因的密碼子使用表格可得自若干來源，包括Murray等(Nuc Acids Res. 17 477-498 ； 1989)。另外，序列優(yōu)化也包括減少密碼子串聯(lián)重復、消除隱藏的剪接位 點、減少重復的序列(包括反向重復)，并且可以使用例如Letol. 0(Entelechon，Germany) 來測定。因此，本發(fā)明提供了合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)的方法(L)，如任一上述方法(方法A-K)中所述，其中針對在植物中的表達優(yōu)化一種或多種編碼GalT、 GNTl-GalT、GnT-III、GNTl-GnT-ni、目的蛋白質(zhì)或其組合的核苷酸序列。另外，本發(fā)明涉及包含下述核苷酸序列的植物、植物細胞或種子，所述核苷酸序列 編碼GalT、GNTl-GalT、GnT-III、GNTl-GnT-III或其組合，其各自與在所述植物中有活性的 調(diào)節(jié)區(qū)有效連接。植物、植物細胞或種子可還包含編碼一種或多種目的蛋白質(zhì)的第二核苷 酸序列，所述第二核苷酸序列與一種或多種在所述植物中有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)有效連接。 可以針對在植物、植物細胞或植物種子中的表達，對第一核苷酸序列、第二核苷酸序列或第 一和第二核苷酸序列二者進行密碼子優(yōu)化。“有效連接”表示特定序列直接或間接相互作用，從而實現(xiàn)預期的功能，例如介導 或調(diào)控基因表達。有效連接的序列的相互作用可以例如由與所述有效連接序列相互作用的 蛋白質(zhì)來介導。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和目的序列在下述情況下是有效連接的所述序列在功能上相 連，使得允許由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)介導或調(diào)控目的序列的轉(zhuǎn)錄。術(shù)語“植物部分”表示來自于植物的任何部分，包括完整植物、從植物獲得的組織， 例如但不限于葉、葉和莖、根、地上部分(包括葉、莖并任選地包括植物的花部分)、得自植 物的細胞或原生質(zhì)體。術(shù)語“植物物質(zhì)”表示來自于植物的任何材料。植物物質(zhì)可包括完整植物、其組 織、細胞或任何級分。植物物質(zhì)可包括細胞內(nèi)植物組分、細胞外植物組分、植物的液體或固 體提取物，或其組合。另外，植物物質(zhì)可包括來自植物葉、莖、果實、根或其組合的植物、植物 細胞、組織、液體提取物或其組合。植物物質(zhì)可包括未進行任何加工步驟的植物或其部分。 然而，還考慮到可以對植物材料進行如下文所述的最小限度加工步驟，或更劇烈的加工，包 括使用本領(lǐng)域普遍已知的技術(shù)進行部分或?qū)嵸|(zhì)性的蛋白質(zhì)純化，所述技術(shù)包括但不限于層 析、電泳等等。術(shù)語“最小限度加工”表示包含目的蛋白質(zhì)的植物物質(zhì)(例如植物或其部分)被 部分純化，以產(chǎn)生植物提取物、勻漿、植物勻漿的級分等等。部分純化可包括但不限于破壞 植物細胞結(jié)構(gòu)，從而得到包含可溶性植物組分和不溶性植物組分的組合物，所述不溶性植 物組分可以通過例如但不限于離心、過濾或其組合而被分離。在這一點上，可以通過使用真 空或離心提取容易地獲得分泌到葉或其他組織的細胞外空間的蛋白質(zhì)，或者可以在壓力下 提取組織，這通過經(jīng)過滾筒或研磨等等來擠壓蛋白質(zhì)或者將蛋白質(zhì)從細胞外空間中釋放而 實現(xiàn)。最小限度加工也可以涉及制備可溶性蛋白質(zhì)的粗提物，因為這些制備物會具有來自 次級植物產(chǎn)品的可忽略的污染。另外，最小限度加工可涉及從葉中水性提取可溶蛋白質(zhì)，然 后用任何合適的鹽沉淀。其他方法可包括大規(guī)模浸漬和果汁提取，從而允許直接使用提取 物。植物材料或組織形式的植物物質(zhì)可以經(jīng)口遞送給受試者。植物物質(zhì)可以作為飲食 補劑的一部分與其他食物一起施用，或者被包封起來施用。也可以濃縮植物物質(zhì)或組織，以 改善或提高風味，或根據(jù)需要與其他材料、成分或藥物賦形劑一起提供?？紤]可將包含目的蛋白質(zhì)的植物以多種方式施用給受試者(例如動物或人)，這 取決于需要和情況。例如，在使用前可以以粗制、部分純化或純化的形式提取得自植物的目 的蛋白質(zhì)。如果蛋白質(zhì)有待純化，則其可以在可食用或不可食用的植物中產(chǎn)生。另外，如果 經(jīng)口施用蛋白質(zhì)，則可收獲植物組織并直接飼喂給受試者，或者可以在飼喂前干燥所收獲
19的組織，或者可以允許在所述植物上放牧動物而不進行預先收獲。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還考 慮了將收獲的植物組織作為動物飼料內(nèi)的食物補劑而提供。如果在沒有或者幾乎沒有進一 步加工的情況下將植物組織飼喂給動物，則優(yōu)選要施用的植物組織是可食用的。如實施例中更詳細描述的，以瞬時方式將GalT、GNTl-GalT和目的蛋白質(zhì)引入植 物中。使用適當抗體的免疫分析證明，轉(zhuǎn)化細胞中存在分子量150kDa的蛋白質(zhì)(圖2、3A 和3B)。另外，在得自表達任一構(gòu)建體的植物的提取物中，可檢測到GalT或GNTl-GalT，并 且在植物中表達GNTl-GalT時觀察到目的蛋白質(zhì)中改變的N-糖基化(圖6)。因此，重組表 達的GlaT或GNTl-GalT在植物中是有生物活性的。向植物中引入GalT-FLAG或GNTl-GalT-FLAG(即其C端有FLAG表位標簽的GalT 或GNTl-GalT，從而允許免疫檢測轉(zhuǎn)化體中的重組蛋白質(zhì))。可以使用抗FLAG抗體，用 Western印跡分析證明轉(zhuǎn)化細胞中存在正確的蛋白質(zhì)。“類似物”或“衍生物”包括對編碼GalT (SEQ ID NO 14) ,GalT的催化結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 14的368-1198位核苷酸；編碼圖5b的加粗序列)或GNTl-GalT (SEQ ID NO 17的 248-1077位核苷酸；編碼圖5b的加粗序列)之核苷酸序列進行任何替換、缺失或添加，條 件是在植物中表達時，所述序列修飾或與GalT的CST融合時修飾目的蛋白質(zhì)的糖基化譜， 例如與不存在異位表達的GalT (SEQ ID NO 14)或GNTl-GalT (SEQ IDNO 17)的植物中產(chǎn) 生的目的蛋白質(zhì)的糖基化譜相比，降低目的蛋白質(zhì)中聚糖的巖藻糖基化、木糖基化或二者 都降低，或提高目的蛋白質(zhì)的半乳糖基化。例如，序列編碼的蛋白質(zhì)可以在N-聚糖成熟期 間添加末端半乳糖。核酸序列的衍生物和類似物通常與核酸序列顯示大于80%的同一性， 例如約 80-100%的序列同一性，或約 80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100%的序列同一 性。序列同一性可以通過使用 BLAST 算法(GenBank :ncbi. nlm. nih. Rov/cRi-bin/BLAST/) 使用默認參數(shù)(程序=Wastn ；數(shù)據(jù)庫nr ；預期10 ；過濾低復雜度；比對成對；字長11) 測定。類似物或其衍生物也包括在嚴格雜交條件(見Maniatis等，in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982,第 387-389 頁，或 Ausubel 等(編)1989, Current Protocols in Molecular Biology,第 1 卷，Green Publishing Associates, Inc.,禾口 John Wiley & Sons, Inc. , New York, at p. 2. 10. 3)下與本文所述 任一 GalT(SEQ ID NO 14)、GNATl-GalT(SEQID NO 18)序列雜交的核苷酸序列，條件是 所述序列編碼修飾目的蛋白質(zhì)糖基化譜的蛋白質(zhì)，例如與不存在GalT(SEQ ID N0:14)或 GNTl-GalT(SEQ ID NO 17)時產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)的糖基化譜相比，降低目的蛋白質(zhì)中聚糖 的巖藻糖基化、木糖基化或二者都降低，或者提高目的蛋白質(zhì)的半乳糖基化。例如，所述序 列編碼的蛋白質(zhì)可以在N-聚糖成熟期間添加末端半乳糖。這樣的嚴格雜交條件的一個例 子可以是雇65°C下在7%SDS、lmMEDTA、0. 5M Na2HPO4,pH 7. 2中與合適的探針雜交16-20小 時，所述探針例如但不限于[Y_32P]dATP標記的探針。然后在65°C下在5% SDS、lmMEDTA、 40mM Na2HPO4, pH 7. 2 中洗滌 30 分鐘，之后在 65°CT 1% SDSUmM EDTA、40mM Na2HPO4, pH 7. 2中洗滌30分鐘?？梢栽谠摼彌_液中重復洗滌，以降低背景。類似地，本發(fā)明包括對編碼GnT-III(SEQ ID NO :16)、GnT-ΙΙΙ催化結(jié)構(gòu)域或 GNTl-GnT-IIKSEQ ID NO 20)的核苷酸序列進行修飾，條件是在植物中表達時，所述序列 編碼下述蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)修飾或在與GnT-III的CST融合時修飾目的蛋白質(zhì)的糖基 化譜，例如與不存在異位表達的GnT-III (SEQ ID NO 16)或GNTl-GnT-III (SEQ ID N0:26)的植物中產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)的糖基化譜相比，平分GlnAc并降低目的蛋白質(zhì)的聚糖的 巖藻糖基化、木糖基化或二者都降低。核酸序列的衍生物和類似物通常與核酸序列顯示 大于80%的同一性，例如從80-100%的序列同一性，或約80、82、84、86、88、90、92、94、96、 98、100%的同一性。序列同一性可以通過使用BLAST算法(GenBank :ncbi. nlm. nih. gov/ csi^bin/BLAST/)使用默認參數(shù)(程序blastn ；數(shù)據(jù)庫nr ；預期10 ；過濾低復雜度；比 對成對；字長11)測定。類似物或其衍生物也包括在嚴格雜交條件(見Maniatis等， in Molecular Cloning(A Laboratory Manual), ColdSpring Harbor Laboratory,1982, % 387-389 M, ^ Ausubel ^(H) 1989, Current Protocols in Molecular Biology, 第 1 卷，Green PublishingAssociates, Inc.,禾口 John Wiley & Sons, Inc. , New York, at p. 2. 10. 3)下與本文所述任一GnT-III (SEQ ID NO :16、GNATl-GnT_III (SEQ ID NO 26)序列 雜交的核苷酸序列，條件是所述序列編碼這樣的蛋白質(zhì)，其與不存在GnT-III(SEQ ID N0 16)或GNTl-GnT-III (SEQ ID NO 26)時產(chǎn)生的目的蛋白質(zhì)的糖基化譜相比，修飾目的蛋白 質(zhì)的糖基化譜。這樣的嚴格雜交條件的一個例子可以是在65°C下7% SDSUmM EDTA、0. 5M Na2HPO4, pH 7. 2中與合適的探針雜交16-20小時，所述探針例如但不限于[Y -32PjdATP標 記的探針。然后在65°C下在5% SDSUmM EDTA、40mMNa2HP04，pH 7. 2中洗滌30分鐘，之后 在65°C下SDSUmM EDTA、40mM Na2HPO4, pH 7. 2中洗滌30分鐘?？梢栽谠摼彌_液中重 復洗滌，以降低背景?！罢{(diào)節(jié)區(qū)”、“調(diào)節(jié)元件”或“啟動子”表示核酸的一部分，所述部分通常(但不總是) 處于基因的蛋白編碼區(qū)上游，其可以由DNA或RNA任一組成，或者由DNA和RNA 二者組成。 當調(diào)節(jié)區(qū)有活性并且與目的基因有效關(guān)聯(lián)或有效連接時，這可導致目的基因的表達。調(diào)節(jié) 元件可以能夠介導器官特異性，或者控制發(fā)育或時間上的基因活化?！罢{(diào)節(jié)區(qū)”包括啟動子 元件、展示基本啟動子活性的核心啟動子元件、可應答于外部刺激而被誘導的元件、介導啟 動子活性的元件例如負調(diào)節(jié)元件或轉(zhuǎn)錄增強子。本文中使用“調(diào)節(jié)區(qū)”還包括在轉(zhuǎn)錄后有 活性的元件，例如調(diào)控基因表達的調(diào)節(jié)元件如翻譯和轉(zhuǎn)錄增強子、翻譯和轉(zhuǎn)錄抑制子、上游 活化序列和mRNA不穩(wěn)定性決定子。若干后面這些元件可以位于編碼區(qū)的近端。在本公開內(nèi)容的上下文中，術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”或“調(diào)節(jié)區(qū)” 一般表示通常(但不總 是)位于結(jié)構(gòu)基因編碼序列上游(5')的DNA序列，其通過提供RNA聚合酶和/或在具體 位點上開始轉(zhuǎn)錄所需的其他因子的識別來控制編碼區(qū)的表達。然而應當理解，位于內(nèi)含子 中或序列3'的其他核苷酸序列也可有助于調(diào)節(jié)目的編碼區(qū)的表達。提供RNA聚合酶或其 他轉(zhuǎn)錄因子的識別從而確保在具體位點上啟始的調(diào)節(jié)元件的一個例子是啟動子元件。大部 分(但非所有)真核啟動子元件含有TATA盒，所述TATA框是通常位于轉(zhuǎn)錄起點上游約25 個堿基對處、由腺苷和胸苷核苷酸堿基對組成的保守核酸序列。啟動子元件包含負責轉(zhuǎn)錄 啟始的基本啟動子元件，以及修飾基因表達的其他調(diào)節(jié)元件(如上文所列)。存在若干類型的調(diào)節(jié)區(qū)，包括發(fā)育調(diào)節(jié)型、誘導型或組成型。發(fā)育調(diào)節(jié)型或者控制 其所控制基因的差異表達的調(diào)節(jié)區(qū)在某些器官或器官的組織中在所述器官或組織發(fā)育期 間的特定時間被活化。然而，屬于發(fā)育調(diào)節(jié)型的一些調(diào)節(jié)區(qū)可優(yōu)先在特定發(fā)育階段雇某些 器官或組織中具有活性，它們也可以以發(fā)育調(diào)節(jié)型方式具有活性，或者在植物中其他器官 或組織中處于基礎(chǔ)水平。組織特異性調(diào)節(jié)區(qū)(例如種子特異性調(diào)節(jié)區(qū))的例子包括油菜籽 蛋白啟動子和十字花科蛋白(cruciferin)啟動子(Rask等，1998，J. Plant Physiol. 152 595-599 ;Bilodeau等，1994，Plant Cell 14:125-130)。葉特異型啟動子的例子包括質(zhì)體 藍素啟動子(US 7，125，978，其通過參考并入本文；SEQ ID NO 23 ；圖lb)。誘導型調(diào)節(jié)區(qū)是能夠應答于誘導物而直接或間接活化一個或多個DNA序列或基 因的調(diào)節(jié)區(qū)。在不存在誘導物時，DNA序列或基因不會被轉(zhuǎn)錄。通常，與誘導型調(diào)節(jié)區(qū)特異 性結(jié)合從而活化轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子可以以無活性的形式存在，所述無活性形式隨后被誘導 劑直接或間接轉(zhuǎn)化為活性形式。然而，也可以不存在蛋白質(zhì)因子。誘導物可以是化學誘導 物，例如蛋白質(zhì)、代謝物、生長調(diào)節(jié)劑、除草劑或酚類化合物，或是由熱、冷、鹽或有毒元素直 接造成或通過病原體或致病劑(例如病毒)間接造成的生理脅迫?？梢酝ㄟ^將誘導物外部 應用于細胞或植物，例如通過噴霧、澆水、加熱或類似的方法，使含有誘導型調(diào)節(jié)區(qū)的植物 細胞與誘導物接觸。誘導型調(diào)節(jié)元件可來自于植物或非植物基因(例如Gatz，C.和Lenk， I.R.P.，1998，Trends Plant Sci. 3，352-358 ；其通過參考并入)。潛在的誘導型啟動子的例 子包括但不限于四環(huán)素誘導型啟動子(Gatz，C.，1997，Ann. Rev. PlantPhysiol. Plant Mol. Biol. 48，89-108 ；其通過參考并入)、類固醇誘導型啟動子(Aoyama，T.和Chua，N.H.，1997， Plant J. 2,397-404 ；其通過參考并入)和乙醇誘導型啟動子(Salter,M. G.等，1998，Plant Journal 16，127-132 ；Caddick, Μ. X.等，1998，Nature Biotech. 16，177-180 ；其通過參考 并入)、細胞分裂素誘導型 IB6 和 CKIl 基因(Brandstatter，I.和 Kieber，JJ. , 1998,Plant Cell 10,1009-1019 ；Kakimoto, Τ. , 1996, Science 274，982-985 ；其通過參考并入)和生長 素誘導型元件 DR5 (Ulmasov, Τ.，等，1997，Plant Cell9,1963-1971 ；其通過參考并入)。組成型調(diào)節(jié)區(qū)指導基因在整株植物的多個部分中和整個植物發(fā)育中持續(xù)表達。已 知的組成型調(diào)節(jié)元件的例子包括與以下相關(guān)的啟動子CaMV35S轉(zhuǎn)錄本(Odell等，1985， Nature，313 :810-812)、水稻肌動蛋白 1 (Zhang 等，1991，Plant Cell，3 :1155_1165)、肌動 蛋白 2 (An 等，1996，Plant J.，10 :107_121)或 tms 2 (U. S. 5，428，147，其通過參考并入本 文)，以及磷酸丙糖異構(gòu)酶1 (Xu等，1994，Plant Physiol. 106 :459_467)基因、玉米泛素1 基因(Cornejo 等，1993，Plant Mol. Biol. 29 :637_646)、擬南芥泛素 1 和 6 基因(Holtorf 等，1995，Plant Mol. Biol. 29 :637_646)和煙草翻譯起始因子 4A 基因(Mandel 等，1995 Plant Mol.Biol.29 :995-1004)。在本文中使用時，術(shù)語“組成型”不一定表示處于組成型 調(diào)節(jié)區(qū)控制下的基因在所有細胞類型中以相同水平表達，而是表示所述基因在大范圍的細 胞類型中表達，即使常常觀察到豐度的改變。本發(fā)明的一種或多種核苷酸序列可以在任何合適的植物宿主中表達，所述植物宿 主用本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化。合適的宿主的例子包括但不限于農(nóng)作物， 包括苜蓿、蕓苔、油菜(Brassica spp.)、玉米、煙草(Nicotiana spp.)、苜蓿、馬鈴薯、人參、 豌豆、燕麥、玉米、大豆、小麥、大麥、向日葵和棉花。本發(fā)明的一種或多種嵌合遺傳構(gòu)建體可還包含3’非翻譯區(qū)。3’非翻譯區(qū)是指包 含下述DNA區(qū)段的基因部分，所述DNA區(qū)段含有多聚腺苷酸化信號和能夠影響mRNA加工 或基因表達的任何其他調(diào)節(jié)信號。多聚腺苷酸化信號通常特征是影響向mRNA前體的3' 端添加多聚腺苷酸尾。盡管變異并不罕見，但是多聚腺苷酸信號通常通過存在與標準形式 5' AATAAA-3'的同源性來識別。本發(fā)明的一種或多種嵌合遺傳構(gòu)建體也可以包含其他增 強子，根據(jù)需要為翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子。這些增強子區(qū)域是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可 包括ATG起始密碼子及其序列。起始密碼子必須與編碼序列的開放讀碼框在框內(nèi)，以確保
22完整序列的翻譯。合適的3'區(qū)的非限制性例子是3'轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)，其含有下述基因的多聚腺 苷酸化信號農(nóng)桿菌腫瘤誘導(Ti)質(zhì)?；蚶珉僦瑝A合酶(Nos基因)，和植物基因例如 大豆儲存蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因的小亞基。為了幫助鑒定轉(zhuǎn)化植物細胞，可以進一步改造本發(fā)明的構(gòu)建體，使其包含植物選 擇標記。有用的選擇標記包括提供對化學品的抗性的酶，所述化學品例如抗生素，例如慶大 霉素、潮霉素、卡那霉素，或除草劑例如膦絲菌素、草甘膦、氯磺隆(chlorosulfuron)等等。 類似地，可以使用提供下述化合物的產(chǎn)生的酶，所述化合物可以通過顏色改變來鑒定，例如 ⑶S ( β -葡萄糖苷酸酶)，或通過發(fā)光來鑒定(例如螢光素酶或GFP)。還認為是本發(fā)明一部分的是含有本發(fā)明嵌合基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物、植物細胞 或種子。從植物細胞再生整株植物的方法也是本領(lǐng)域公知的。通常，將轉(zhuǎn)化植物細胞在適 當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基可含有選擇劑例如抗生素，其中使用選擇標記來幫助鑒定 轉(zhuǎn)化植物細胞。形成愈傷組織后，可以根據(jù)已知的方法，通過使用適當?shù)闹参锛に卮龠M根形 成，并將枝條轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上用于植物的再生。然后可以從種子或者使用無性繁殖技 術(shù)，使用植物建立重復的世代。也可以不使用組織培養(yǎng)物產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的調(diào)節(jié)元件也可以與目的編碼區(qū)組合，用于在適合轉(zhuǎn)化或瞬時表達的一系 列宿主生物中表達。這樣的生物包括但不限于植物(單子葉和雙子葉)，例如但不限于玉 米、谷物植物、小麥、大麥、燕麥、煙草(Nicotiana spp)、油菜(Brassica spp)、大豆、黃豆、 豌豆、苜蓿、馬鈴薯、番茄、人參和擬南芥。用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和再生這些生物的方法是本領(lǐng)域已建立的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的。獲得轉(zhuǎn)化和再生的植物的方法對本發(fā)明而言不是關(guān)鍵性的?！稗D(zhuǎn)化”表示遺傳信息(核苷酸序列)的物種間轉(zhuǎn)移，其表現(xiàn)為基因型、表型或二者 兼有。遺傳信息從嵌合構(gòu)建體到宿主的物種間轉(zhuǎn)移可以是可遺傳的，并且遺傳信息的轉(zhuǎn)移 被認為是穩(wěn)定的，或者轉(zhuǎn)移可以是瞬時的并且遺傳信息的轉(zhuǎn)移不是可遺傳的。本發(fā)明還包括合適的載體，所述載體包含適用于穩(wěn)定表達系統(tǒng)或瞬時表達系統(tǒng)的 嵌合構(gòu)建體。遺傳信息也可以在一個或多個構(gòu)建體中提供。例如，可以在一個構(gòu)建體中引 入編碼目的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，并使用單獨的構(gòu)建體引入第二核苷酸序列，所述第二核 苷酸序列編碼修飾目的蛋白質(zhì)之糖基化的蛋白質(zhì)。這些核苷酸序列可以隨后在植物中共表 達。然而，也可以使用編碼下述核苷酸序列的構(gòu)建體，所述核苷酸序列既編碼目的蛋白質(zhì)， 又編碼修飾目的蛋白質(zhì)糖基化譜的蛋白質(zhì)。在這種情況下，核苷酸序列應當包含第一序列 和第二序列，所述第一序列包含編碼目的蛋白質(zhì)的第一核酸序列，并與啟動子或調(diào)節(jié)區(qū)有 效連接，所述第二序列包含編碼修飾目的蛋白質(zhì)糖基化譜之蛋白質(zhì)的第二核酸序列，所述 第二序列與啟動子或調(diào)節(jié)區(qū)有效連接?！肮脖磉_”表示兩種或更多種核苷酸序列在植物和植物的同一組織中大致同時表 達。然而，核苷酸序列不需要在絕對相同的時間表達。更確切地說，所述兩種或更多種核苷 酸序列以下述方式表達，所述方式使得編碼的產(chǎn)物有相互作用的機會。例如，修飾目的蛋白 質(zhì)糖基化的蛋白質(zhì)可以在目的蛋白質(zhì)表達的周期之前或期間表達，從而發(fā)生對目的蛋白質(zhì) 糖基化的修飾。可以使用瞬時表達系統(tǒng)共表達所述兩種或更多種核苷酸序列，其中在兩種 序列均表達的條件下，大致同時將兩種或更多序列引入植物中?；蛘撸梢杂镁幋a目的蛋白
23質(zhì)的額外序列以瞬時或穩(wěn)定的方式轉(zhuǎn)化平臺植物，所述平臺植物包含核苷酸序列之一，例 如包含編碼修飾目的蛋白質(zhì)糖基化譜的蛋白質(zhì)的序列。在這種情況下，可以在期望的發(fā)育 階段，在期望的組織中表達編碼修飾目的蛋白質(zhì)糖基化譜的蛋白質(zhì)的序列，或者可以使用 誘導型啟動子誘導其表達，并且可以在類似的條件下和相同的組織中，表達編碼目的蛋白 質(zhì)的額外序列，以確保所述核苷酸序列被共表達?？梢允褂肨i質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔等將本 發(fā)明的構(gòu)建體引入植物細胞中。這些技術(shù)的綜述見例如Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology, AcademyPress, New York VIII, pp. 421-463 (1988)； Geierson 和 Corey，PlantMolecular Biology,第 2 版(1988)；和 Miki 和 Iyer， Fundamentals of GeneTransfer in Plants. In Plant Metabolism,第 2 版，DT. Dennis, DH Turpin, DDLefebrve, DB Layzell(eds), Addison ffesly, Langmans Ltd. London,第 561-579頁(1997)。其他方法包括直接DNA攝入、使用脂質(zhì)體、電穿孔、例如使用原生質(zhì) 體、顯微注射、微粒或頸須，和真空滲入。見例如Bilang，等(Gene 100:247-250(1991)， Scheid 等(Mol. Gen. Genet. 228 104-112，1991)，Guerche 等(Plant Science 52: 111-116，1987),Neuhause等(Theor. Appl Genet 75 :30_36，1987)，Klein 等，Nature 327 70-73(1987) ；Howell 等(Science 208 1265，1980)，Horsch 等(Science 227:1229-1231， 1985) ,DeBlock 等，Plant Physiology 91 :694_701，1989)，Methods for PlantMolecular Biology (Weissbach 禾口 Weissbach 編，Academic Press Inc. , 1988), Methods in Plant Molecular Biology(Schuler 禾口 Zielinski 編，AcademicPress Inc. ,1989), Liu 禾口 Lomonossoff (J. Virol Meth, 105 :343_348，2002，)、美國專利 Nos. 4，945，050 ；5，036，006 ； 和5，100，792，1995年5月10日提交的美國申請系列Nos. 08/438，666，和1992年9月25 日提交的07/951，715 (其均通過參考并入本文)。如下文所述，可使用瞬時表達法表達本發(fā)明的構(gòu)建體(見Liu和Lomonossoff， 2002, Journal of Virological Methods，105 :343_348 ；其通過參考并入本文)?；蛘呖梢?使用基于真空的瞬時表達方法，如Kapila等，1997所述，其通過參考并入本文。這些方法可 包括，例如但不限于農(nóng)桿菌接種法或農(nóng)桿菌滲入法，然而，也可以如上文所述使用其他瞬時 方法。使用農(nóng)桿菌接種法或農(nóng)桿菌滲入法時，包含期望核酸的農(nóng)桿菌混合物進入組織的細 胞間空間，所述組織例如葉、植物的地上部分(包括莖、葉和花)、植物的其他部分(莖、根、 花)或完整植物。穿過表皮后，農(nóng)桿菌感染并將t-DNA拷貝轉(zhuǎn)移進細胞中。t-DNA作為附加 體轉(zhuǎn)錄并且mRNA被翻譯，導致在轉(zhuǎn)染的細胞中產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)，然而，t-DNA在細胞核內(nèi)的 傳代是瞬時的?！澳康幕颉?、“目的核苷酸序列”或“目的編碼區(qū)”表示要在宿主生物(例如植物) 中表達的任何基因、核苷酸序列或編碼區(qū)。這些術(shù)語可互換使用。這樣的目的核苷酸序列可 包括但不限于其產(chǎn)物是目的蛋白質(zhì)的基因或編碼區(qū)。目的蛋白質(zhì)的例子包括例如但不限于 工業(yè)用酶、蛋白質(zhì)補充物、營養(yǎng)劑，用于飼料、食品或者飼料及食品用途的增值產(chǎn)品或其片 段，藥物活性蛋白質(zhì)，例如但不限于生長因子、生長調(diào)節(jié)劑、抗體、抗原及其片段，或其適用 于免疫或疫苗接種的衍生物等等。其他的目的蛋白質(zhì)可包括但不限于白介素，例如以下的 一種或多于一種=IL-I到IL-24，IL-26和IL-27，細胞因子，紅細胞生成素(EPO)，胰島素， G-CSF，GM-CSF，hPG-CSF，M-CSF或其組合，干擾素，例如干擾素-α、干擾素-β、干擾素-Y，凝血因子，例如因子VIII、因子IX或tPA hGH，受體，受體激動劑，抗體，神經(jīng)多肽，胰島素， 疫苗，生長因子，例如但不限于表皮生長因子、角質(zhì)形成細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子，生長 調(diào)節(jié)劑，抗原，自身抗原，其片段或其組合。如果目的核苷酸序列編碼對植物直接或間接有毒的產(chǎn)物，則通過使用本發(fā)明的方 法，可以通過在期望的組織或在期望的植物發(fā)育階段中選擇性地表達目的基因，來降低整 株植物中的這種毒性。另外，由瞬時表達引起的有限的表達周期可降低在植物中產(chǎn)生有毒 產(chǎn)物的影響。目的編碼區(qū)或目的核苷酸序列可以在任何合適的植物宿主中表達，所述宿主用本 發(fā)明的核苷酸序列或核酸分子或遺傳構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化，或者包含它們。合適的宿主的例 子包括但不限于擬南芥，農(nóng)作物，包括例如蕓苔、油菜(Brassica spp.)、玉米、煙草、苜蓿、 馬鈴薯、人參、豌豆、燕麥、水稻、大豆、小麥、大麥、向日葵和棉花。如下文實施例中更詳細描述的，具有經(jīng)修飾的N-糖基化的目的蛋白質(zhì)(例如但不 限于抗體C5-1)的合成在共表達GalT或GNTl-GalT的植物中產(chǎn)生。
0119]序列表0120]序列SEQ ID序列SEQ ID0121]NO NO 0122]Xmal-pPlas. c1GNTl-GalT (核苷酸170123]序列)0124]Sacl-ATG-pPlas. r2GNTl-GalT氨基酸180125]Sacl-PlasTer. c3GnT-III氨基酸190126]EcoRI-PlasTer. r4GNTl-GnT-III 氨基酉I 200127]GNTl 的 CTS0128]Plasto-443c5210129]結(jié)構(gòu)域(核苷酸)0130]Plas+LC-C51. r6GNTl的CTS基酸)220131]LC-C51. c7質(zhì)體藍素啟動子230132]禾口 5' UTR0133]LC-C51XhoSac. r8質(zhì)體藍素3，UTR240134]和終止子0135]Plas+HC-C51. r9FgaITSpe250136]HC-C51. c10GNTl-GnT-III260137](核苷酸)0138]HC-C51XhoSac. r11FgalT270139]HC-C51KDEL(Sacl). r12RgalTFlagStu280140]胰蛋白酶糖肽13FGNT290141]GalT 1(核苷酸)14RGBTSpe300142]GalT 1氨基酸150143]GnT-III(核苷酸)16
25實施例實施例1 裝配表汰盒 R610、R612 (圖 la)、R621 和 R622 (圖 5a)所有的操作使用來自Sambrook和Russel (2001)的一般分子生物學方案完成。R610，R612(圖 la)使用的寡核苷酸引物如下所示Xmal-pPlas. c :SEQ ID NO 15，-AGTTCCCCGGGCTGGTATATTTATGTTCTC-3' SEQ ID NO 1SacI-ATG-pPlas. r :SEQ ID NO 25，AATAGAGCTCCATTTTCTCTCAAGATGATTAATTAATTAATTAGTC-3，SEQ ID NO:2SacI-PlasTer. c :SEQ ID NO 35’ -AATAGAGCTCGTTAAAATGCTTCTTCGTCTCCTATTTATAATATGG-3’SEQ ID NO:3EcoRI-PIasTer. r :SEQ ID NO 45’ -TTACGAATTCTCCTTCCTAATTGGTGTACTATCATTTATCAAAGGGGA-3’SEQ ID NO:4Plasto_443c :SEQ ID NO 55，-GTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTC-3，SEQ ID NO 5Plas+LC-C51. r :SEQ ID NO 65，-ATCTGAGGTGTGAAAACCATTTTCTCTCAAGATG-3’ SEQ ID NO 6LC-C51. c :SEQ ID NO :75’ -ATGGTTTTCACACCTCAGATACTTGG-3，SEQ ID NO -JLC_C51XhoSac. r :SEQ ID NO 85’ -ATATGAGCTCCTCGAGCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC-3’ SEQ IDNO 8Plas+HC~C51. r :SEQ ID NO 95，-CAAGGTCCACACCCAAGCCATTTTCTCTCAAGATG-3’ SEQ ID NO 9HC-C51. c :SEQ ID NO 105’ -ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGC-3’ SEQ ID NO 10HC_C51XhoSac. r :SEQ ID NO 115’ -ATAAGAGCTCCTCGAGTCATTTACCAGGAGAGTGGG-3，SEQ ID NO 11HC-C51KDEL(SacI). r:SEQ ID NO 125’ -ATAAGAGCTCTCAAAGTTCATCCTTTTTACCAGGAGAGTGGG-3， SEQ IDNO: 12第一克隆步驟是裝配受體質(zhì)粒，所述受體質(zhì)粒含有苜蓿質(zhì)體藍素基因的上游和下 游調(diào)節(jié)元件。使用寡核苷酸引物 Xmal-pPlas. c (SEQ ID NO 1)和 SacI-ATG-pPlas. r (SEQ ID NO 2)從苜?；蚪MDNA中擴增質(zhì)體藍素啟動子(美國專利7，125，978，其通過參考并 入本文)和5' UTR序列。用XmaI和SacI消化得到的擴增產(chǎn)物，并連接進之前用相同酶消 化的 PCAMBIA2300 中，得到 pCAMBIA-PromoPlasto。類似地，使用引物 SacI-PlasTer. c (SEQID NO 3)和EcoRI-PlasTer. r (SEQ ID NO 4)從苜?；蚪MDNA中擴增3' UTR序列和終 止子，或質(zhì)體藍素基因(圖Ic ；SEQ IDNO 24的1-399位核苷酸)，并用SacI和EcoRI消化 產(chǎn)物，之后插入pCAMBIA-PromoPlasto的相同位點中，得到pCAMBIAPlasto。制備質(zhì)粒R 610和R 612，從而作為串聯(lián)構(gòu)建體含有處于苜蓿質(zhì)體藍素啟動子控 制下的C5-1輕鏈和C5-1重鏈編碼序列；將R 610設(shè)計成允許所裝配的IgG停留在ER中， 并且包含與C5-1重鏈末端融合的KDEL序列，并將R 612設(shè)計成允許分泌。使用Darveau等(1995)所述PCR介導的連接方法，進行C5-1表達盒的裝配。為 了將輕鏈編碼序列裝配到質(zhì)體藍素啟動子的下游，第一步是通過PCR將D' Aoust等(美國 專利7，125，978，其通過參考并入本文)所述的苜蓿質(zhì)體藍素啟動子擴增起始ATG下游的前 443個堿基對(圖Ib或SEQ ID NO 23的556-999位核苷酸)，所述PCR使用pCAMBIAPlasto 作為模板并使用以下引物Plasto-443c(SEQ ID NO 5)和 Plas+LC_C51· r (SEQ ID NO :6 ；重疊加有下劃線， 上文)。同時，使用引物LC-C51. C(SEQ ID NO :7)和LC_C51XhoSac. r. (SEQ ID NO :8 ；重疊 加有下劃線)從質(zhì)粒pGA643-K (Khoudi等，1999)中PCR擴增輕鏈編碼序列。將獲得的兩種擴增產(chǎn)物混合在一起，并在使用引物Plasto-443c(SEQID NO 5) 和LC-C5IXhoSac. r(SEQ ID NO :8)的第三PCR反應中用作模板。第一反應中所用引物 Plas+LC-C51.r(SEQ ID NO 6)與LC-C51. C(SEQ ID NO 7)之間的重疊導致第三反應期間擴 增產(chǎn)物的裝配。用DraIII和SacI消化從第三PCR反應得到的裝配產(chǎn)物，并連接進用DraIII 和SacI消化的pCAMBIAPlasto中，得到質(zhì)粒R540。通過PCR擴增質(zhì)體藍素起始ATG上游的443bp——(圖Ib ；SEQID NO 23 的)556-999位核苷酸，將重鏈編碼序列與質(zhì)體藍素上游調(diào)節(jié)元件融合，所述PCR使用 pCAMBIAPlasto作為模板并使用以下引物Plasto-443c(SEQ ID NO 5)和Plas+HC_C51. r (SEQ ID NO 9 ；重疊加有下劃線)。將這些反應的產(chǎn)物混合，并在使用引物Plasto_443c (SEQ ID NO 5)和 HC-C51XhoSac. r (SEQ ID NO 11)的第三PCR反應中裝配。用DraIII和SacI消化得到的 片段，并連接在pCAMBIAPlasto的DraIII和SacI位點之間。得到的質(zhì)粒命名為R541。通過PCR擴增在重鏈編碼序列的C端添加KDEL標簽，所述PCR使用引物 Plasto-443c(SEQ ID NO :8)和 HC-C51KDEL (SacI) · r (SEQ IDNO 12)，使用質(zhì)粒 R541 作為 模板。用DraIII和SacI消化得到的片段，克隆進pCAMBIAPlasto的相同位點中，得到質(zhì)粒 R550。如下進行同一二元質(zhì)粒上輕鏈和重鏈表達盒的裝配用EcoRI消化R541和R550， 補平末端，用HindIII消化并連接進R540的HindIII和SmaI位點中，得到R610(含KDEL) 和R612(不含KDEL ；見圖1)。R621和R622 (圖5a)-使用的寡核苷酸引物如下文所示FgalT SEQ ID NO 275’ -GACTCTAGAGCGGGAAGATGAGGCTTCGGGAGCCGCTC-3， SEQ IDN0:27RgalTFlagStu SEQ ID NO 285’ -AAGGCCTACGCTACTTGTCATTCGTCATCTTTGTAGTCGCAC
GGTGTCCCG AAGTCCAC -3，SEQ ID NO 28FGNT SEQ ID NO 295’ -ATCGAAATCGCACGATGAGAGGGAACAAGTTTTGC-3，SEQ ID NO 29RGNTSpeSEQ ID NO 305’ -CGGGATCCACTAGTCTGACGCTTCATTTGTTCTTC-3’ SEQ ID NO 30FgalTSlpe SEQ ID NO 255，-GGACTAGTGCACTGTCGCTGCCCGCCTGC-3‘ SEQ ID NO 25從pBLTI 121 (Pagny 等，2003)裝配用于 GalT 和 GNTIGalT 表達的質(zhì)粒。通過 EcoRI 消化從pUC19-hGalT(Watzele等1991)分離人β (1，4)_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(hGalT)基因 (UDP半乳糖β -N-乙酰氨基葡糖苷β (1，4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；EC 2. 4. 1. 22)。klenow 處理后，將1. 2-kb hGalT片段克隆進pBLTI221的SmaI位點中，得到質(zhì)粒pBLTI221hGalT。 然后通過PCR將flag與編碼區(qū)的C端融合，所述PCR使用引物realT(SEQ ID NO 27)和 RGalTFlagStu(SEQ ID NO :28)用于擴增。然后通過將該XbaI-StuI片段克隆進二元載體 PBLTI121中，產(chǎn)生R622。通過PCR來擴增對應于跨膜結(jié)構(gòu)域的來自N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移 酶I (GNTI)的前77個氨基酸，所述PCR使用編碼N-GNTI的煙草(N. tabacum) cDNA作為模板 (Strasser 等，1999)，F(xiàn)GNT (SEQ ID NO 29)和 RGNTSpe (SEQ ID NO 30)作為引物。將擴增 產(chǎn)物首先克隆進PGEM-T載體中，用ApaI和BamHI消化得到的質(zhì)粒，并連接進pBLTI221中， 產(chǎn)生稱作PBLTI221-GNTI的質(zhì)粒。通過對pBLTI221hGalT進行PCR擴增獲得hGalT的催化 結(jié)構(gòu)域，所述 PCR 使用引物 FGalTSpe (SEQ ID NO 25)和 RgalTFlagStu (SEQ ID N0:28)，分 別在5’和3’端產(chǎn)生SpeI和StuI位點。然后使用相同的(SpeI和StuI)位點將Spel/StuI hGalT 片段克隆進 pBLT1221-GNTI 中，得到 pBLTI221_GNTIGalT。最后，用分隔 GNTIGalT 編 碼序歹丨J (圖5d ；SEQ IDNO 17)的XbaI和StuI消化pBLTI221-GNTIGalT,并通過將該片段 克隆進二元載體PBLTI121而產(chǎn)生R621。對所有的克隆測序，以驗證構(gòu)建體的完整性。使用用于大腸桿菌(E. coli)轉(zhuǎn)化 (W. S. Dower,Electroporation of bacteria, In" GeneticEngineering",第 12卷，Plenum Press, New York, 1990，J. K. Setlow 編)的 Gene Pulser II 設(shè)備(Biorad, Hercules, CA, USA)，通過電穿孔(Hofgen和Willmitzer，1988)使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteium tumefaciens) (AGL1 ；ATCC, Manassas, VA 20108, USA) 通過限制性酶切圖譜證實所有根瘤 農(nóng)桿菌菌株的完整性。如Hamilton等(2002)中所述制備HcPro構(gòu)建體。實施例2 制備植物生物量，接種，農(nóng)桿菌滲入和收獲在填充了市售泥炭蘚基質(zhì)(peat moss substrate)的淺容器中從種子種植本生煙 植株。使植物在16/8的光周期和白天25°C/夜晚20°C的溫度方案下生長。播種后三周挑 取個體小植株，移植進盆中，并在相同的環(huán)境條件下在溫室中再培養(yǎng)三周。在補充有IOmM 2-[N-嗎啉代]乙磺酸(MES) ,20 μ M乙酰丁香酮、50 μ g/ml卡那霉 素和25 μ g/ml羧芐西林pH5. 6的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)農(nóng)桿菌菌株R612、R610、R621、R622或 35SHcPro，直至其達到0. 6和1. 6之間的0D_。使用前將農(nóng)桿菌懸浮液離心，并重懸于滲入 介質(zhì)(IOmMMgCl2 禾口 IOmM MES ρΗ5· 6)中。如 Liu 禾口 LomonossofT(2002，Journal of Virological Methods, 105 343-348)
28所述進行注射器滲入。對真空滲入而言，將根瘤農(nóng)桿菌懸浮液離心，重懸于滲入介質(zhì)中，并在4°C儲存過 夜。滲入當天，將培養(yǎng)物批次在2. 5倍培養(yǎng)體積中稀釋，并在使用前使其溫暖。在氣密性不 銹鋼罐中，于20-40ΤΟΠ·的真空下將整株本生煙植株頭朝下置于細菌懸浮液中2分鐘。注 射或真空滲入后，將植物放回溫室中培養(yǎng)4-5天，直至收獲。葉取樣和總蛋白質(zhì)提取培養(yǎng)后，收獲植物的地上部分，冷凍于-80°C，粉碎成片，并分離成1. 5或7. 5g的 亞樣品。如下提取總可溶蛋白質(zhì)在3倍體積冷的50mM TrispH 7. 4、0. 15M NaCl,0. 1% Triton X-IOOUmM苯甲基磺酰氟和10 μ M胰凝乳蛋白酶抑制劑中，對每份冷凍粉碎的植物 材料的亞樣品進行勻漿(Polytron)。勻漿后，將漿體在20，OOOg下于4°C離心20分鐘，并 保留這些澄清的粗提物(上清液)用于分析。通過Bradford測定法(Bio-Rad，Hercules， CA)，使用牛血清白蛋白作為參考標準，測定澄清粗提物的總蛋白質(zhì)含量。實施例3 蛋白質(zhì)分析、免疫印跡和ELISAC5-1是抗人小鼠IgG，因此可以通過其對人IgG的特征性親和力(活性印跡)或 通過其對抗小鼠IgG的免疫反應性來進行檢測和定量。通過SDS-PAGE分離來自總粗提物的蛋白質(zhì)或純化的抗體，并用考馬斯藍R-250或 G-250 染色或者電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylenedifluoride)膜(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)上用于免疫檢測。在免疫印跡前，將膜用Tris緩沖鹽水 (TBS-T)中 5%脫脂乳禾口 0. 1% Tween-20 于 4°C封閉 16-18 小時。通過與以下抗體孵育進行免疫印跡與過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(H+L) 抗體(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Cat#l 15-035-146) (TBS-T 中 2%脫脂乳 中 0. 04 μ g/ml)，與過氧化物酶綴合的人 IgG 抗體(Gamunex Bayer Corp.，Elkhart, IN) (TBS-T中2 %脫脂乳中0. 2 μ g/ml)或多克隆山羊抗小鼠IgG抗體(重鏈特異性) (Sigma-Aldrich，St-Louis, M0) (TBS-T 中 2%脫脂乳中 0. 25 μ g/ml)。使用與過氧化物酶 綴合的驢抗山羊 IgG 抗體(Jackson ImmunoResearch) (TBS-T 中 2%脫脂乳中 0. 04 μ g/ml) 作為二抗用于重鏈特異性抗體處理的膜。使用魯米諾作為底物，通過化學發(fā)光檢測免疫反 應性復合物(Roche DiagnosticsCorporation)。通過使用EZ-Link Plus 活化的過氧化 物酶綴合試劑盒(Pierce，Rockford, IL)進行人IgG抗體的辣根過氧化物酶綴合。ELISA定量測定在50mM 碳酸鹽緩沖液(pH 9. 0)中，用 2. 5 μ g/ml 對 IgGl 重鏈(SigmaM8770)具 有特異性的山羊抗小鼠抗體將多孔板(Immulon 2HB, ThermoLab System, Franklin, ΜΑ) 于4°C包被16-18小時。然后通過在磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS) (Pierce Biotechnology, Rockford, II)中的酪蛋白中于37°C孵育1小時，封閉多孔平板。用純化的小鼠IgGl 對照(SigmaM9269)的稀釋液產(chǎn)生標準曲線。進行免疫測定時，所有的稀釋液(對照和樣 品)在下述植物提取物中進行，所述植物提取物得自用模擬接種物滲入和培養(yǎng)的植物組 織，從而可以排除任何基質(zhì)影響。將平板用蛋白質(zhì)樣品和標準曲線稀釋液在37°C下孵育1 小時。用PBS中0. Tween-20 (PBS-T)洗滌三次后，用與過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠 IgG (H+L)抗體(封閉溶液中 0. 04 μ g/ml) (Jackson ImmunoResearch 115-035-146)將平板 在37°C下孵育1小時。重復使用PBS-T的洗滌，并用3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)
29Sure Blue過氧化物酶底物(KPL，Gaidiersburg, MD)孵育平板。通過添加IN HCL終止反 應，并在450nm下讀出吸光度。每個樣品一式三份測定，并將濃度插值到標準曲線的線性部 分中。實施例4 IgG純化從葉材料中純化C5-1包括取本生煙的冷凍葉(100_150g)，添加20mM磷酸鈉、 150mM NaCl和2mM偏亞硫酸氫鈉(pH 5. 8-6. 0)，并使用市售混合器于室溫混合2_3分鐘。 通過在Miracloth (Calbiochem, SanDiego, CA)上粗過濾去除不溶纖維，并向濾液中添加 IOmM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)。用IM HCl將提取物調(diào)節(jié)至pH 4. 8 士0. 1，并通過在18000g 下于2-8°C離心15分鐘使其澄清。用2M TRIS將澄清的上清液調(diào)節(jié)至pH8. O士0. 1，通過在 18 OOOg下于2-8°C離心15分鐘再次澄清，依次用0. 8和0. 2 μ m膜(Pall Corporation, Canada)過濾。使用0. 2英尺2有效面積的IOOkDa分子量截留超濾膜(GE Healthcare Biosciences, Canada)，通過切向流過濾濃縮濾過的材料，從而將澄清的材料的體積減少5 到10倍。然后將濃縮的樣品上樣在重組蛋白質(zhì)G-S印harose Fast Flow(Sigma-Aldrich， St-Louis, MO, Cat. #P4691)的 5mmX5cm 柱(ImL 柱體積)上。用 5 倍柱體積的 20mM TRIS-HCl、150mM NaCl pH 7. 5洗滌柱。用IOOmM甘氨酸pH 2. 9-3. 0洗脫抗體，并立即收集 進管中使其達到中性PH，所述管中含有體積計算過的IM TRIS-HCl pH 7.5。將洗脫抗體的 合并級分在21 OOOg下于2-8°C離心15分鐘并在-80°C保存直至分析。純化后，根據(jù)制造 商的說明清洗并儲存親和柱。相同的層析介質(zhì)可再用于若干次純化，而不顯著改變其純化 性能(多達10個測試循環(huán))。實施例5 =N-糖基化分析在15% SDS/PAGE上電泳包含C5_l (50 μ g)的樣品。用考馬斯藍使重鏈和輕鏈顯 影，并將對應于重鏈的蛋白質(zhì)條帶切下并切成小片段。將片段洗滌三次(每次使用600 μ L 0. IM NH4HC03/CH3CN(1/1)溶液洗滌15分鐘)并干燥。通過將凝膠片段在600 μ L 0. IM NH4HCO3中0. IM DTT溶液中于56°C下孵育45分 鐘，實現(xiàn)二硫橋的還原。通過添加600 μ L 0. IM NH4HCO3中碘乙酰胺55mM溶液，在室溫下30 分鐘進行烷基化。棄去上清液，并將聚丙烯酰胺片段在0. IM NH4HC03/CH3CN(1/1)中再洗滌一次。然后在600 μ L 0. 05Μ NH4HCO3中，將蛋白質(zhì)用7. 5 μ g胰蛋白酶(Promega)于37°C 消化16小時。添加200 μ L CH3CN并收集上清液。然后用200 μ L 0. IM NH4HCO3、之后用 200 μ L CH3CN、最后用200 μ L甲酸5%洗滌凝膠片段。將所有上清液合并并凍干。通過HPLC，在C18反相柱(4. 5X250mm)上用TFA 0. 1 %中CH3CN的線性梯度進 行肽分離。收集并凍干級分，在裝有337-nm氮激光器的Voyager DE-Pro MALDI-TOF設(shè)備 (Applied Biosystems，USA)上通過MALDI-TOF-MS分析。使用α-氰基-4-羥基肉桂酸 (Sigma-Aldrich)作為基質(zhì)，在反射器延遲提取模式中進行質(zhì)譜。實施例6 農(nóng)桿菌滲入的本生煙葉中瞬時IgG表達的定量。為了測試基于質(zhì)體藍素的強表達盒是否能夠驅(qū)動完全裝配的IgG的高度累積，將 C5-l(—種小鼠抗人IgG(Khoudi等1997))輕鏈和重鏈編碼序列裝配在質(zhì)體藍素啟動子和 5’非翻譯序列下游的串聯(lián)構(gòu)建體中，并且側(cè)翼是pCambia 二元質(zhì)粒的相同T-DNA區(qū)段上的 質(zhì)體藍素3’非翻譯區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止序列，如圖1中所示。
在R612和R610兩種表達盒(見實施例1)中，輕鏈和重鏈編碼序列都含有來自 C5-1的天然信號肽(Khoudi等1999)，但是在R610中，向重鏈的C端添加KDEL肽的編碼序 列，從而抑制裝配好的IgG向高爾基體移動?？寺〔襟E和質(zhì)粒轉(zhuǎn)移進根瘤農(nóng)桿菌(AGLl)中后，用轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒R612或R610的農(nóng) 桿菌菌株對三株本生煙植物的每個葉片進行注射器滲入，并在溫室條件下培養(yǎng)6天，之后 如實施例2中所述進行分析。培養(yǎng)周期后，將每株植物的葉片(約20g生物量)冷凍，研 磨，并將冷凍粉末混合產(chǎn)生均質(zhì)的樣品，從中取出兩種1.5g的亞樣品用于提取(來自每株 植物；見實施例3)。使用用于捕獲的多克隆山羊抗小鼠IgGl重鏈和用于檢測的與過氧化 物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(H+L)，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)定量來自每個樣品的總 蛋白質(zhì)提取物中的C5-1含量(見實施例3)。如圖2中所示，R612的農(nóng)桿菌滲入導致每kg鮮重(fresh weight,Fff)累積106mg 抗體，而抗體的ER停留形式(R610)在相同的條件下達到211mg/kg FW。因為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)已顯示限制農(nóng)桿菌滲入的本生煙植物中轉(zhuǎn)基因的表 達，并且來自馬鈴薯病毒Y (HcPro)的沉默性抑制基因的共表達阻礙轉(zhuǎn)基因mRNA的特異性 降解(Brigneti等，1998)，所以對HcPro構(gòu)建體(Hamilton等，2002)的共滲入測試其提高 C5-1表達的效率。與在無HcPro時觀察到的相比，R612和R610與HcPro的共表達分別將 抗體累積水平提高5. 3倍和3. 6倍。在存在HcPro時，質(zhì)體藍素控制的C5-1表達用R612達 到558mg/kg Fff的平均值，用R610達到757mg/kg Fff的平均值(圖2)。在來自用R612和 R610 二者滲入的葉的一些提取物中，最高C5-1表達水平超過1.5g/kg FW(25%總可溶蛋白 質(zhì))。為了評價農(nóng)桿菌滲入表達系統(tǒng)的規(guī)模可變性(scalability)，在從Kapila等 (1997)修改的真空滲入步驟后定量C5-1的累積。在這一系列實驗中，用R612+HcPro或 R610+HcPro真空滲入完整植物的地上部分，并返回溫室中培養(yǎng)6天后收獲。為了提供代表 大規(guī)模生產(chǎn)系統(tǒng)的數(shù)據(jù)，將數(shù)批來自若干植物的約250g批量的葉/葉柄冷凍，研磨成為均 質(zhì)樣品，并收集每批的3份7. 5g材料的亞樣品用于分析。如通過ELISA定量所示，對R612 和R610滲入而言，平均C5-1累積水平分別達到238和328mg/kg Fff (圖2)。實施例7 表征所產(chǎn)生的抗體在注射器滲入和真空滲入兩種實驗后，使用蛋白質(zhì)印跡分析(見實施例3)來 揭示生產(chǎn)分泌型(R612)和ER停留型(R610)蛋白質(zhì)的植物中C5_lIgG的裝配和片段化 (fragmentation)水平。首先通過使用與H+L過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG作為探針 的Western印跡來凸顯最大量抗體片段的存在，與其在C5-1分子上的來源無關(guān)。如圖3A 中所示，所有的蛋白質(zhì)提取物均含有相似分子大小和相似豐度的片段，與使用的亞細胞靶 向策略或滲入方法無關(guān)。在每種情況下，揭示了約150kDa處對應于完整抗體的主要條帶 (> 85% )，約135kDa和約IOOkDa處有兩個次要條帶，顯示抗體主要以其完全裝配的形式 (H2L2)累積。有趣的是，從小鼠腫瘤細胞系(M0PC-21 ；Sigma #M9269)中純化的對照IgGl中 也存在相似電泳遷移率的片段，表明在植物和哺乳動物細胞系中產(chǎn)生的片段化是類似的， 可能是由共有的蛋白水解活性導致。使用抗小鼠重鏈特異性抗體進行檢測也獲得了類似的 結(jié)果。為了測試提取物中存在的抗體片段的身份，使用活性印跡，其中用與過氧化物酶
31綴合的人IgGl (C5-1的抗原)來檢測蛋白質(zhì)印跡。在圖3B中可以看到約150kDa的完全裝 配的抗體身份。另外，除了 IOOkDa條帶以外，在Western印跡中觀察到的片段化模式(見圖 3A)在活性印跡上是可見的(圖3B)。不希望受理論束縛，該結(jié)果表明IOOkDa片段不含有 C5-1抗體的Fab區(qū)，并且可能(至少部分)由重鏈二聚體(抗體裝配的中間產(chǎn)物)組成。實施例8 抗體純化和純化產(chǎn)物的表征使用單個G蛋白親和層析步驟從生物量中純化抗體，并通過SDS-PAGE分析獲得的 產(chǎn)物(見實施例4)。圖4a所示考馬斯染色的凝膠展示了來自G蛋白的洗脫級分中150kDa 處的主要條帶。該條帶代表了分泌型和ER停留型兩種形式的純化產(chǎn)物的多于85%，并且對 兩種形式而言污染物含量是相同的(圖4A，第4和5道)。用多克隆抗小鼠IgG作為探針 的Western印跡分析顯示了經(jīng)純化的C5-1級分中主要污染物的小鼠IgG來源(數(shù)據(jù)未顯 示)。在還原條件下，在約26kDa和約55kDa處檢測到兩種主要的產(chǎn)物，其分別對應于輕鏈 和重鏈的分子量(圖4B，第2道)。ER停留型抗體的重鏈顯示比質(zhì)外體抗體的重鏈更高的 電泳遷移率(圖4B，第3道)，這被解釋為由于在ER中停留導致的N-糖基化差異和C端存 在額外的KDEL氨基酸的組合結(jié)果。圖4C顯示，如污染片段75、90、100和120kDa —樣，純 化抗體(150kDa)與人IgGl結(jié)合，顯示這些片段中存在至少一個Fab區(qū)段。IOOkDa片段中 Fab的存在與從粗提物分析中獲得的結(jié)果相矛盾，在粗提物分析中IOOkDa條帶不與人IgG 結(jié)合。推測在粗提物中以IOOkDa遷移的含F(xiàn)ab片段的量太低而不能用該活性印跡檢測，或 者以IOOkDa遷移的片段由兩種不同的分子組成，一種是重鏈二聚體(無Fab)，另一種含有 抗原結(jié)合區(qū)。通過對來自2個不同滲入批次和來自每個批次的3個不同純化組的純化產(chǎn)物進行 并列比較，評價該系統(tǒng)用于抗體生產(chǎn)的再現(xiàn)性。純化組的考馬斯染色的SDS-PAGE分析顯示 所有組中存在相同的條帶，并且以高度相似的相對豐度存在(圖4D)。實施例9 通過共表達人半乳糖基轉(zhuǎn)移酶來修飾抗體的N-糖基化為了研究是否能夠使用瞬時共表達來控制瞬時表達期間新生蛋白質(zhì)的糖基化， 制備包含天然人β1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)的質(zhì)體藍素表達盒。R622包含GalT (圖 5Β)，R621包含與N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶的CTS結(jié)構(gòu)域融合的GalT催化結(jié)構(gòu)域(GNTI ； GNTlGalT)(圖5Α)。選擇N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(GNTI)的CTS結(jié)構(gòu)域作為人GalT催化 結(jié)構(gòu)域的膜錨著，因為GNTl在ER和順面高爾基體中復合N-聚糖合成的早期階段發(fā)揮作用 (Saint-Jore-Dupas等，2006)。不希望受理論限制，將GalT活性隔離在蛋白質(zhì)成熟的早期 階段可導致在成熟中聚糖上添加β 1，4-半乳糖，并且有效抑制核心的巖藻糖基化和木糖 基化。將這些構(gòu)建體與C5-1共滲入植物中。在存在HcPro 時，用 R612(C5_1 的分泌形式)、R612+R621 (GNTlGalT)或 R612+R622 (GalT)滲入本生煙植物(見實施例2)。圖6展示了從這些生物量樣品中純化的 C5-1的免疫分析。通過使用雞冠刺桐凝集素(ECA)的親和檢測來評價抗體的半乳糖基化，所述凝 集素特異性結(jié)合β 1，4-半乳糖。如所預期的，單獨表達C5-1時未檢測到半乳糖(R612 ； 圖6)。在從使用R512+R622 (GalT)共滲入物純化的C5-1中觀察到半乳糖基化，但是使用 R612+R621 (GNTlGalT)的共滲入物純化的C5-1中則未觀察到(圖6)。使用抗α 1，3巖藻 糖抗體進行的Western印跡揭示了在無半乳糖基轉(zhuǎn)移酶情況下表達的對照C5-1上N-聚糖
32的巖藻糖基化。在與GNTlGalT共表達的抗體上未檢測到N-聚糖的巖藻糖基化，與農(nóng)桿菌 滲入方法無關(guān)，然而與天然GalT共表達未導致抗體巖藻糖基化的可檢出的減少(圖6)。用 抗β 1，2-木糖特異性抗體獲得了類似的結(jié)果，這表明與GNTlGalT共表達時C5-1上完全缺 失木糖特異性免疫信號，而在與C5-1與GalT共表達時則存在(圖6)。對同一提取物進行考馬斯染色的凝膠用于直接視覺評價完全裝配的IgG，并進行 Western印跡和活性印跡。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，所述抗體表達系統(tǒng)達到1. 5g/kg鮮重的產(chǎn)量，粗 提物中超過85%的產(chǎn)物由約150kDa的全尺寸四亞基IgG組成。先前使用重鏈C端上KDEL肽的添加，通過介導抗體從高爾基體返回ER來提高抗 體累積(2-10X) (Schillberg等，2003)。通過本文所述的表達系統(tǒng)，向C5-1重鏈上添加KDEL 肽使得不使用沉默性抑制基因HcPro時C5-1的產(chǎn)量倍增。使用HcPro降低沉默時，存在或 不存在KDEL時C5-1的產(chǎn)量之間的差異被顯著降低。ER停留不影響產(chǎn)物品質(zhì)，因為在來自 生產(chǎn)ER停留型或分泌型抗體的植物粗提物中，觀察到的片段在尺寸和相對豐度方面相同。在制備型HPLC上分離C5-1，并通過MALDI-T0F質(zhì)譜分析C5-1的經(jīng)胰蛋白酶消 化糖蛋白EEQFNSTFR(SEQ ID NO 13)的N-聚糖譜。如圖7A中所示，單獨表達C5-1時，其 N-聚糖群體主要表現(xiàn)為復合形式，包括由巖藻糖基化和木糖基化寡糖組成的離子，如針對 穩(wěn)定表達所觀察到的(Bardor等，2003)。非成熟ER特異性聚糖例如Man-8和Man-9的存 在可以與蛋白質(zhì)“中途(en-route) ”的級分相關(guān)，如先前所報道的通過瞬時表達生產(chǎn)的來自 植物的抗體(Sriraman，等，2004)?？贵wC5-1與天然GalT的共表達導致N-聚糖結(jié)構(gòu)的顯著修飾，盡管對應于高甘 露糖型N-聚糖的離子仍大量殘余。主要的復合巖藻糖基化和木糖基化N-聚糖(J)消失， 并且檢測到新的部分半乳糖基化的寡糖，其中一些既具有植物特異性成熟又具有半乳糖延 伸，例如GalGlcNAcMan3 (Xyl)GlcNAc2 (圖7B)。這證明了 C5-1與人β 1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶 的共表達導致對來自植物之抗體的有效糖改造。C5-1與GNTIGalT的共表達得到純化的C5-1制劑，其中N-聚糖群體與GalT/ C5-1的N-聚糖群體顯著不同。如圖7C中所示，半乳糖基化和非半乳糖基化的雜合物 (GalGlcNAcMan5GlcNAc2 (K)和 GalGlcNAcMan5GlcNAc2(G))與不成熟的寡聚甘露糖 N-聚糖 一起存在。不希望受理論束縛，如Bakker等(2006)所推測的，GlcNAcMan5GlcNAc2(G)和 Man5GlcNAc2 (B)可以是來自雜合物GalGlcNAcMar^GlcNAq被內(nèi)源糖苷酶降解的片段，而不 是成熟N-聚糖形成的中間產(chǎn)物。GNTl膜錨著的作用是驚人的；從其中瞬時共表達合成酶 GNTIGalT與C5-1的植物中純化的C5-1基本不含(彡99% )帶有植物特異性α 1，3巖藻糖 或β 1，2木糖的聚糖，證明在瞬時共表達期間實現(xiàn)了巖藻糖基化和木糖基化的全部修飾。所有弓I文通過參考并入本文。本發(fā)明關(guān)于一個或多個實施方案進行描述。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應當明白，可以 進行大量變更和修改而不偏離權(quán)利要求書定義的本發(fā)明的范圍。參考文獻Bakker, H. et al. An antibody produced in tobacco expressing a hybridbeta-1,4-galactosyltransferase is essential Iy devoid of plant carbohydrate epitopes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103，7577—7582 (2006) ·Boisson,M. et al. Arabidopsis glucosidase I mutants reveal a criticalrole
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權(quán)利要求
用于合成具有修飾的N 糖基化譜之目的蛋白質(zhì)的方法，其包括在植物、植物部分或植物細胞中共表達核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋白GNT1 GalT，所述雜合蛋白包含與β 1，4 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)催化結(jié)構(gòu)域融合的N 乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(GNT1)CTS結(jié)構(gòu)域，所述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；共表達所述第一和第二核苷酸序列，從而合成目的蛋白質(zhì)，其包含具有修飾的N 糖基化譜的聚糖。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列在植物中瞬時表達。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列在植物中穩(wěn)定表達。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一調(diào)節(jié)區(qū)是第一組織特異性啟動子，且所述第二調(diào) 節(jié)區(qū)是第二組織特異性啟動子。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述第一組織特異性啟動子是質(zhì)體藍素啟動子或35S啟動 子，且所述第二組織特異性啟動子是質(zhì)體藍素啟動子或35S啟動子。
6.權(quán)利要求2的方法，其中在所述植物中表達第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列 編碼沉默性抑制基因，所述第三核苷酸序列與在所述植物中有活性的第三調(diào)節(jié)區(qū)有效連 接。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述第三組織特異性啟動子是質(zhì)體藍素啟動子或35S啟動子。
8.權(quán)利要求5的方法，其中在所述植物中表達第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列 編碼沉默性抑制基因，所述第三核苷酸序列與在所述植物中有活性的第三調(diào)節(jié)區(qū)有效連 接。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述第三組織特異性啟動子是質(zhì)體藍素啟動子或35S啟動子。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述目的蛋白質(zhì)是抗體、抗原或疫苗。
11.權(quán)利要求10的方法，其中編碼目的蛋白質(zhì)的第二核苷酸序列包含與在所述植物中 有活性的調(diào)節(jié)區(qū)2Α有效連接的核苷酸序列2Α，和與在所述植物中有活性的調(diào)節(jié)區(qū)2Β有效 連接的核苷酸序列2Β，并且2Α和2Β各自編碼的產(chǎn)物相組合而產(chǎn)生抗體。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述調(diào)節(jié)區(qū)2Α是質(zhì)體藍素啟動子，所述調(diào)節(jié)區(qū)2Β是質(zhì)體 藍素啟動子。
13.核酸，其包含SEQID NO 17 (GNTl-GalT)，或包含與SEQ IDNO 17顯示約80 %到 100%同一性的核苷酸序列，所述同一性使用以下參數(shù)測定程序blastn ；數(shù)據(jù)庫nr ；預 期10 ；過濾低復雜度；比對成對；字長11，其中所述核苷酸序列編碼修飾目的蛋白質(zhì)之 糖基化的蛋白質(zhì)。
14.核酸，其包含含有SEQID NO 14 (GalT)或含有與SEQ ID NO 14約80%到100% 相似之序列的第一核酸序列，所述相似性使用以下參數(shù)測定程序=Wastn ；數(shù)據(jù)庫nr ；預 期10 ；過濾低復雜度；比對成對；字長11，其中所述第一核酸序列編碼修飾目的蛋白質(zhì) 之糖基化的蛋白質(zhì)，所述第一核酸序列與包含質(zhì)體藍素啟動子的第二核酸序列有效連接。
15.用于合成具有修飾的N-糖基化譜之目的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在植物、 植物部分或植物細胞中共表達核酸，所述核酸包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列， 所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋白(GNTl-GnT-III)，其包含與N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶 III(GnT-III)催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(GNTl) CTS結(jié)構(gòu)域，所述第一核苷 酸序列與在所述植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序列編碼目的蛋白 質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；共表達所述第一 和第二核苷酸序列，從而合成目的蛋白質(zhì)，其包含具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的聚糖。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列在植物中瞬時表達。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列在植物中穩(wěn)定表達。
18.核酸，其包含SEQID NO :26 (GNTl-GnT-III)的1-1641位核苷酸，或包含與SEQ ID NO :26之1-1641位核苷酸顯示約80%到100%同一性的核苷酸序列，所述同一性使用以下 參數(shù)測定程序blaStn ；數(shù)據(jù)庫nr ；預期10 ；過濾低復雜度；比對成對；字長11，其中 所述核酸編碼修飾目的蛋白質(zhì)之糖基化的蛋白質(zhì)。
19.核酸，其包含含有SEQID NO 16 (GnT-111)的1-1460位核苷酸或含有與SEQ ID NO 16的1-1460位核苷酸約80%到100%相似之序列的第一核酸序列，所述相似性使用以 下參數(shù)測定程序=Wastn ；數(shù)據(jù)庫nr ；預期10 ；過濾低復雜度；比對成對；字長11，其 中所述第一核酸序列編碼修飾目的蛋白質(zhì)之糖基化的蛋白質(zhì)，所述第一核酸序列與包含質(zhì) 體藍素啟動子的第二核酸序列有效連接。
20.用于合成具有修飾的N-糖基化譜之目的蛋白質(zhì)的方法，其包括在植物、植物部分 或植物細胞中共表達編碼第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列的核苷酸序 列，所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋白GNTl-GalT，所述雜合蛋白包含與β_1，4_半乳糖基 轉(zhuǎn)移酶(GalT)催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(GNTl)CTS結(jié)構(gòu)域，所述第一核 苷酸序列與在所述植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序列編碼β -1， 4_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)有效連接， 所述第三核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第三核苷酸序列與在所述植物中有活性的第三 調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；共表達所述第一、第二和第三核苷酸序列，從而合成目的蛋白質(zhì)，其包含 具有修飾的N-糖基化譜的聚糖。
21.用于合成具有修飾的N-糖基化譜之目的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在植物、植 物部分或植物細胞中共表達編碼第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列的核 苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋白GNTl-GnT-III，所述雜合蛋白包含與N-乙酰 葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III (GnT-III)催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(GNTl) CTS結(jié)構(gòu) 域，所述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸 序列編碼N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的第二 調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第三核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第三核苷酸序列與在所述植 物中有活性的第三調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；共表達所述第一、第二和第三核苷酸序列，從而合成包 含具有經(jīng)修飾N-糖基化譜之聚糖的目的蛋白質(zhì)。
22.雜合蛋白GNTl-GalT，其包含與β_1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶CTS結(jié)構(gòu)域，所述雜合蛋白包含序列SEQ ID N0:18o
23.雜合蛋白GNTl-GnT-III，其包含與N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III催化結(jié)構(gòu)域融合的 N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶CTS結(jié)構(gòu)域，所述雜合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID N0:20。
24.包含權(quán)利要求13的核苷酸序列的植物、植物細胞或種子。
25.包含權(quán)利要求14的核苷酸序列的植物、植物細胞或種子。
26.包含權(quán)利要求18的核苷酸序列的植物、植物細胞或種子。
27.包含權(quán)利要求19的核苷酸序列的植物、植物細胞或種子。
28.包含權(quán)利要求23的雜合蛋白的植物、植物細胞或種子。
29.包含權(quán)利要求24的雜合蛋白的植物、植物細胞或種子。
全文摘要
本發(fā)明提供了在植物、植物部分或植物細胞中合成具有經(jīng)修飾的N-糖基化譜的目的蛋白質(zhì)的方法。所述方法包括在植物中共表達編碼第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的核苷酸序列，所述第一核苷酸序列編碼雜合蛋白(GNT1-GalT)，所述雜合蛋白包含與β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)催化結(jié)構(gòu)域融合的N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶(GNT1)CTS結(jié)構(gòu)域，所述第一核苷酸序列與在所述植物中有活性的第一調(diào)節(jié)區(qū)有效連接，所述第二核苷酸序列編碼目的蛋白質(zhì)，所述第二核苷酸序列與在所述植物中有活性的第二調(diào)節(jié)區(qū)有效連接。將所述第一和第二核苷酸序列共表達，從而在植物、植物部分或植物細胞中合成目的蛋白質(zhì)，所述目的蛋白質(zhì)包含具有經(jīng)修飾N-糖基化譜的聚糖。
文檔編號C12N15/54GK101918559SQ200880103174
公開日2010年12月15日 申請日期2008年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日
發(fā)明者克里斯托夫·蘇魯耶, 克里斯托夫·里韋, 卡羅勒·比雷爾, 盧瓦克·法耶, 埃斯泰勒·馬凱-布盧安, 帕特里斯·勒魯熱, 托馬斯·帕卡萊特, 斯特凡妮·阿奎, 穆里爾·巴爾多, 路易斯-菲利普·韋齊納, 韋羅妮克·戈莫爾德, 馬克-安德烈·德奧斯特 申請人:麥迪卡格公司;國家科學研究中心;魯昂大學