專利名稱：特異性基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表達(dá)非天然寡聚蛋白的細(xì)胞、產(chǎn)生所述細(xì)胞的方法和形成非天然寡聚 蛋白的方法，所述寡聚蛋白可用于醫(yī)療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
活體主要通過免疫應(yīng)答來保護(hù)免受外源物質(zhì)的侵害，免疫系統(tǒng)由不同的細(xì)胞和由 細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性因子構(gòu)成。其中，白細(xì)胞特別地淋巴細(xì)胞起著中心作用。淋巴細(xì)胞被分 為稱為B淋巴細(xì)胞(在下文中，在一些情況下稱為B細(xì)胞)和T淋巴細(xì)胞(在下文中，在一 些情況下稱為T細(xì)胞)的兩個(gè)主要類型，它們中的任一種特異性識(shí)別抗原，并且作用于其以 保護(hù)活體。大多數(shù)T細(xì)胞由在外表面表達(dá)CD (分化抗原簇(Cluster ofDifferentiation)) 4 標(biāo)記的⑶4陽性T細(xì)胞和表達(dá)⑶8標(biāo)記的⑶8陽性T細(xì)胞組成。大部分⑶4陽性T細(xì)胞稱 為輔助T細(xì)胞(在下文中稱為Th)，其參與協(xié)助抗體產(chǎn)生和誘導(dǎo)各種免疫應(yīng)答，以及分化成 Thl型和Th2型，在所述兩種類型中，通過抗原刺激所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的類型彼此不同。大 部CD8陽性T細(xì)胞分化成細(xì)胞毒性T細(xì)胞[Tc 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，也稱為殺傷T細(xì)胞， 在下文中在一些情況下稱為CTL]，通過抗原刺激其展示細(xì)胞毒性活性。作為外科手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法之后的第四癌癥療法，免疫療法近來日益吸 引人們的注意。由于免疫療法利用人類本身具有的免疫能力，因此據(jù)認(rèn)為與其他療法相比 較，其對患者的身體負(fù)荷更小。已知的免疫療法包括導(dǎo)入通過體外誘導(dǎo)的CTL獲得的淋巴 因子活化細(xì)胞、NKT細(xì)胞、、ST細(xì)胞等、根據(jù)多種方法擴(kuò)增培養(yǎng)產(chǎn)生的外周血淋巴細(xì)胞的 療法、樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法和預(yù)期體外誘導(dǎo)抗原特異性CTL的肽疫苗療法、Th 1細(xì)胞療法以 及此外，免疫基因療法(在該療法中，將可從其預(yù)期各種效應(yīng)的基因在體外導(dǎo)入此類細(xì)胞， 然后轉(zhuǎn)移至體內(nèi))。一些細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)通過由a鏈和0鏈的異二聚體組成的特異性T細(xì)胞 受體(在下文中縮寫為TCR)識(shí)別為主要組織相容性抗原分子(MHC分子，在人類的情況下， 稱為人白細(xì)胞抗原，在下文中縮寫為HLA)(其由主要組織相容性基因復(fù)合物(在下文中縮 寫為MHC)編碼)與抗原肽的結(jié)合物的復(fù)合物，并且可破壞在其表面上呈遞該復(fù)合物的細(xì) 胞。預(yù)期通過將識(shí)別目的抗原的TCR基因?qū)隩細(xì)胞來將針對目的抗原的特異性細(xì)胞 毒性活性賦予具有細(xì)胞毒性活性的T細(xì)胞?；谠擃A(yù)期，已嘗試了使用靶向不同抗原例如 MART1 (非專利文獻(xiàn)1)、gplOO (非專利文獻(xiàn)2)和mHAG HA-2抗原(非專利文獻(xiàn)3)的TCR 基因的基因療法。然而，例如，當(dāng)將由識(shí)別目的抗原的a鏈和0鏈組成的TCR基因?qū)隩 細(xì)胞時(shí)，由T細(xì)胞本身表達(dá)的內(nèi)源TCRa鏈和TCR3鏈引起導(dǎo)入的識(shí)別目的抗原的TCR的 3鏈與a鏈之間的錯(cuò)配。即，當(dāng)將a ’和0 ’導(dǎo)入表達(dá)a和0的細(xì)胞時(shí)，形成各a ^、 a ^ \ a ‘ ^ ^P a ‘ ^ ‘異二聚體，從而引起形成識(shí)別目的抗原的正確異二聚體的TCR減 少和可形成識(shí)別預(yù)料之外的抗原的異二聚體的問題。
作為解決該問題的方法，已嘗試了將不與內(nèi)源TCR形成異二聚體的單鏈TCR導(dǎo)入 T細(xì)胞的方法(非專利文獻(xiàn)4)和將具有識(shí)別目的抗原的抗體的嵌合受體(T-體(T-body)) 導(dǎo)入T細(xì)胞的方法(非專利文獻(xiàn)5)。然而，因?yàn)橥ㄟ^此類方法獲得的T細(xì)胞同時(shí)具有內(nèi)源 TCR和導(dǎo)入的TCR，因此T細(xì)胞可識(shí)別兩種類型的抗原。此外，因?yàn)橹亟MTCR不是天然存在 的TCR，所以必需確認(rèn)至T細(xì)胞的信號傳遞、安全性等。此外，作為另一種方法，存在將識(shí)別 目的抗原的TCR的0鏈和a鏈導(dǎo)入不表達(dá)TCR的a鏈和0鏈的T細(xì)胞例如表達(dá)、鏈 和S鏈的T細(xì)胞(y S T細(xì)胞)的方法(非專利文獻(xiàn)6)。然而，通過該方法獲得的T細(xì)胞 具有與使用重組TCR的方法的顧慮相同的顧慮。如上通過TCR舉例說明的，當(dāng)將可作為組成性多肽(constituentpolyp印tide)而 被整合入寡聚蛋白的外源多肽導(dǎo)入表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞時(shí)，存在可形成不能表現(xiàn)期望的功 能和其中內(nèi)源多肽和外源多肽混合在一起的寡聚蛋白，或表現(xiàn)期望的功能的寡聚蛋白可因 內(nèi)源多肽與外源多肽之間的競爭而減少的問題。非專利文獻(xiàn)1 J. Immunol.，第 163 卷，pp. 507-513 (1999)非專利文獻(xiàn)2 J. Immunol.，第 1703 卷，即 2186-2194(2003)非專利文獻(xiàn)3 :Blood，第 103 卷，pp. 3530-3540(2003)非專利文獻(xiàn)4 :Gene Therapy，第 7 卷，pp. 1369-1377(2000)非專利文獻(xiàn)5 J.Clin. Invest.，第 114 卷，pp. 1774-1781(2004)非專利文獻(xiàn)6 Cancer Res.，第 66 卷，pp. 3331-3337 (2006)本發(fā)明的公開內(nèi)容通過本發(fā)明解決的問題本發(fā)明的目的是提供其中不期望的寡聚物形成被抑制的細(xì)胞和抑制寡聚物形成 的方法，所述不期望的寡聚物的形成是在將編碼能夠組成寡聚蛋白的外源多肽的基因?qū)?表達(dá)所述寡聚蛋白的細(xì)胞時(shí)引起內(nèi)源和外源多肽混合而發(fā)生的。解決問題的方法本發(fā)明的第一方面涉及表達(dá)非天然寡聚蛋白的細(xì)胞，其包含導(dǎo)入的編碼相應(yīng)于至 少一種組成天然寡聚蛋白的內(nèi)源多肽的組成非天然寡聚蛋白的外源多肽的基因，其中所述 內(nèi)源多肽的表達(dá)被抑制。在本發(fā)明的第一方面，寡聚蛋白可由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，寡聚蛋白可以是抗原 識(shí)別受體，特別地，抗原識(shí)別受體可以是T細(xì)胞受體(TCR)。此外，內(nèi)源多肽的表達(dá)可被RNA 干擾抑制，寡聚蛋白可由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，并且組成寡聚蛋白的內(nèi)源多肽的表達(dá)可被 靶向相應(yīng)于多肽的恒定區(qū)的mRNA序列的RNA干擾抑制。此外，外源多肽可具有與內(nèi)源多肽 的恒定區(qū)的氨基酸序列有相同的氨基酸序列的恒定區(qū)，并且內(nèi)源多肽的表達(dá)可通過產(chǎn)生與 內(nèi)源多肽的mRNA的核苷酸序列不同的外源多肽的mRNA的核苷酸序列來抑制。本發(fā)明的第二方面涉及產(chǎn)生表達(dá)非天然寡聚蛋白的細(xì)胞的方法，其包括進(jìn)行下列 步驟(a)將基因?qū)肽軌虮磉_(dá)所述天然寡聚蛋白的細(xì)胞的步驟，其中所述基因編碼相 應(yīng)于至少一種組成天然寡聚蛋白的內(nèi)源多肽的組成非天然寡聚蛋白的外源多肽，和(b)抑制所述內(nèi)源多肽的表達(dá)的步驟。在本發(fā)明的第二方面，寡聚蛋白可由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，寡聚蛋白可以是抗原識(shí)別受體，特別地，抗原識(shí)別受體可以是TCR。此外，內(nèi)源多肽的表達(dá)可被RNA干擾抑制，寡 聚蛋白可由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，并且組成寡聚蛋白的內(nèi)源多肽的表達(dá)可被靶向相應(yīng)于多 肽的恒定區(qū)的mRNA序列的RNA干擾抑制。此外，外源多肽可具有與內(nèi)源多肽的恒定區(qū)的 氨基酸序列有相同的氨基酸序列的恒定區(qū)，并且內(nèi)源多肽的表達(dá)可通過產(chǎn)生與內(nèi)源多肽的 mRNA的核苷酸序列不同的外源多肽的mRNA的核苷酸序列來抑制。本發(fā)明的第三方面涉及形成非天然寡聚蛋白的方法，其包括進(jìn)行下列步驟(a)將基因?qū)肽軌虮磉_(dá)所述天然寡聚蛋白的細(xì)胞的步驟，其中所述基因編碼相 應(yīng)于至少一種組成天然寡聚蛋白的內(nèi)源多肽的組成非天然寡聚蛋白的外源多肽，和(b)抑制所述內(nèi)源多肽的表達(dá)的步驟。在本發(fā)明的第三方面，寡聚蛋白可由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，寡聚蛋白可以是抗原 識(shí)別受體，特別地，抗原識(shí)別受體可以是TCR。此外，內(nèi)源多肽的表達(dá)可被RNA干擾抑制，寡 聚蛋白可由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，并且組成寡聚蛋白的內(nèi)源多肽的表達(dá)可被靶向相應(yīng)于多 肽的恒定區(qū)的mRNA序列的RNA干擾抑制。此外，外源多肽可具有與內(nèi)源多肽的恒定區(qū)的 氨基酸序列有相同的氨基酸序列的恒定區(qū)，并且內(nèi)源多肽的表達(dá)可通過產(chǎn)生與內(nèi)源多肽的 mRNA的核苷酸序列不同的外源多肽的mRNA的核苷酸序列來抑制。本發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，提供了以高比率表達(dá)保持期望的功能的寡聚蛋白的細(xì)胞，其中至少 一種內(nèi)源多肽用外源多肽來替代。所述細(xì)胞極其適用于通過細(xì)胞醫(yī)療來治療疾病。附圖概述


圖1是顯示TCR基因的表達(dá)的圖。
圖2是顯示TCR陽性細(xì)胞的比率的圖。
圖3是顯示TCR陽性細(xì)胞的PE的熒光強(qiáng)度的圖。
圖4是顯示TCRa基因的表達(dá)的圖。
圖5是顯示TCR3基因的表達(dá)的圖。
圖6是顯示MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比率的圖。
圖7是顯示Rm/Fh插入物的構(gòu)建的流程的圖。
圖8是顯示T3載體的構(gòu)建的流程的圖。
圖9是顯示T7載體的構(gòu)建的流程的圖。
圖10是顯示T15載體的構(gòu)建的流程的圖。
圖11是顯示pSINsi-hH/hU的構(gòu)建的流程的圖。
圖12是顯示HB/UA插入物的構(gòu)建的流程的圖。
圖13是顯示Tm載體的構(gòu)建的流程的圖。
圖14是顯示TN5載體的構(gòu)建的流程的圖。
圖15是顯示pMS-a-hUTCRA-Pbl的構(gòu)建的流程的圖。
圖16是顯示TN9載體和TN11載體的構(gòu)建的流程圖的圖。
圖17是顯示TCR基因的表達(dá)的圖。
圖18是顯示MAGE-A4四聚體陽生細(xì)胞比率的圖。
圖19是顯示TCR基因的表達(dá)的圖。
圖20是顯示MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比率的圖。
圖21是顯示細(xì)胞內(nèi)IFNY陽性細(xì)胞的比率的圖。圖22是顯示TCR基因的表達(dá)(感染后5天)的圖。圖23是顯示TCR基因的表達(dá)(感染后11天)的圖。圖24是顯示MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比率的圖。圖25是顯示細(xì)胞內(nèi)IFNY陽性細(xì)胞的比率的圖。圖26是顯示MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比率的圖。圖27是顯示TCR基因的表達(dá)的圖。實(shí)施本發(fā)明的最佳模式如本文所使用的，“寡聚蛋白”意指由多個(gè)組成性多肽(亞基)組成的蛋白質(zhì)。寡 聚蛋白可以是由多個(gè)相同多肽組成的同寡聚體(homooligomer)或由多種類型的多肽組成 的異寡聚(heterooligomer)。此外，作為組成元件的多肽的數(shù)目不受特別限制，本發(fā)明可用 于二聚體、三聚體、四聚體和由更多數(shù)目的多肽組成的寡聚體的任一種。寡聚蛋白通過共價(jià) 鍵例如多肽之間的二硫鍵(SS鍵)、靜電鍵等形成。如本文所使用的，“內(nèi)源多肽”意指從細(xì)胞內(nèi)原有基因天然表達(dá)的多肽。相反地， “外源多肽”意指已人為地從外部導(dǎo)入的多肽，其實(shí)例包括通過物理方法導(dǎo)入細(xì)胞的多肽和 由本身不存在于其中導(dǎo)入了所述多肽的細(xì)胞中的外源基因表達(dá)的多肽。此外，“非天然寡聚 蛋白”是其中至少一種組成蛋白的內(nèi)源多肽用外源多肽替代的寡聚蛋白，其包括由單獨(dú)的 外源多肽組成的寡聚蛋白和包含內(nèi)源多肽和外源多肽的寡聚蛋白的任一種寡聚蛋白。雖然 本發(fā)明不受特別限制，但通常地，外源多肽具有在使得可形成寡聚蛋白的范圍內(nèi)與內(nèi)源多 肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。如本文所使用的，“多肽的表達(dá)的抑制”意指通過阻止編碼多肽的基因的轉(zhuǎn)錄和/ 或翻譯產(chǎn)生的對最終多肽的產(chǎn)生的抑制，即，作為產(chǎn)物的多肽的量的減少。因此，即使當(dāng)編 碼多肽的基因的轉(zhuǎn)錄未被抑制時(shí)，只要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)被快速降解以及蛋白質(zhì)的產(chǎn)生被 抑制，其仍包括在“表達(dá)的抑制”內(nèi)。在本發(fā)明中，選擇性抑制其表達(dá)期望被抑制的內(nèi)源多 肽的表達(dá)?！岸嚯牡谋磉_(dá)的抑制”的意義不受特別限制。優(yōu)選，使用可選擇性抑制多肽的表 達(dá)的意義。例如，基于對多肽的空間結(jié)構(gòu)或氨基酸序列或編碼多肽的核苷酸序列的特異性 抑制多肽的表達(dá)的意義在本發(fā)明中是優(yōu)選的。所述意義不受特別限制，以作為抑制多肽從 mRNA翻譯的方法的RNA干擾、核酶和反義RNAT為例進(jìn)行了說明。如本文所使用的，“抗原識(shí)別受體”意指特異性識(shí)別抗原的蛋白質(zhì)。作為抗原識(shí)別 受體，例示了人源性T細(xì)胞受體(TCR)和來源了除了人以外的生物體的TCR。作為TCR，由 a鏈和0鏈組成的異二聚體和由Y鏈和8鏈組成的異二聚體是已知的，并且其中的任一 個(gè)可優(yōu)選用于本發(fā)明。如本文所使用的，“T細(xì)胞”也稱為T淋巴細(xì)胞，意指在參與免疫應(yīng)答的淋巴細(xì) 胞當(dāng)中來源于胸腺的細(xì)胞。T細(xì)胞的實(shí)例包括輔助T細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞、控制性T細(xì)胞 (controlling T cell)、CTL、幼稚 T 細(xì)胞(naive T cell)、記憶性 T 細(xì)胞、表達(dá) a 鏈和 3鏈的TCR的a 3 T細(xì)胞和表達(dá)Y鏈和5鏈的TCR的、S T細(xì)胞。作為“包含T細(xì)胞的 細(xì)胞群體”，例示了細(xì)胞群體包括血液(外周血、臍帶血等)或骨髓液、從血液、骨髓液等收 集、分離、純化和誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞(PBMC)、血細(xì)胞、造血干細(xì)胞或臍帶血單核細(xì)胞。此外，來源于血細(xì)胞的包含T細(xì)胞的不同細(xì)胞群體可用于本發(fā)明。此類細(xì)胞可用細(xì)胞因子例 如IL-2體內(nèi)或離體(exo vivo)激活。關(guān)于此類細(xì)胞，可使用從活體收集的細(xì)胞、或通過體 外培養(yǎng)獲得的細(xì)胞例如實(shí)際上通過本發(fā)明的方法獲得的T細(xì)胞群體、或已冷藏保存的包含 T細(xì)胞群體的群體的任一種。在下面，將具體地解釋本發(fā)明。(1)本發(fā)明的細(xì)胞本發(fā)明的細(xì)胞是包含導(dǎo)入的編碼相應(yīng)于至少一種組成天然寡聚蛋白的內(nèi)源多肽 的外源多肽的基因的細(xì)胞，其中所述內(nèi)源多肽的表達(dá)被抑制，由此，可表達(dá)非天然寡聚蛋 白。通過上述構(gòu)建，本發(fā)明具有這樣的有利方面，即與其中只是將外源多肽在細(xì)胞中表達(dá)的 情況相比較，更有效地形成了具有期望的功能并且包含作為組成性多肽的外源多肽的非天 然寡聚蛋白。當(dāng)待表達(dá)的非天然寡聚蛋白是同寡聚體時(shí)，如果內(nèi)源多肽的表達(dá)被適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)抑 制方法抑制，并且外源多肽表達(dá)時(shí)，期望的非天然寡聚蛋白的形成比率得到提高。在異寡聚 體的情況下，存在兩種情況其中寡聚蛋白的功能通過用外源多肽只替代一種類型的組成 性多肽來改變的情況；和其中用外源多肽替代所有組成性多肽是必需的情況。在兩種情況 中，進(jìn)行這樣的處理以使相應(yīng)于待導(dǎo)入的外源多肽的不期望被整合入期望的非天然寡聚蛋 白的內(nèi)源多肽的表達(dá)被抑制。例如，在其中當(dāng)用兩種類型的外源多肽形成作為寡聚蛋白的 異二聚體時(shí)期望的功能得到發(fā)揮的情況下，抑制相應(yīng)于各多肽的兩種類型的內(nèi)源多肽的表 達(dá)。此外，當(dāng)期望形成由一種類型的外源多肽和另一種類型的內(nèi)源多肽組成的異二聚體時(shí)， 選擇性抑制與外源多肽競爭的內(nèi)源多肽的表達(dá)。此外，本發(fā)明的細(xì)胞可以是這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中內(nèi)源多肽的表達(dá)，與外源多 肽的表達(dá)相比較，被選擇性抑制，并且與不使用表達(dá)抑制方法的情況相比較，內(nèi)源多肽的表 達(dá)水平可以是20%或更多，40%或更多，60%或更多，80%或更多或100%，即表達(dá)可被完 全抑制。本發(fā)明可用于的寡聚蛋白不受特別限制，僅例示了結(jié)構(gòu)蛋白、酶、轉(zhuǎn)錄因子、受體 和抗體。此外，在本發(fā)明中，寡聚蛋白可以是細(xì)胞表面蛋白(膜蛋白)，并且對于抗原識(shí)別受 體，例如實(shí)施例部分中例示的T細(xì)胞受體(TCR)的應(yīng)用是特別優(yōu)選的。在本發(fā)明的細(xì)胞中，由于組成天然寡聚蛋白的內(nèi)源多肽的表達(dá)被抑制，因此外源 多肽與內(nèi)源多肽之間的競爭被抑制，從而形成包含外源多肽(其表達(dá)是期望的)的適當(dāng)?shù)?寡聚蛋白。用于本發(fā)明的細(xì)胞不受特別限制，只要細(xì)胞表達(dá)寡聚蛋白，并且可使用動(dòng)物細(xì)胞、 植物細(xì)胞和微生物中的任一種。由于來源于人或除了人以外的動(dòng)物的T細(xì)胞表達(dá)形成異二 聚體的TCR，因而為了改變TCR(雖然目的不受特別限制)可在本發(fā)明中使用所述細(xì)胞。本 發(fā)明的細(xì)胞不需要目的在于使內(nèi)源多肽不表達(dá)的編碼內(nèi)源多肽的基因的缺失或分化誘導(dǎo)。 即，本發(fā)明可使用表達(dá)內(nèi)源多肽的細(xì)胞，從而其是有用的。在本發(fā)明中，作為抑制多肽的表達(dá)的方法的一個(gè)方面，利用RNA干擾(RNAi)。RNA 干擾報(bào)導(dǎo)于1998年，并且一直以來作為抑制基因表達(dá)(歸因于通過雙鏈RNA進(jìn)行的序列特 異性mRNA的降解)的現(xiàn)象吸引人們的注意。RNA干擾據(jù)認(rèn)為是通過這樣的機(jī)制而發(fā)生的，在 該機(jī)制中，長雙鏈RNA由于稱為切酶(Dicer)的RNA酶III型的活性而被降解成稱為siRNA的21至25個(gè)核苷酸的短RNA，隨后，siRNA被整合入稱為RISC (RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物)的核 糖核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后該復(fù)合物以ATP依賴性的方式結(jié)合至靶RNA，從而降解靶RNA。在本發(fā)明的RNA干擾中，為了選擇性抑制內(nèi)源多肽的表達(dá)，利用與從編碼內(nèi)源多 肽的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的核苷酸序列同源或與其互補(bǔ)的RNA分子或包含與mRNA的核苷酸序 列同源或與其互補(bǔ)的序列的鏈的雙鏈RNA分子。在本文中，“與從編碼內(nèi)源多肽的基因轉(zhuǎn) 錄的mRNA的核苷酸序列同源或互補(bǔ)”和“與編碼內(nèi)源多肽的mRNA的核苷酸序列同源或互 補(bǔ)”不僅指與mRNA的核苷酸序列完全同源或互補(bǔ)，而且還指在使得發(fā)揮期望的功能的范圍 內(nèi)大體上同源或互補(bǔ)。此外，用于本發(fā)明的RNA分子稱為siRNA (短干擾RNA)。siRNA可以 是與從編碼內(nèi)源多肽的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的一個(gè)區(qū)域同源或互補(bǔ)的一種類型的siRNA，或可 以是包括多個(gè)與多個(gè)區(qū)域同源或互補(bǔ)的雙鏈RNA分子的siRNA。關(guān)于用于本發(fā)明的siRNA的鏈長，從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中干擾素應(yīng)答的抑制的角度來 看，例如，例示了具有13至29個(gè)堿基的鏈長的siRNA，優(yōu)選具有15至25個(gè)堿基對的鏈長的 siRNA和更優(yōu)選，具有20至25個(gè)堿基對的鏈長的siRNA。此外，可能使用其中所有具有上 述鏈長的核苷酸序列都來源于內(nèi)源多肽的mRNA的核苷酸序列或其部分來源于所述核苷酸 序列的siRNA。此外，用于本發(fā)明的siRNA，從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNA干擾的功效的角度來看， 可以是例如具有在3’-末端側(cè)上突出的2至4個(gè)堿基的單鏈區(qū)的雙鏈RNA的形狀的siRNA 或更優(yōu)選具有在3’-末端側(cè)上突變的2個(gè)堿基的單鏈區(qū)的雙鏈RNA的形狀的siRNA。作為 突出的單鏈區(qū)，例示了 2至4個(gè)堿基(TT、TTT、TTTT)的連續(xù)脫氧胸苷殘基。用于本發(fā)明的siRNA主要由核糖核苷酸組成，并且其部分可包含脫氧核糖核苷 酸、脫氧核糖核苷酸的衍生物和/或核糖核苷酸的衍生物。本發(fā)明的RNA不受特別限制，可 通過已知的化學(xué)合成方法合成。備選地，可用適當(dāng)?shù)哪０搴怂崦复僦苽?例如，使用RNA聚 合酶)RNA。用于本發(fā)明的siRNA可來源于能夠在分子中形成雙鏈的單鏈RNA，例示了具有 作為莖的siRNA和作為環(huán)(shRNA)的任選序列的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(短發(fā)夾結(jié)構(gòu)sh結(jié)構(gòu))的單 鏈RNA。作為任選序列，例示了 1至30個(gè)核苷酸的序列，可使用優(yōu)選1至25個(gè)核苷酸的序 列，更優(yōu)選5至22個(gè)核苷酸的序列。關(guān)于用于本發(fā)明的siRNA，可將siRNA或包含siRNA的RNA分子直接導(dǎo)入細(xì)胞，或 可將在細(xì)胞中從其轉(zhuǎn)錄siRNA或包含siRNA的RNA分子的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞。當(dāng)將siRNA 或包含siRNA的RNA分子直接導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，適當(dāng)?shù)乜墒褂肨ransIT-TK0(由Mirus生產(chǎn)的) 或人T細(xì)胞Nucleofector試劑盒(Amaxa)。在另一方面，當(dāng)使用從其轉(zhuǎn)錄RNA分子的核酸 構(gòu)建體時(shí)，可能使用其中編碼siRNA或包含siRNA的RNA的核酸與啟動(dòng)子的下游連接的構(gòu) 建體，所述啟動(dòng)子能夠以其中可轉(zhuǎn)錄siRNA的狀態(tài)，即功能性地，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮功 能，雖然本發(fā)明不特別地限定于其。作為優(yōu)選方面，例示了其中編碼組成能夠抑制編碼內(nèi)源 多肽的基因的表達(dá)的雙鏈RNA的RNA鏈的核酸被置于啟動(dòng)子的下游的構(gòu)建體。用于核酸構(gòu)建體的啟動(dòng)子不受特別限制，只要其可在哺乳動(dòng)物中發(fā)揮功能，其實(shí) 例包括RNA聚合酶II啟動(dòng)子、RNA聚合酶III啟動(dòng)子和可用四環(huán)素調(diào)控的啟動(dòng)子。此外，有 利地使用組織特異性啟動(dòng)子，因?yàn)檫@使得可能在期望的細(xì)胞、位置或器官中特異性抑制內(nèi) 源多肽的功能。RNA聚合酶II啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于CMV啟動(dòng)子等。此外，RNA聚合 酶III啟動(dòng)子的實(shí)例包括tRNA啟動(dòng)子、U6snRNA啟動(dòng)子、組蛋白HI啟動(dòng)子等?？捎盟沫h(huán)素 調(diào)控的啟動(dòng)子的實(shí)例包括四環(huán)素調(diào)控型TO啟動(dòng)子、TR啟動(dòng)子等。通過將啟動(dòng)子與Cre-loxP系統(tǒng)組合，可更嚴(yán)格地控制RNA的轉(zhuǎn)錄。用于本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的構(gòu)建不受特別限制。例如，可這樣構(gòu)建構(gòu)建體以使得 能夠抑制目的基因的功能的雙鏈RNA的有義和反義鏈根據(jù)下列系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄(A)分別轉(zhuǎn)錄有 義RNA和反義RNA的串聯(lián)型，其中編碼有義RNA的核酸和編碼反義RNA的核酸分別連接至不 同的兩個(gè)啟動(dòng)子的下游，并且兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位以正向排列，(B)轉(zhuǎn)錄莖-環(huán)型(或短發(fā)夾型) 的RNA的類型，其中有義RNA和反義RNA直接連接或通過環(huán)連接，其中編碼有義RNA的核酸 和編碼反義RNA的核酸以正向置于一個(gè)啟動(dòng)子的下游，或(C)相對型(opposite type)，其 中啟動(dòng)子在每一條鏈中分別被置于編碼有義鏈或反義鏈的核酸的兩個(gè)末端，并且兩條RNA 鏈都通過分開的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明中，取決于使用條件，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的類型以及 有義序列和反義序列的類型，可選擇性使用串聯(lián)型、莖-環(huán)型或相對型。用于本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可被整合入適當(dāng)?shù)妮d體，例如質(zhì)粒載體或病毒載體以使 其可在細(xì)胞中更穩(wěn)定地發(fā)揮作用。此外，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可被整合入細(xì)胞的染色體 DNA。質(zhì)粒載體不受特別限制，其實(shí)例包括表達(dá)用于RNA干擾的核酸的piGENE tRNA質(zhì)粒 (商品名稱，由iGENE生產(chǎn)的)、siLentGene (由Promega生產(chǎn)的)、pSEC Hygro載體(由 Ambion生產(chǎn)的)、pBAsi載體(由TAKARA BI0生產(chǎn)的)等。病毒載體的實(shí)例包括腺病毒載 體、腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體等。作為可商購獲得的腺病毒載體的實(shí) 例，例示了基因敲除腺病毒RNAi系統(tǒng)(由Clontech生產(chǎn)的)，以及，作為可商購獲得的逆轉(zhuǎn) 錄病毒載體的實(shí)例，例示了 pSINsi載體(由TAKARA BI0生產(chǎn)的)和pSIREN-RetroQ載體 (由Clontech生產(chǎn)的)?？砂凑者m合于載體的適當(dāng)方法，例如在質(zhì)粒載體的情況下通過電穿孔法、脂質(zhì)轉(zhuǎn) 染法等或在病毒載體的情況下通過利用病毒感染細(xì)胞的能力將制備的載體導(dǎo)入目的細(xì)胞。在本發(fā)明中，當(dāng)包含在非天然寡聚蛋白中的外源多肽與相應(yīng)于外源多肽的內(nèi)源多 肽存在時(shí)，它們彼此競爭寡聚蛋白的形成并且，同時(shí)，形成幾種類型的包含外源多肽或內(nèi)源 多肽的寡聚蛋白。在本發(fā)明的細(xì)胞中表達(dá)的外源多肽不受特別限制，只要其是與內(nèi)源多肽 相比其表達(dá)幾乎不被所使用的抑制表達(dá)的方法抑制的多肽，優(yōu)選其表達(dá)不被抑制的多肽。 例如，當(dāng)siRNA用作抑制表達(dá)的方法時(shí)，優(yōu)選地，編碼待導(dǎo)入的外源多肽的基因優(yōu)選是從其 轉(zhuǎn)錄的RNA與siRNA不具有高度同源性或互補(bǔ)的這樣的核苷酸序列，即不接受siRNA的作 用的序列。當(dāng)siRNA所作用的RNA上的區(qū)域在內(nèi)源多肽與外源多肽之間相同時(shí)，可改變外源 多肽的核苷酸序列而不改變編碼的氨基酸序列。已知對于每一種氨基酸，基因上存在1至 6種賦予氨基酸的密碼子(3個(gè)堿基的組合)。通過選擇適當(dāng)?shù)拿艽a子，可改變堿基而不改 變編碼的氨基酸序列(該改變稱為沉默突變)。即，核酸序列不同，但氨基酸序列可以相同。 在沉默突變中，可在許多情況下改變密碼子的第三堿基。當(dāng)將該沉默突變導(dǎo)入編碼外源多 肽的基因時(shí)，抑制內(nèi)源多肽的表達(dá)的siRNA不作用于從編碼外源多肽的基因轉(zhuǎn)錄的RNA，從 而減少了對外源多肽表達(dá)的抑制。因此，與外源多肽的表達(dá)相比較，可選擇性抑制內(nèi)源多肽 的表達(dá)。在本說明書中，其中如上所述導(dǎo)入了沉默突變的基因在下面的一些情況下稱為“密 碼子修飾(odonmodified)”基因。當(dāng)通過通過選擇密碼子(所述密碼子是其中使用該密碼 子的宿主中頻繁使用的密碼子)和增加翻譯效率的序列進(jìn)行的改變來改變核苷酸序列時(shí)， 可提高外源多肽的表達(dá)效率，雖然本發(fā)明不限定于其。此外，在用siRNA抑制內(nèi)源多肽的表達(dá)的另一個(gè)方面中，關(guān)于相應(yīng)于siRNA所作用的RNA的區(qū)域的外源多肽的氨基酸序列，可通過在使得外源多肽的功能不受損的范圍內(nèi) 用另一種氨基酸置換，例如使用相似氨基酸置換來改變氨基酸序列。相似的氨基酸意指在 物理化學(xué)性質(zhì)上相似的氨基酸，其實(shí)例包括分類為相同類型的氨基酸，例如芳香族氨基酸 (Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、lie、Val)、極性氨基酸(Gin、Asn)、堿性氨基酸 (Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羥基的氨基酸(Ser、Thr)、具有小側(cè)鏈的氨基 酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)等。預(yù)期使用這樣的相似的氨基酸的置換不導(dǎo)致多肽的表型 的改變(即保守氨基酸置換)。保守氨基酸置換的實(shí)例在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知，并且公開于許多 文獻(xiàn)中(例如，請參見例如Bowie等人，Science，第247卷，pp. 1306-1310(1990))。通過將 保守氨基酸置換導(dǎo)入外源多肽，抑制源內(nèi)源多肽的外源多肽表達(dá)的siRNA不作用于從編碼 外源多肽的基因轉(zhuǎn)錄的RNA，從而減小表達(dá)的抑制。因此，與外源多肽的表達(dá)相比較，內(nèi)源多 肽的表達(dá)可被選擇性抑制。作為T細(xì)胞受體(TCR)，存在兩種類型的TCR，包括由a鏈和0鏈組成的異二聚 體和由、鏈和S鏈組成的異二聚體。TCR的各鏈由可變(V)區(qū)、連接(J)區(qū)和恒定(C)區(qū) 組成。TCR的V區(qū)的多樣性因編碼V區(qū)的基因區(qū)段的組合、重排結(jié)合位點(diǎn)的滑脫和在DNA重 排后N序列至結(jié)合位點(diǎn)的插入而發(fā)生。在a鏈和0鏈的V區(qū)中，其中氨基酸序列的突變 特別頻繁發(fā)生的高變區(qū)(CDR)得到公認(rèn)。作為本發(fā)明的一個(gè)方面，例示了表達(dá)非天然TCR的T細(xì)胞，其包含導(dǎo)入的編碼組成 非天然TCR的外源多肽的基因，其中相應(yīng)于所述外源多肽的內(nèi)源多肽的表達(dá)被抑制。例如， 當(dāng)將識(shí)別期望的抗原的TCR作為外源TCR導(dǎo)入T細(xì)胞時(shí)，在其中內(nèi)源TCR的表達(dá)被抑制的 本發(fā)明的T細(xì)胞中，外源多肽與內(nèi)源多肽之間的錯(cuò)配減少，從而，包含目的外源多肽的TCR 異二聚體的分子數(shù)目增加。此外，因?yàn)閮?nèi)源TCR的表達(dá)被抑制，在存在于細(xì)胞表面上的TCR 當(dāng)中，非天然TCR的比率增加，并且只表達(dá)非天然TCR的單價(jià)T細(xì)胞增加。因此，對于抗原 的特異性得到提高，這在細(xì)胞治療等的領(lǐng)域內(nèi)是非常有利的。此外，存在這樣的可能性，即 在將外源TCR導(dǎo)入表達(dá)內(nèi)源TCR的細(xì)胞時(shí)，內(nèi)源TCR和外源TCR的基因表達(dá)彼此競爭，從而 外源TCR的表達(dá)減少。此外，還存在另外的可能性，即由于錯(cuò)配的TCR而導(dǎo)致的副作用例如 移植物抗宿主病(GVHD)等可發(fā)生。本發(fā)明的細(xì)胞可避免外源TCR的表達(dá)減少或包括GVDH 在內(nèi)的副作用。各T細(xì)胞中內(nèi)源TCR的V區(qū)的氨基酸序列彼此不同，然而C區(qū)的氨基酸序列適合 用作siRNA的靴，因?yàn)镃區(qū)的氨基酸序列由相同核苷酸序列的基因編碼，所述核苷酸序列為 各個(gè)T細(xì)胞的共同序列。此外，通過在其中siRNA作用于編碼內(nèi)源多肽的基因的區(qū)域中改 變(置換)編碼外源多肽的基因，即通過獲得密碼子修飾基因來使其成為非作用區(qū)域，內(nèi)源 多肽的表達(dá)被抑制，從而可高效率進(jìn)行外源多肽的表達(dá)。例如，當(dāng)抑制內(nèi)源TCR的表達(dá)時(shí)，在編碼TCR的基因的C區(qū)中，可將內(nèi)源a鏈的核 苷酸序列AGTAAGGATTCTGATGTGTAT (SEQ IDNo. 19)密碼子修飾成外源a鏈的核苷酸序列 AGCAAGGACAGCGACGTGTAC (SEQ ID No. :20)，雖然本發(fā)明不受限于其。由上述兩個(gè)核苷酸序 列編碼的氨基酸序列在SKDSDVY(SEQ IDNo. 21)中具有共同的區(qū)域，但內(nèi)源TCR的a鏈被 通過退火如SEQ ID NO. :3和SEQ ID No. :4顯示的RNA而制備的雙鏈siRNA選擇性抑制。 外源TCRa鏈的一個(gè)實(shí)例是由如SEQ ID No. :1顯示的核苷酸序列編碼的多肽。在SEQ ID No. :1中，核苷酸68至883的核苷酸序列編碼TCRa鏈。其中，核苷酸68至401、核苷酸
10406至461和核苷酸462至883分別編碼V區(qū)、J區(qū)和C區(qū)。SEQ ID No. :1的核苷酸569至 589相應(yīng)于SEQ IDNo. :20，并且上述區(qū)域的序列與內(nèi)源TCRa鏈的相應(yīng)區(qū)域的序列不同。此外，內(nèi)源0鏈的核苷酸序列GCCACCATCCTCTATGAGATC(SEQ ID No. 22)可被密 碼子修飾成外源0鏈的核苷酸序列GCCACCATCCTGTACGAGATC(SEQ ID No. :23)。由上述兩 個(gè)核苷酸序列編碼的氨基酸序列ATILYEI(SEQ ID No. 24)中具有共同的區(qū)域，但內(nèi)源TCR 的3鏈被通過退火如SEQ ID NO. :5和SEQ ID No. :6顯示的RNA而制備的雙鏈siRNA選 擇性抑制 。外源TCR0鏈的一個(gè)實(shí)例是由SEQ ID No. :2中描述的核苷酸序列編碼的多肽。 在SEQ ID No. :1中，核苷酸68至883的核苷酸序列編碼TCR0鏈。在SEQ ID No. :2中， 核苷酸編號68至1006的核苷酸序列編碼TCR0鏈。其中，核苷酸68至414、核苷酸427至 470和核苷酸471至1006分別編碼V區(qū)、J區(qū)和C區(qū)。SEQ ID No. 2的核苷酸902至922 相應(yīng)于SEQ ID No. :23，并且上述區(qū)域的序列與內(nèi)源TCR3鏈的相應(yīng)區(qū)域的序列不同。對其施用含有導(dǎo)入的本發(fā)明的外源TCR的T細(xì)胞的疾病不受特別限制，只要其是 呈現(xiàn)對T細(xì)胞敏感的疾病即可，所述疾病的實(shí)例包括癌癥(白血病，實(shí)體瘤等)、具有病毒、 細(xì)菌或真菌的病原體的傳染性疾病例如肝炎、流感、HIV等，例如結(jié)核病、MRSA、VRE和深部 真菌病(deepmycosis)。此外，本發(fā)明的細(xì)胞可用于在骨髓移植或輻射照射后或在為了緩和 再發(fā)性白血病而輸注供體淋巴細(xì)胞中預(yù)防傳染性疾病。在本發(fā)明中，用于導(dǎo)入編碼外源多肽的基因的方法不受特別限制，并且可從已知 的基因?qū)敕椒ㄖ羞x擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行使用。關(guān)于基因?qū)敕椒?，可使用任何使用病毒載 體的方法和不使用載體的方法。許多文獻(xiàn)已經(jīng)公開關(guān)于此類方法的詳細(xì)描述。病毒載體不受特別限制，可使用通常用于基因?qū)敕椒ǖ囊阎牟《据d體，例如， 可使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒載體，假型載體)、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、猿猴 病毒載體、痘苗病毒載體、仙臺(tái)病毒載體等。特別優(yōu)選，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或 慢病毒載體。在復(fù)制能力上有缺陷從而不能在感染細(xì)胞中自我復(fù)制的病毒載體是適當(dāng)?shù)摹?此外，提高基因?qū)胄实奈镔|(zhì)例如RetroNectin (注冊商標(biāo)，由TAKARA BI0制造的)可用 于基因?qū)?。作為不使用病毒載體的基因?qū)敕椒?，可使用例如使用載體例如脂質(zhì)體或配 體_多聚賴氨酸的方法、磷酸鈣法、電穿孔法、基因槍法等，雖然本發(fā)明不受限于其。在該情 況下，導(dǎo)入整合入質(zhì)粒DNA的外原基因、線性DNA(straight DNA)或RNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體可將插入載體中的外源基因穩(wěn)定地整合入將向其 中導(dǎo)入載體的細(xì)胞的染色體DNA，和用于基因治療等目的?？墒褂镁幋a外源多肽的基因，其中將基因插入載體或質(zhì)粒以使基因在適當(dāng)?shù)膯?dòng) 子控制之下表達(dá)。備選地，為了獲得基因的高效率轉(zhuǎn)錄，與啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)合作的另 一種調(diào)控序列例如增強(qiáng)子或終止子序列可存在于載體中。備選地，為了通過同源重組插入 將向其中導(dǎo)入基因的T細(xì)胞的染色體，例如，可將基因置于側(cè)翼序列之間，所述側(cè)翼序列由 各自具有與染色體中基因的期望靶插入位點(diǎn)的兩側(cè)上的核苷酸序列的同源性的核苷酸序 列組成?？蓪⒂糜凇耙种贫嚯牡谋磉_(dá)”的方法中的核酸，例如從其轉(zhuǎn)錄siRNA或包含siRNA 的RNA的核酸構(gòu)建體和編碼外源多肽的基因分別地導(dǎo)入細(xì)胞，或可用單個(gè)載體將其導(dǎo)入細(xì) 胞。
(2)用于產(chǎn)生本發(fā)明的細(xì)胞的方法，和形成本發(fā)明的非天然寡聚蛋白的方法用于產(chǎn)生本發(fā)明的細(xì)胞的方法和用于抑制本發(fā)明的內(nèi)源和外源多肽組成的寡聚 體形成的方法，包括下列步驟(a)將編碼相應(yīng)于至少一種組成寡聚蛋白的內(nèi)源多肽的外源多肽的基因?qū)氡磉_(dá) 所述寡聚蛋白的細(xì)胞的步驟；和(b)抑制所述內(nèi)源多肽的表達(dá)的步驟。用于產(chǎn)生本發(fā)明的細(xì)胞的方法是用于產(chǎn)生(1)中描述的本發(fā)明的細(xì)胞的方法。因 為通過該方法獲得的細(xì)胞減少了內(nèi)源多肽對含有外源多肽的非天然寡聚蛋白的形成的干 擾，所以與在其中只是將外源多肽在細(xì)胞中表達(dá)的情況相比較，具有期望的功能的非天然 寡聚蛋白得到高效率地形成。步驟(a)和步驟(b)的順序不受特別限定，其中的任一步驟都可以為第一步驟。備 選地，可同時(shí)進(jìn)行這些步驟?？赏ㄟ^向在本發(fā)明的方法中進(jìn)行的步驟加入分選或分離其中 所述內(nèi)源多肽的表達(dá)被抑制的細(xì)胞的步驟來誘導(dǎo)、培養(yǎng)或分離含有所述細(xì)胞的細(xì)胞群體， 此外，產(chǎn)生含有此類細(xì)胞的細(xì)胞群體的方法也包括在本發(fā)明的方法內(nèi)。可進(jìn)行該分選或分 離步驟，使用組成適當(dāng)?shù)姆翘烊还丫鄣鞍椎耐庠炊嚯牡谋磉_(dá)作為指標(biāo)。此外，可向本發(fā)明的方法的步驟加入已知的蛋白質(zhì)或化學(xué)組分，例如，在T細(xì)胞 的情況下，可加入細(xì)胞因子、趨化因子和其他組分。在本文中，細(xì)胞因子不受特別限制，只 要其可作用于并且活化T細(xì)胞，其實(shí)例包括IL-2、IFN-y、TGF-3、IL-15、IL_7、IFN-a、 IL-12、⑶40L、IL-27等，從細(xì)胞免疫的增強(qiáng)的角度來看，特別優(yōu)選實(shí)例包括IL_2、IFN_ Y和 IL-12。此外，趨化因子不受特別限制，只要其作用于T細(xì)胞并且展示遷移活性，其實(shí)例包括 RANTES、CCL21、MIP1 a、MIP13、CCL19、CXCL12、IP-10 或 MIG。
實(shí)施例下列實(shí)施例進(jìn)一步更具體地舉例說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限定于下列實(shí)施例。此夕卜,根據(jù)由 T.Maniatis，等人編著，由 Cold Spring HarborLaboratory 于 2001 出版的Molecular Cloning :A Laboratory Manual第3版的描述進(jìn)行本文所描述的操作的
基本操作。實(shí)施例1野生型和密碼子修飾人T細(xì)胞受體的a和0基因的制備通過改變野生型基因的一部分來制備密碼子修飾人抗-MAGE_A4TCRa基因。將含 有該基因的核酸片段克隆入pPCR-SCript(Stratagene)的Kpnl-Xhol位點(diǎn)。含有密碼子修 飾人抗-MAGE-A4TCRa基因的核酸片段的序列在序列表中表示為SEQ ID No. :1。通過改變野生型基因的一部分來制備密碼子修飾人抗-MAGE-4TCR0基因。 將含有該基因的核酸片段克隆入pPCR-Script的Kpnl-Xhol位點(diǎn)。含有密碼修飾人 抗-MAGE-A4TCR0基因的核酸片段的序列在序列表中表示為SEQ ID No. :2。實(shí)施例2人外周血單核細(xì)胞中siRNA的基因沉默效應(yīng)的確認(rèn)將通過退火SEQ ID Nos. :3和4而制備的針對野生型TCRa的雙鏈 siRNA (siTCR-A，50pmol)和通過退火SEQ ID Nos. :5和6而制備的針對野生型TCR 3的雙 鏈siRNA(siTCR-B，50pmol)混合，然后按照產(chǎn)品手冊中的步驟使用人T細(xì)胞Nucleofector 試劑盒(Amaxa)將其導(dǎo)入從人外周血分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。作為陰性對照，導(dǎo)入
12lOOpmol的通過退火SEQ ID Nos. :7和8而制備的siRNA(siNC)。在導(dǎo)入后2天，回收細(xì) 胞，使用QIAGEN RNeasy Micro試劑盒(由Qiagen生產(chǎn)的)進(jìn)行總RNA的提取和DNA酶I 處理。通過使用隨機(jī)引物(6聚體)，利用M-MLV-RT酶使提取的總RNA經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然 后使用SYBR PremixEx Taq以及SEQ ID Nos. :9和10的用于擴(kuò)增野生型TCR a的引物和 SEQID Nos. 13和14的用于擴(kuò)增野生型TCR 0的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，計(jì)算野生型TCR a和 野生型TCR0基因的表達(dá)水平的相對值。使用SEQ IDNos. :17和18的用于擴(kuò)增0 -肌動(dòng) 蛋白基因的引物進(jìn)行總RNA量的標(biāo)準(zhǔn)化。通過計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)相對值相對于對照實(shí)驗(yàn)組中野生型TCRa和野生型 TCR0基因的表達(dá)相對值的比率，可評估基因沉默效應(yīng)。結(jié)果示于圖1。在附圖中，縱軸顯 示在假定陰性對照的值為100的情況下以相對值表示的野生型TCRa和野生型TCR0基因 的表達(dá)水平。橫軸顯示導(dǎo)入的siRNA。如圖1中所示，通過將雙鏈siRNA導(dǎo)入野生型TCRa 和3，獲得對野生型TCRa和0基因的表達(dá)的沉默效應(yīng)。實(shí)施例3人外周血單核細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)抑制效應(yīng)的確認(rèn)在導(dǎo)入雙鏈siRNA后3天，用PE-抗人TCR抗體(由BD Pharmingen生產(chǎn)的)對 在實(shí)施例2中其中已導(dǎo)入了雙鏈siRNA的人外周血單核細(xì)胞進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀測 量TCR陽性細(xì)胞的比率和TCR陽性細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度。圖2顯示TCR陽性細(xì)胞的比率，圖 3顯示TCR陽性細(xì)胞中PE的熒光強(qiáng)度。橫軸顯示導(dǎo)入的siRNA?？v軸在圖2中顯示TCR陽 性細(xì)胞的比率，在圖3中顯示TCR陽性細(xì)胞中PE的熒光強(qiáng)度。如圖2和3中所示，通過導(dǎo) 入針對野生型TCRa和0的雙鏈siRNA，觀察到人外周血單核細(xì)胞的內(nèi)源野生型TCRa/旦 復(fù)合蛋白的表達(dá)比率和表達(dá)水平的減少。實(shí)施例4密碼子修飾TCR表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制備首先，使用如SEQ ID No. :25所示的pPGK5引物和如SEQ ID No. :26所示的pPGK3 引物，利用小鼠基因組作為模板進(jìn)行PCR，獲得含有PGK啟動(dòng)子的DNA片段。將該片段TA克 隆入pITBlue載體(由MERCK生產(chǎn)的)。然后，用NotI和BamHI從該質(zhì)粒切出PGK啟動(dòng)子，將其克隆入pBlueScript_SK+ 載體(由Stratagene生產(chǎn)的)的NotI和BamHI位點(diǎn)來制備pBS-PPGK。使用pMSCVneo (由Clontech生產(chǎn)的)作為模板用如SEQ ID No. :27所示的3MSCV5 引物和如SEQ ID No. :28的3MSCV3引物進(jìn)行PCR來擴(kuò)增CMV3，LTR位點(diǎn)，用Xhol和EcoRI 切割所得的片段，然后克隆入PMT載體[Gene Therapy，第7卷，pp. 797-804 (2000)中描述 的PM載體]的Xho-EcoRI位點(diǎn)來制備pMSMC。用PstI從其中已克隆了實(shí)施例1中的密碼子修飾TCR0基因的質(zhì)粒切取密碼子 修飾TCR0基因，然后將其克隆入pBS-PPGK的PstI位點(diǎn)來制備pBS-Pb2。然后，用SacII和Xhol從pBS_Pb2切出PGK啟動(dòng)子+修飾TCR0基因，然后將其 克隆入pMSMC的SacII-XhoI位點(diǎn)來制備pMS_Pb2。從其中已克隆了實(shí)施例1的密碼子修飾TCRa基因的質(zhì)粒切出密碼子修飾TCRa 基因，然后將其克隆入pMSMC的NotI位點(diǎn)來制備pMS-Ma2.然后，用似《從？1^_1&12切出密碼子修飾110^基因，將其克隆入pMS_Pb2的NotI 位點(diǎn)，從而獲得pMS-aPbl。用質(zhì)粒載體pMS-aPbl轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli) JM109，然后使用QIAGEN
13Plasmid Midi試劑盒(由Qiagen生產(chǎn)的)純化質(zhì)粒DNA，將其用作用于轉(zhuǎn)染的DNA。按照產(chǎn)品方案使用Retrovirus Packaging試劑盒Eco (由TAKARABI0生產(chǎn)的) 將制備的pMS-aPbl載體導(dǎo)入293T細(xì)胞，獲得不同的雙嗜性病毒(amphotropic virus)上 清液，用0. 45iim的過濾器(Milex HV，由Millipore生產(chǎn)的)過濾，然后利用使用凝聚胺 (Polybrene)的方法感染PG13細(xì)胞(ATCC CRL-10686)，通過極限稀釋法克隆細(xì)胞?；厥账?得的克隆細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，用0. 45 P m過濾器過濾，其用作MS-aPbl密碼子修飾TCR表達(dá) 逆轉(zhuǎn)染病毒溶液。實(shí)施例5使用密碼子修飾TCR表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行的人外周血單核細(xì)胞的感染和 siRNA的導(dǎo)入。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，使用RetroNectin將實(shí)施例4中制備的密碼子修飾TCR表達(dá)逆 轉(zhuǎn)錄病毒感染入從人外周血分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC)2次來制備導(dǎo)入改變的TCR表 達(dá)的外周血單核細(xì)胞。在感染后3天，將50pmol siTCR-A(針對野生型TCRa)和50pmol siTCR-B (針對野生型TCR 0 )混合，所述siTCR-A和siTCR-B的基因沉默效應(yīng)已在實(shí)施例2 和3中得到確認(rèn)，按照產(chǎn)品手冊中的方案導(dǎo)入混合物。作為陰性對照，導(dǎo)入lOOpmol的siNC。 各進(jìn)行2個(gè)實(shí)驗(yàn)組。在導(dǎo)入siRNA 2天后，回收細(xì)胞，使用QIAGEN RNeasy Micro試劑盒 (由Qiagen生產(chǎn)的)進(jìn)行總RNA的提取和DNA酶I處理。使用隨機(jī)引物(6聚體)利用 M-MLV-RT酶(由TAKARA BI0生產(chǎn)的)將提取的總RNA經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用SYBR Premix Ex Taq (由TAKARA BI0生產(chǎn)的)以及SEQ IDNos. :9和10的用于擴(kuò)增野生型TCR a的引 物、SEQ ID Nos. :11和12的用于擴(kuò)增密碼子修飾TCRa的引物、SEQ ID Nos. :13和14的 用于擴(kuò)增野生型TCR0的引物或SEQ ID Nos. : 15和16的用于擴(kuò)增密碼子修飾TCR0的引 物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。計(jì)算野生型TCRa、修飾TCRa、野生型TCR0和修飾TCR0基因的表達(dá)水 平的相對值。使用SEQ ID Nos. :17和18的用于擴(kuò)增0 -肌動(dòng)蛋白的引物進(jìn)行總RNA量的 標(biāo)準(zhǔn)化。通過計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)相對值相對于對照實(shí)驗(yàn)組中野生型TCRa、修飾TCRa、 野生型TCR0和修飾TCR0基因的表達(dá)相對值的比率來評估基因沉默效應(yīng)。TCRa的結(jié)果 示于圖4，TCR3的結(jié)果示于圖5。在附圖中，縱軸顯示在假定陰性對照的值為100的情況下 以相對值表示的野生型TCRa、修飾TCRa、野生型TCR0和修飾TCR0基因的表達(dá)水平。橫 軸顯示導(dǎo)入的siRNA。如圖4和5中所示，通過導(dǎo)入針對野生型TCRa和0的雙鏈siRNA， 野生型TCR a和0基因的表達(dá)在PBMC中被抑制，但不發(fā)生修飾TCRa和0基因的表達(dá)的 抑制。實(shí)施例6siRNA至已導(dǎo)入密碼子修飾TCR的人外周血單核細(xì)胞的導(dǎo)入對密碼子修 飾TCR蛋白的表達(dá)的作用在將siRNA導(dǎo)入其中已在實(shí)施例5中導(dǎo)入了密碼子修飾TCR的人外周血單 核細(xì)胞后3天，用HLA-A2402MAGE-A4四聚體-PE (由MBL生產(chǎn)的)和人CD8TRI-C0L0R CONJUGATE(CALTAG Laboratories)對細(xì)胞進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀測量⑶8-陽性和四 聚體陽性細(xì)胞的比率。各進(jìn)行2個(gè)實(shí)驗(yàn)組。圖6顯示MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比率。橫 軸顯示導(dǎo)入的siRNA，縱軸顯示MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比率。如圖6所示，通過導(dǎo)入 針對野生型TCRa和0的雙鏈siRNA，觀察到其基因已被導(dǎo)入人外周血單核細(xì)胞的修飾 抗-MAGE-A4TCR a / 0復(fù)合蛋白的表達(dá)比率增加。
實(shí)施例7密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制備將通過退火SEQ ID Nos. :29和30而制備的雙鏈DNA克隆入pSINsi_hU6載體(由 TAKARA BI0生產(chǎn)的)的BamHI_ClaI位點(diǎn)來制備pSINsi-hU6_TCRA。分開地，將通過退火 SEQ ID Nos. :31和32而制備的雙鏈DNA克隆pBAsi-mU6載體(由TAKARA BIO生產(chǎn)的)的 BamHI-Hindlll 位點(diǎn)來制備 pBAsi-mU6_TCRB。如圖7中所示，用EcoRV切取制備的pBAsi-mU6-TCRB以獲得mU6_TCRB插入物，將 該插入物克隆入pSINsi-hU6-TCRA的Pmel位點(diǎn)以獲得pSINsi-Rm/Fh。用Nhel和Clal消 化制備的pSINsi-Rm/Fh，并且使兩個(gè)末端成平端以獲得Rm/Fh插入物。如圖8中所示，用Mlul消化實(shí)施例4中制備的pMS-aPbl載體，使兩個(gè)末端成平端， 然后將Rm/Fh插入物克隆入其中來制備T3載體。此外，如圖9中所示，用Clal消化實(shí)施例4中制備的pMS_aPbl載體，使兩個(gè)末端 成平端，將Rm/Fh插入物克隆入其中來制備T7載體。然后，如圖10中所示，用Mlul和SacII消化如SEQ ID No. :33所示的人工合成的 基因以獲得TCR-環(huán)-MluI/SacII，將其克隆入實(shí)施例4中制備的pMS-aPbl的MluI-SacII 位點(diǎn)來獲得T15載體。此外，如圖11中所示，用Clal消化pSINsi-hHl載體(由TAKARA BI0生產(chǎn)的)， 使之經(jīng)歷末端平端化，然后用NotI消化來獲得片段，將所述片段克隆入pSINsi-hTO(由 TAKARA BI0 生產(chǎn)的)的 PmeI_NotI 位點(diǎn)來制備 pSINsi_hH/hU。如圖12中所示，用BamHI消化pSINsi_hH/hU以獲得片段，將所述片段克隆入通過 用BamHI消化pSINsi-Rm/Fh而獲得的位點(diǎn)，從而制備pSINsi-RHB/FUA，用Nhel和Clal消 化該pSINsi-RHB/FUA，將其經(jīng)歷末端平端化以獲得HB/UA插入物。如圖13中所示，用Mlul消化實(shí)施例4中制備的pMS-aPbl載體，將其經(jīng)歷末端平 端化，然后將HB/UA插入物克隆入其中來制備載體。如圖14中所示，用NotI消化T15載體，將其經(jīng)歷末端平端化來制備a 1_平端插入 物。分開地，用NotI消化T15載體，用Mlul消化通過載體的自身連接獲得的pMS-環(huán)-Pbl 載體，然后將a 1-平端插入物克隆入末端平端化的位點(diǎn)，從而制備TN5載體。如圖15中所示，用NotI消化實(shí)施例4中制備的pMS-aPbl載體，以產(chǎn)生a INot插 入物。分開地，用NotI消化pMS-aPbl載體，使之經(jīng)歷末端平端化，然后用Clal消化來制備 PGK+ 0 1插入物。此外，用Clal消化pSINsi-hTO-TCRA載體，使之經(jīng)歷末端平端化，然后用 NotI消化來產(chǎn)生hU6-TCRA插入物。將PGK+ ^ 1插入物和hU6_TCRA插入物克隆入pMS-aPbl 的 Notl-Clal 位點(diǎn)來制備 pMS-hURA-Pbl，用 NotI 消化該 pMS_hURA_Pbl，然后將 a INot 插 入物克隆入其中來制備pMS-a-hUTCRA-Pbl。如圖16中所示，用EcoRI和Hindlll消化pSINsi-RHB/FUA，使之經(jīng)歷末端平端化 以獲得hHl-TCRB-平端插入物。用Clal消化pMS_a-hUTCRA-Pbl，使之經(jīng)歷末端平端化，然 后將hHl-TCRB-平端插入物克隆入其中以制備TN9載體和TN11載體。用質(zhì)粒載體pMS-aPbl、T3、T7、T15、TNI、TN5或TN9載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，然 后使用QIAGEN Plasmid Midi試劑盒(由Qiagen生產(chǎn)的)純化質(zhì)粒DNA以提供用于轉(zhuǎn)染 的 DNA。按照產(chǎn)品方案使用Retrovirus Packaging試劑盒Eco (由TAKARABI0生產(chǎn)的)，利用制備的pMS-aPbl、T3、T7、T15、 i、TN5或TN9轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得不同雙嗜性病毒上清 液，用0. 45 y m的過濾器(MilexHV，由Millipore生產(chǎn)的)過濾，利用使用的凝聚胺的方法 感染PG13細(xì)胞(ATCC CRL-10686)，然后回收培養(yǎng)上清液，用0. 45 y m的過濾器進(jìn)行過濾來 獲得MS-aPbl，T3，T7，T15，TN1，TN5或TN9逆轉(zhuǎn)錄病毒溶液。實(shí)施例8使用密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體1進(jìn)行的人外周 血單核細(xì)胞的感染按照標(biāo)準(zhǔn)方法，使用RetroNectin，用實(shí)施例7中制備的T3、T7或T15密碼子修飾 TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒以及作為對照的密碼修飾TCR表達(dá)pMS-aPbl載體感染從 人外周血分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC) 2次來制備已導(dǎo)入密碼子修飾TCR和siRNA的共表 達(dá)的外周血單核細(xì)胞。在第2次病毒感染后3天，收獲細(xì)胞，用QIAGEN RNeasyMini試劑盒 (由Qiagen生產(chǎn)的)進(jìn)行總RNA的提取和DNA酶I處理。使用PrimeScript RT試劑試劑 盒(Perfect Real Time)(由TAKARA BIO生產(chǎn)的)使提取的總RNA經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用 SYBR Premix Ex Taqll (由 TAKARA BIO 生產(chǎn)的)、SEQ ID Nos. 9 和 10 的用于擴(kuò)增野生型 TCR a的引物、SEQ ID Nos. :11和12的用于擴(kuò)增密碼子修飾TCR a的引物、SEQ ID Nos. 13和14的用于擴(kuò)增野生型TCR0的引物和SEQ ID Nos. 15和16的用于擴(kuò)增密碼子修飾 TCR0的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，計(jì)算野生型TCRa、修飾TCRa、野生型TCR0和修飾TCR3基 因的表達(dá)水平的相對值。使用SEQ ID Nos. :34和35的用于擴(kuò)增GAPDH基因的引物進(jìn)行總 RNA量的標(biāo)準(zhǔn)化。通過計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)相對值相對于對照實(shí)驗(yàn)組中野生型TCR a、修飾TCR a、 野生型TCR0和修飾TCR0基因的表達(dá)相對值的比率，可評估野生型TCR基因抑制效應(yīng)和 修飾TCR基因的表達(dá)水平。結(jié)果示于圖17中。在圖中，縱軸顯示在假定無基因?qū)氲年幮?對照的值為100的情況下以相對值表示的野生型TCRa、修飾TCRa、野生型TCR0和修飾 TCR0基因的表達(dá)水平。橫軸顯示導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄病毒。如圖17中所示，通過導(dǎo)入針對野生 型TCRa和日的siRNA，野生型TCRa和^基因的表達(dá)在PBMC中被抑制。與pMS_aPbl相 比較，修飾TCRa和0基因的表達(dá)在T3、T7和T15中較低。實(shí)施例9密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的導(dǎo)入對密碼子修飾 TCR蛋白1的表達(dá)的作用在實(shí)施例8中，在用T3、T7或T15密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病 毒進(jìn)行第2次感染后3天，回收細(xì)胞，按照與實(shí)施例6的方法相同的方法測量CD8-陽性和 四聚體陽性細(xì)胞的比率。圖18顯示MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比率。橫軸顯示導(dǎo)入的逆 轉(zhuǎn)錄病毒，縱軸顯示MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比率。如圖18中所示，通過導(dǎo)入T15密碼 子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其基因已被導(dǎo)入人外周血單核細(xì)胞的修飾 抗-MAGE-A4TCR a / 0復(fù)合蛋白的表達(dá)比率與作為對照的密碼子修飾TCR表達(dá)pMS_aPbl相 比得到提高。如實(shí)施例8中所示，通過插入siRNA表達(dá)單位，雖然與pMS-aPbl相比較密碼 子修飾TCR基因的表達(dá)水平更低，但觀察到由于siRNA在抑制野生型TCR基因的表達(dá)上的 作用而導(dǎo)致的密碼子修飾抗-MAGE-A4TCR a/^復(fù)合蛋白的表達(dá)比率的增加。實(shí)施例10密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對人外周血單核細(xì) 胞2的感染通過使用從人外周血分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC)，如實(shí)施例8中一樣制備已導(dǎo)
16入密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)的外周血單核細(xì)胞。在病毒感染7天后，進(jìn)行總RNA的 提取和DNA酶I處理。按照與實(shí)施例8的方法相同的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，計(jì)算野生型TCR α、 修飾TCRa、野生型TCRβ和修飾TCRβ基因的表達(dá)水平的相對值。通過計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)相對值相對于對照實(shí)驗(yàn)組中野生型TCRα、修飾TCRa、 野生型TCRi3和修飾TCRi3基因的表達(dá)相對值的比率，評估野生型TCR基因沉默效應(yīng)和修 飾TCR基因的表達(dá)水平。結(jié)果示于圖19中。在圖中，縱軸顯示在假定無基因?qū)氲年幮?對照的值為100的情況下以相對值表示的野生型TCRa、修飾TCRa、野生型TCRi^和修飾 TCR^基因的表達(dá)量。橫軸顯示導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄病毒。如圖19中所示，通過表達(dá)針對野生型 TCRa和β的siRNA，野生型TCR α和β基因的表達(dá)在PBMC中被抑制。此外，對抑制野生 型TCR基因的表達(dá)的作用在病毒感染后第7天比在病毒感染后第3天實(shí)施例8的結(jié)果更高。 然而，通過插入針對野生型的siRNA表達(dá)單位，與pMS-aPbl相比較，修飾TCR α和β基因 的表達(dá)更低。實(shí)施例11密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的導(dǎo)入對密碼子修 飾TCR蛋白2的表達(dá)的作用在實(shí)施例10中，在用Τ3、Τ7或Τ15密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒 進(jìn)行第2次感染后7天，回收細(xì)胞，按照與實(shí)施例6的方法相同的方法測量CD8-陽性和四 聚體陽性細(xì)胞的比率。圖20顯示MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比率。橫軸顯示導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn) 錄病毒，縱軸顯示MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比率。如圖20中所示，通過導(dǎo)入T3或T7密 碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其基因已被導(dǎo)入人外周血單核細(xì)胞的修 飾抗-MAGE-A4TCR α/β復(fù)合蛋白的表達(dá)比率與作為對照的密碼子修飾TCR表達(dá)pMS_aPbl 相比得到了提高。如實(shí)施例10中所示，通過插入siRNA表達(dá)單位，雖然密碼子修飾TCR基 因的表達(dá)水平降低，但觀察到由于siRNA抑制野生型TCR基因的表達(dá)的作用而導(dǎo)致的密碼 子修飾抗-MAGE-A4TCR α/β復(fù)合蛋白的表達(dá)比率的增加。實(shí)施例12由于密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體1的導(dǎo)入而導(dǎo) 致的密碼子修飾TCR復(fù)合物的產(chǎn)生抗原特異性細(xì)胞因子的能力在向用PMA和伊屋諾霉素抗原非特異性刺激的通過用MAGE_A4143_151肽脈沖T2A24 細(xì)胞(所述T2A24細(xì)胞是通過將HLA-A2402cDNA基因?qū)隩2細(xì)胞株(ATCC CRL-1992)制 備的)獲得的T2A24(+)或T2A24(_)細(xì)胞(未用所述肽脈沖T2A24細(xì)胞)和實(shí)施例10中 T3、T7、T15或MS-aPb 1導(dǎo)入后3天的細(xì)胞以及實(shí)施例10中T3、T7、T 15或MS-aPbl導(dǎo) 入后3天的細(xì)胞的混合物中加入Breferdin A后，將所得的細(xì)胞在37°C下溫育過夜，通過 使用 IntraPr印(BeckmanCoulter)，用 CD8-FITC 抗體(BD Biosciences)和 IO Test IFN Y -PE (BeckmanCoulter)進(jìn)行⑶8染色和細(xì)胞內(nèi)IFN γ染色，利用流式細(xì)胞儀測量為⑶8 陽性和IFN γ陽性的細(xì)胞的比率。圖21顯示細(xì)胞內(nèi)IFN γ陽性細(xì)胞的比率。橫軸顯示 導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄病毒，縱軸顯示IFN γ陽性細(xì)胞的比率。如圖21中所示，確認(rèn)了通過導(dǎo)入 Τ3、Τ7或Τ15密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，產(chǎn)生MAGE-A4抗原特異 性IFN γ的能力與作為對照的已導(dǎo)入MS-aPbl的細(xì)胞的所述能力大致相同。實(shí)施例13使用密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體3進(jìn)行的人外 周血單核細(xì)胞的感染按照標(biāo)準(zhǔn)方法，使用RetroNectin，用實(shí)施例7中制備的 i、TN5或TN9密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染從人外周血分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC) 2 次，作為對照，用密碼子修飾TCR表達(dá)pMS-aPbl載體進(jìn)行所述感染，從而制備已導(dǎo)入密碼子 修飾TCR和siRNA的共表達(dá)的人外周血單核細(xì)胞。在第2次病毒感染后5天和11天，回收 細(xì)胞，按照與實(shí)施例8的方法相同的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，并且計(jì)算野生型TCRa、修飾TCRa、 野生型TCRii和修飾TCRii基因的表達(dá)水平的相對值。通過計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)相對值相對于對照實(shí)驗(yàn)組中野生型TCRa、修飾TCRa、野生型TCRii和修飾TCRii基因的表達(dá)相對值的比率，評估野生型TCR基因沉默效應(yīng)和修 飾TCR基因的表達(dá)水平。圖22顯示了感染后5天的結(jié)果，圖23顯示了感染后11天的結(jié)果。 在圖中，縱軸顯示在假定導(dǎo)入了 MS-aPbl的細(xì)胞的值為100的情況下以相對值表示的野生 型TCRa、修飾TCRa、野生型TCRii和修飾TCRi^基因的表達(dá)量。橫軸顯示導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄 病毒。如圖22和圖23中所示，通過表達(dá)針對野生型TCR α和β的siRNA，野生型TCR α和 β基因的表達(dá)在PBMC中被抑制。實(shí)施例14密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的導(dǎo)入對密碼子修 飾TCR蛋白3的表達(dá)的作用在實(shí)施例13中，在用Tm、TN5或TN9密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病 毒進(jìn)行第2次感染后4天，回收細(xì)胞，按照與實(shí)施例6的方法相同的方法測量為CD8-陽性 和四聚體陽性的細(xì)胞的比率。圖24顯示病毒感染后4天MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比率。 橫軸顯示導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄病毒，縱軸顯示MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比率。如圖24中所示， 通過導(dǎo)入TN5或TN9密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其基因已被導(dǎo)入 人外周血單核細(xì)胞的修飾抗-MAGE-A4TCRa / β復(fù)合蛋白的表達(dá)比率與作為對照的密碼子 修飾TCR表達(dá)pMS-aPbl相比得到提高。如實(shí)施例13中所示，通過插入siRNA表達(dá)單位，雖 然與作為對照的已導(dǎo)入MS-aPbl的細(xì)胞相比較，密碼子修飾TCR基因的表達(dá)更低，但觀察到 由于siRNA抑制野生型TCR基因的表達(dá)的作用而導(dǎo)致的密碼子修飾抗-MAGE-A4TCRa /β 復(fù)合蛋白的表達(dá)比率的增加。實(shí)施例15由于密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體2的導(dǎo)入而導(dǎo) 致的密碼子修飾TCR復(fù)合物的產(chǎn)生抗原特異性細(xì)胞因子的能力按照與實(shí)施例12的方法相同的方法使用實(shí)施例13中ΤΝ5、ΤΝ9或MS-aPbl導(dǎo)入后 4天的細(xì)胞測量為⑶8-陽性和IFNy陽性的細(xì)胞的比率。圖25顯示IFN γ陽性細(xì)胞的比 率。橫軸顯示導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄病毒，縱軸顯示IFNy陽性細(xì)胞的比率。如圖25中所示，確認(rèn) 了通過導(dǎo)入TN5或TN9密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，產(chǎn)生MAGE-A4 抗原特異性IFN γ的能力與已導(dǎo)入MS-aPbl的細(xì)胞相比大致相同。實(shí)施例16使用密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體4進(jìn)行的人外 周血單核細(xì)胞的感染按照標(biāo)準(zhǔn)方法，使用RetroNectin，用實(shí)施例7中制備的TN5、TN9密碼子修飾TCR 和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒以及作為對照的密碼修飾TCR表達(dá)pMS-aPbl載體感染從人 外周血分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC) 2次來制備已導(dǎo)入密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá) 的外周血單核細(xì)胞。在第2次感染后4天，回收細(xì)胞，已導(dǎo)入TN5、TN9和MS-aPbl的細(xì)胞的每細(xì)胞載體 的平均拷貝數(shù)分別為3. 64、2.21和9. 15個(gè)拷貝/細(xì)胞。此外，按照與實(shí)施例6的方法相同的方法測量為CD8陽性和四聚體陽性的細(xì)胞的比率。圖26顯示病毒感染后4天MAGE-A4四聚 體陽性細(xì)胞的比率。橫軸顯示導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄病毒，縱軸顯示MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞的比 率。如圖26中所示，通過導(dǎo)入TN5或TN9密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體，雖然每細(xì)胞載體的拷貝數(shù)比MS-aPb的更少，但其基因已被導(dǎo)入人外周血單核細(xì)胞的修 飾抗-MAGE-A4TCR α/β復(fù)合蛋白的表達(dá)比率與作為對照的密碼子修飾TCR表達(dá)pMS_aPbl 的相等。
實(shí)施例17使用密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體4進(jìn)行的人外 周血單核細(xì)胞的感染在實(shí)施例16中，通過使用從人外周血分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC)，制備了已導(dǎo) 入密碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)的外周血單核細(xì)胞。在病毒感染后5天，用MAGE-A4 四聚體進(jìn)行染色，并且只有MAGE-A4四聚體陽性細(xì)胞被抗-PE微珠(Miltenyi Biotec)收 集。從收集的細(xì)胞提取總RNA并且進(jìn)行DNA酶I處理。按照與實(shí)施例8的方法相同的方法 進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，計(jì)算野生型TCRa、修飾TCRa、野生型TCRi^和修飾TCRi^基因的表達(dá)水平 的相對值。通過計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)相對值相對于對照實(shí)驗(yàn)組中野生型TCRa、修飾TCRa、 野生型TCRii和修飾TCRii基因的表達(dá)相對值的比率，評估野生型TCR基因抑制效應(yīng)和修 飾TCR基因的表達(dá)水平。結(jié)果示于圖27中。在圖中，縱軸顯示在假定導(dǎo)入了 MS-aPbl的細(xì)胞 的值為100的情況下以相對值表示的野生型TCR α、修飾TCR α、野生型TCR β和修飾TCR β 基因的表達(dá)量。橫軸顯示導(dǎo)入的逆轉(zhuǎn)錄病毒。如圖27中所示，通過表達(dá)針對野生型TCRa 和β的siRNA，野生型TCR α和β基因的表達(dá)在PBMC中被抑制。此外，與pMS_aPbl相比 較在TN5和TN9中，雖然修飾TCRa和β基因的表達(dá)低(由于針對野生型TCRa和β的 siRNA的表達(dá)對內(nèi)源TCR基因的抑制而導(dǎo)致的)，如圖26中所示，但通過導(dǎo)入ΤΝ5或ΤΝ9密 碼子修飾TCR和siRNA的共表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其基因已被導(dǎo)入人外周血單核細(xì)胞的修 飾抗-MAGE-A4TCR α/β復(fù)合蛋白的表達(dá)比率與作為對照的密碼子修飾TCR表達(dá)pMS_aPbl 的相等。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，提供了表達(dá)用于醫(yī)療領(lǐng)域的寡聚蛋白的細(xì)胞，特別地T細(xì)胞以及產(chǎn) 生所述T細(xì)胞的方法。序列表自定義文本SEQ ID NO 1 密碼子修飾抗-MAGE A4TCR α 鏈。SEQ ID NO 2 密碼子修飾抗-MAGE A4TCR β 鏈。SEQ ID NO 3 用于siRNA_A的合成的嵌合體寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核 苷酸_其他核苷酸是脫氧核糖核苷酸。SEQ ID NO 4 用于siRNA_A的合成的嵌合體寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核 苷酸_其他核苷酸是脫氧核糖核苷酸。SEQ ID NO 5 用于siRNA_B的合成的嵌合體寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核 苷酸_其他核苷酸是脫氧核糖核苷酸。SEQ ID NO 6 用于siRNA_B的合成的嵌合體寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核 苷酸_其他核苷酸是脫氧核糖核苷酸。
SEQ ID NO 7 用于siRNA_C的合成的嵌合體寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核 苷酸_其他核苷酸是脫氧核糖核苷酸。SEQ ID NO 8 用于siRNA_C的合成的嵌合體寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核 苷酸_其他核苷酸是脫氧核糖核苷酸。SEQ ID NO 9 用于野生型TCRa鏈的合成的寡核苷酸引物。SEQ ID NO 10 用于野生型TCRa鏈的合成的寡核苷酸引物。SEQ ID NO=Il 用于密碼子修飾TCRa鏈的合成的寡核苷酸引物。SEQ ID NO 12 用于密碼子修飾TCRa鏈的合成的寡核苷酸引物。SEQ ID NO 13 用于野生型TCRP鏈的合成的寡核苷酸引物。SEQ ID NO 14 用于野生型TCRP鏈的合成的寡核苷酸引物。SEQ ID NO 15 用于密碼子修飾TCRi^鏈的合成的寡核苷酸引物。SEQ ID NO 16 用于密碼子修飾TCRi^鏈的合成的寡核苷酸引物。SEQ ID NO 17 用于β -肌動(dòng)蛋白的合成的寡核苷酸引物。SEQ ID NO 18 用于β -肌動(dòng)蛋白的合成的寡核苷酸引物。SEQ ID NO 19 =TCRa 鏈的一部分。SEQ ID NO :20 密碼子修飾TCRa鏈的一部分。SEQ ID NO 21 =TCRa 鏈的一部分。SEQ ID NO 22 =TCR^ 鏈的一部分。SEQ ID NO :23 密碼子修飾TCRβ鏈的一部分。SEQ ID NO 24 =TCR^ 鏈的一部分。SEQ ID NO 25 合成的寡核苷酸引物pPGK5。SEQ ID NO 26 合成的寡核苷酸引物pPGK3。SEQ ID NO 27 合成的寡核苷酸引物3MSCV5。SEQ ID NO 28 合成的寡核苷酸引物3MSCV3。SEQ ID NO 29 用于 pSINsi-hU6_TCRA 的合成的寡核苷酸。SEQ ID NO 30 用于 pSINsi-hU6_TCRA 的合成的寡核苷酸。SEQ ID NO 31 用于 pBAsi-mU6_TCRB 的合成的寡核苷酸。SEQ ID NO 32 用于 pBAsi-mU6_TCRB 的合成的寡核苷酸。SEQ ID NO 33 用于TCR-環(huán)-MluI/SacII的合成的寡核苷酸。SEQ ID NO 34 用于GAPDH基因的擴(kuò)增的寡核苷酸引物。SEQ ID NO 35 用于GAPDH基因的擴(kuò)增的寡核苷酸引物。
權(quán)利要求
表達(dá)非天然寡聚蛋白的細(xì)胞，其包含已導(dǎo)入的基因，所述基因編碼相應(yīng)于至少一種組成天然寡聚蛋白的內(nèi)源多肽的組成非天然寡聚蛋白的外源多肽，其中所述內(nèi)源多肽的表達(dá)被抑制。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述寡聚蛋白由可變區(qū)和恒定區(qū)組成。
3.權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述寡聚蛋白是抗原識(shí)別受體。
4.權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中所述抗原識(shí)別受體是T細(xì)胞受體(TCR)。
5.權(quán)利要求1至4的任一項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述內(nèi)源多肽的表達(dá)被RNA干擾抑制。
6.權(quán)利要求5的細(xì)胞，其中所述寡聚蛋白由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，并且組成所述寡聚 蛋白的內(nèi)源多肽的表達(dá)被靶向相應(yīng)于所述多肽的恒定區(qū)的mRNA序列的RNA干擾抑制。
7.權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中所述外源多肽具有與內(nèi)源多肽的恒定區(qū)的氨基酸序列有相 同的氨基酸序列的恒定區(qū)，并且所述內(nèi)源多肽的表達(dá)通過產(chǎn)生與所述內(nèi)源多肽的mRNA的 核苷酸序列不同的外源多肽的mRNA的核苷酸序列來抑制。
8.用于產(chǎn)生表達(dá)非天然寡聚蛋白的細(xì)胞的方法，該方法包括進(jìn)行下列步驟(a)將基因?qū)肽軌虮磉_(dá)天然寡聚蛋白的細(xì)胞的步驟，所述基因編碼相應(yīng)于至少一種 組成天然寡聚蛋白的內(nèi)源多肽的組成非天然寡聚蛋白的外源多肽，和(b)抑制所述內(nèi)源多肽的表達(dá)的步驟。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述寡聚蛋白由可變區(qū)和恒定區(qū)組成。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述寡聚蛋白是抗原識(shí)別受體。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述抗原識(shí)別受體是TCR。
12.權(quán)利要求8至11的任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)源多肽的表達(dá)被RNA干擾抑制。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述寡聚蛋白由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，并且組成所述寡 聚蛋白的內(nèi)源多肽的表達(dá)被靶向相應(yīng)于所述多肽的恒定區(qū)的mRNA序列的RNA干擾抑制。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述外源多肽具有與內(nèi)源多肽的恒定區(qū)的氨基酸 序列有相同的氨基酸序列的恒定區(qū)，并且所述內(nèi)源多肽的表達(dá)通過產(chǎn)生與所述內(nèi)源多肽的 mRNA的核苷酸序列不同的外源多肽的mRNA的核苷酸序列來抑制。
15.用于形成非天然寡聚蛋白的方法，該方法包括進(jìn)行下列步驟(a)將基因?qū)肽軌虮磉_(dá)天然寡聚蛋白的細(xì)胞的步驟，其中所述基因編碼相應(yīng)于至少 一種組成天然寡聚蛋白的內(nèi)源多肽的組成非天然寡聚蛋白的外源多肽，和(b)抑制所述內(nèi)源多肽的表達(dá)的步驟。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述寡聚蛋白由可變區(qū)和恒定區(qū)組成。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述寡聚蛋白是抗原識(shí)別受體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述抗原識(shí)別受體是TCR。
19.權(quán)利要求15至18的任一項(xiàng)的方法，其中所述內(nèi)源多肽的表達(dá)被RNA干擾抑制。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述寡聚蛋白由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，并且組成所述寡 聚蛋白的內(nèi)源多肽的表達(dá)被靶向相應(yīng)于所述多肽的恒定區(qū)的mRNA序列的RNA干擾抑制。
21.權(quán)利要求19或20的方法，其中所述外源多肽具有與內(nèi)源多肽的恒定區(qū)的氨基酸 序列有相同的氨基酸序列的恒定區(qū)，并且所述內(nèi)源多肽的表達(dá)通過產(chǎn)生與所述內(nèi)源多肽的 mRNA的核苷酸序列不同的外源多肽的mRNA的核苷酸序列來抑制。
全文摘要
公開了可表達(dá)非天然寡聚蛋白的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中已導(dǎo)入了編碼相應(yīng)于至少一種組成天然寡聚蛋白的內(nèi)源多肽的外源多肽的基因，并且其中所述內(nèi)源多肽的表達(dá)被抑制。
文檔編號C12N5/10GK101815785SQ200880102998
公開日2010年8月25日 申請日期2008年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月11日
發(fā)明者住岡理早, 岡本幸子, 加藤郁之進(jìn), 北川正成, 峰野純一, 珠玖洋 申請人:寶生物工程株式會(huì)社;國立大學(xué)法人三重大學(xué)