專利名稱：使用雙特異性寡核苷酸的方法及所述雙特異性寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多種使用雙特異性寡核苷酸的多種方法及所述雙特異 性寡核苷酸。更具體而言，本發(fā)明涉及多種使用雙特異性寡核苷酸的 通過(guò)模板依賴性延伸反應(yīng)的方法及所述雙特異性寡核苷酸。
背景技術(shù)：
核酸擴(kuò)增是分子生物學(xué)中多種方法的關(guān)鍵方法，從而已提出了多
種擴(kuò)增方法。例如，Miller, H. I.等人(WO 89/06700)基于啟動(dòng)子/引物序 列與目標(biāo)單鏈DNA ("ssDNA")雜交，然后轉(zhuǎn)錄該序列的多個(gè)RNA拷貝 而擴(kuò)增核酸序列。其它已知的核酸擴(kuò)增方法包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增體系 (Kwoh, D.等人,Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 86:1173(1989);和Gingeras T.R.等人，WO 88/10315)。
用于核酸擴(kuò)增的最主要的方法已知為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(下文稱為 "PCR"),其基于如下重復(fù)循環(huán)雙鏈DNA的變性，然后寡核苷酸引物 與DNA模板退火，且通過(guò)DNA聚合酶引物延伸(Mullis等人，美國(guó)專 利號(hào)4,683,195, 4,683,202和4,800,159; Saiki等人，(1985) Science 230, 1350-1354)。設(shè)計(jì)PCR中使用的寡核普酸引物使其與DNA模板的互補(bǔ) 鏈退火。引物通過(guò)DNA聚合酶延伸， 一條引物由此產(chǎn)生的產(chǎn)物在后續(xù) 反應(yīng)中可以用作另一條引物的模板鏈。PCR擴(kuò)增法導(dǎo)致其長(zhǎng)度由寡核 香酸引物的5'端限制的不連續(xù)DNA片段的指數(shù)式增加。
核酸擴(kuò)增，尤其是PCR擴(kuò)增的成功取決于引物只與其目標(biāo)(而不與 非目標(biāo))序列退火的特異性，因此，使這種分子相互作用最優(yōu)化很重要。 引物是否可以只與其完全互補(bǔ)序列退火或還與具有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配的 序列退火關(guān)鍵取決于退火溫度。通常，退火溫度越高越會(huì)導(dǎo)致引物與 其優(yōu)選的配對(duì)模板之間的更特異性退火，從而依次增加只擴(kuò)增目標(biāo)序 列的可能性。另一方面，較低的退火溫度會(huì)容許模板與引物之間更多 的錯(cuò)配。鑒于這種現(xiàn)象，調(diào)整退火溫度可以改變模板與引物配對(duì)的特 異性。例如，如果沒(méi)有產(chǎn)物，該溫度對(duì)于退火會(huì)太高。如果產(chǎn)生幾種 大小不同的產(chǎn)物且其中只有一條引物存在，其說(shuō)明單一引物與模板的 多個(gè)區(qū)域退火。在這種情況下應(yīng)該提高退火溫度。
對(duì)于引物退火特異性，除了退火溫度，還應(yīng)考慮幾個(gè)"引物研究
參數(shù)"，如引物長(zhǎng)度、GC含量和PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度。滿足上述全部參數(shù)的 引物會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)DNA擴(kuò)增過(guò)程中引物退火特異性的顯著提高，從而解 決由試驗(yàn)中使用的引物產(chǎn)生的背景和非特異性產(chǎn)物的問(wèn)題。通常，設(shè) 計(jì)較好的引物可以有助于避免非特異性退火和背景，以及在RNA-PCR 中區(qū)分cDNA或基因組模板。
已開(kāi)發(fā)了多種方法以提高引物退火特異性，并因此完成所需產(chǎn)物 的擴(kuò)增。例子為遞減PCR(Don等人，(1991) Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res.: 19, 4008)、熱啟動(dòng)PCR(DAquila等人，(1991) Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating. Nucleic Acids Res., 19, 3749)、巢式PCR(Mullis和Faloona， (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350)和力口強(qiáng)PCR(Ruano等人，(1989) Biphasic amplification of very
dilute DNA samples via booster PCR. Nucleic Acids Res. 17， 540)。 其它 選擇性方法還已經(jīng)報(bào)道多種'增強(qiáng)子，化合物可以提高PCR的特異性。 所述增強(qiáng)子化合物包括提高反應(yīng)的有效退火溫度的化學(xué)物、DNA結(jié)合 蛋白和市售試劑。然而，不存在會(huì)確保每個(gè)PCR成功的'魔力，添加 劑，在如退火溫度的不同條件下試驗(yàn)不同的添加劑十分煩瑣。雖然這 些方法已有助于在一些情況中改進(jìn)引物退火特異性，但是其不能從根 本上解決由PCR擴(kuò)增中使用的引物引起的問(wèn)題，如非特異性產(chǎn)物和高 背景。
基于PCR的技術(shù)已經(jīng)被廣泛使用，不僅用于目標(biāo)DNA序列的擴(kuò) 增，而且還用于生物和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的科學(xué)應(yīng)用或方法，如逆轉(zhuǎn)錄 酶PCR(RT-PCR)、差異顯示PCR (DD-PCR)、通過(guò)PCR的已知或未知 基因的克隆、cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)、隨機(jī)引物PCR (AP-PCR)、 多重PCR、 SNP基因分型和基于PCR的遺傳分析(McPherson和Moller, (2000) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, NY)。
如上所述，雖然已連續(xù)向各方法中引入改進(jìn)的方法，但是涉及核 酸擴(kuò)增，特別是PCR擴(kuò)增的全部這些方法和技術(shù)不能完全避免由各方 法中使用的引物的非特異性所引起的限制和問(wèn)題，如假陽(yáng)性、較差的 重復(fù)性、高背景。因此，仍需要可以產(chǎn)生真實(shí)的擴(kuò)增結(jié)果的用于改進(jìn) 退火特異性的新引物和方法。
同時(shí)，DNA雜交是分子生物學(xué)中的一種基本方法，其受離子強(qiáng)度、 堿基組成、核酸變?yōu)榈钠蔚拈L(zhǎng)度、錯(cuò)配的程度和變性劑的存在影響。 基于DNA雜交的技術(shù)將在特定核酸序列分析中成為一種十分有用的 工具，且在臨床:^斷、遺傳學(xué)研究和法醫(yī)學(xué)試驗(yàn)分析中明顯很重要。
例如，Wallace和同事們提出精細(xì)至一個(gè)堿基變化的序列差異足以能夠 辨認(rèn)短的(例如，14-mer)低聚物，且證明了其如何可以應(yīng)用在P-珠蛋白 基因的定點(diǎn)突變的分子分析中(Wallace, B.R.,等人，(1981) The use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes. Hybridization of oligonucleotides of mixed sequence to rabbit P畫(huà)globin DNA. Nucleic Acids Res. 9, 879-894;以及Conner, B丄，等人.(1983) Detection of sickle cell p畫(huà) globin allele by hybridization with synthetic oligonucleotides. Proc. Natl Acad. Sci. USA 80， 278-282)。
雖然寡核苷酸雜交的作用能準(zhǔn)確地鑒定互補(bǔ)鏈，但是研究人員仍 受到限制。包含寡核苷酸的雜交體的穩(wěn)定性比長(zhǎng)核苷酸的雜交體低很 多。這反映于較低的解鏈溫度。雜交體的不穩(wěn)定性是在設(shè)計(jì)寡核苷酸 雜交時(shí)需要考慮的最重要的因素之一。完全配對(duì)的互補(bǔ)與只有一個(gè)堿 基錯(cuò)配的互補(bǔ)之間的穩(wěn)定性差異可以十分小，在其Tms (雙鏈解鏈溫度) 對(duì)應(yīng)于小至0.5。C的差異。目的低聚物越短(在更復(fù)雜的混合物中進(jìn)行互 補(bǔ)鏈的鑒定)，單個(gè)堿基錯(cuò)配對(duì)總的雙鏈穩(wěn)定性的影響越強(qiáng)。然而，使 用這種短的寡核苷酸的缺點(diǎn)在于甚至對(duì)完全互補(bǔ)序列其雜交較弱，，因 此必須在降低嚴(yán)格條件下使用，從而導(dǎo)致雜交特異性嚴(yán)重降低。
已進(jìn)行許多努力以提高寡核苷酸雜交的特異性。已經(jīng)提出了一種 化學(xué)修飾DNA的堿基以高特異性雜交的方法(Azhikina等人，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci, USA，卯11460-11462)以及其中在雜交后于低溫 下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間漂洗以提高區(qū)分錯(cuò)配的能力的方法(Drmanac等人，(1990) DNAand Cell Biology, 9:527-534)。近來(lái)，已提出了通過(guò)人為錯(cuò)配在DNA 雜交中提高單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的分辨率的另一種方法(Guo等人， (1997) Nature Biotechnology, 15: 331-5)。另夕卜，包括美國(guó)專利號(hào) 6,077,668、 6,329,144、 6,140,054、 6,350,580、 6,309,824、 6,342,355和 6,268,128的多個(gè)美國(guó)專利公開(kāi)了用于雜交的探針及其應(yīng)用。雖然已連 續(xù)向各方法中引入改進(jìn)的方法，但是涉及寡核苷酸雜交的全部這些方 法和技術(shù)不能完全避免由寡核苷酸雜交的非特異性所引起的限制和問(wèn) 題。
這里仍存在人為因素，如點(diǎn)樣和寡核苷酸在基底上的固定以及最
結(jié)果的影響更容易由高流通量的篩選法的結(jié)果引起。這種點(diǎn)樣和雜交 的固有人為因素是在基于寡核苷酸的DNA微陣列中存在的主要缺點(diǎn)。
此外，具有提高的速度、靈敏度和流通量的DNA序列分析技術(shù)的 發(fā)展對(duì)于研究生物系統(tǒng)是很重要的。超過(guò)二十年以前最初開(kāi)發(fā)的常規(guī) DNA測(cè)序技術(shù)(Sanger等人.(1977) Proc. Natl. Acad. ScL, 74:5463-5467) 對(duì)于未來(lái)的應(yīng)用在流通量和成本方面受到限制。因此，已提出了幾種 新的纟支術(shù)。三種具有4交大前景的方法為通過(guò)雜交測(cè)序(Brain和Smith, (1988) J. Theor. Biol" 135:303-307); Drmanac等人,(1989) Genomics, 4:114-128);以及Southern, E.M. (1989) Patent WO/10977)、基于連接和切 割的平行信號(hào)測(cè)序(Brenner等人，(2000) Proc. Natl. Acad. ScL， 97:1665-1670)和焦磷酸測(cè)序(1101^經(jīng)1^等人，(1996) Anal. Biochem" 242:84-89;以及(1998) Science 281:363-365)。對(duì)于全部上述技術(shù)，測(cè) 序反應(yīng)的成功完全取決于目標(biāo)核酸的測(cè)序引物的雜交特異性。考慮到 測(cè)序引物的雜交特異性，目前的方法受到進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)的模板核酸長(zhǎng) 度的限制。通常，使用長(zhǎng)度優(yōu)選小于幾百個(gè)堿基對(duì)的模板核酸進(jìn)行測(cè) 序反應(yīng)，從而使測(cè)序引物的特異性雜交達(dá)到特定程度。
然而，為了更先進(jìn)的研究，具有提高的速度、靈敏度和流通量的 DNA測(cè)序反應(yīng)不應(yīng)該受到模板核酸的阻礙。鑒于此，如果測(cè)序引物與 目標(biāo)核酸高特異性地雜交，那么可以直接測(cè)序來(lái)自 一組模板核酸的目 標(biāo)核酸。
整個(gè)申請(qǐng)中參考多個(gè)專利和出版物，且引文列于括號(hào)中。為了更 充分地描述本發(fā)明和本發(fā)明所述技術(shù)領(lǐng)域的情況，本發(fā)明中將這些專 利和出版物的內(nèi)容全部引入本申請(qǐng)中作為參考。

發(fā)明內(nèi)容
為了消除所述用作引物或探針的常規(guī)寡核苦酸以及涉及核酸雜交 的多種方法的問(wèn)題和缺陷，本發(fā)明人已開(kāi)發(fā)了能使模板依賴性反應(yīng)以 更高特異性進(jìn)行的雙特異性寡核苷酸，且發(fā)現(xiàn)其對(duì)涉及寡核苷酸雜交 或退火的多種方法的優(yōu)異適用性。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用雙特異性寡核苷酸通過(guò) 模板依賴性延伸反應(yīng)來(lái)合成核酸分子的方法。
本發(fā)明的另 一個(gè)目的是提供一種由DNA或核酸混合物選擇性擴(kuò) 增目標(biāo)核酸序列的方法。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種在同 一反應(yīng)中使用兩對(duì)或更多對(duì) 引物同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或更多個(gè)目標(biāo)核苷酸序列的方法。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種由DNA或核酸混合物測(cè)序核酸 分子的方法。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種通過(guò)模板依賴性延伸反應(yīng)來(lái)檢測(cè) 具有遺傳多樣性的核酸分子的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種通過(guò)使用固定有雙特異性寡核苷 酸的微陣列來(lái)檢測(cè)核酸樣品中的目標(biāo)核苦酸序列的方法。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于通過(guò)模板依賴性延伸反應(yīng)來(lái) 合成核酸分子的雙特異性寡核苷酸。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于使寡核苷酸的退火特異性通 過(guò)寡核苷酸的結(jié)構(gòu)而^t雙重限定的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種用于改進(jìn)寡核苷酸的退火特異性 的方法。
結(jié)合附屬權(quán)利要求和附圖，通過(guò)下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它 目的和優(yōu)點(diǎn)將變得更加顯而易見(jiàn)。


圖1A和1B示意性地表示了本發(fā)明的雙特異性(DS)寡核苷酸在模 板依賴性延伸反應(yīng)中的原理。圖1A示出DS寡核苷酸在較高的嚴(yán)格條 件下的高雜交特異性。圖1B表示DS寡核苷酸的錯(cuò)配容許性。
圖2示出使用本發(fā)明的DS寡核苷酸引物選4奪性擴(kuò)增雙鏈DNA的 目標(biāo)核酸的圖示。
圖3示出使用本發(fā)明的DS寡核苷酸引物選擇性擴(kuò)增mRNA的目 標(biāo)核酸的圖示。
圖4示出在寡核苷酸微陣列上使用雙特異性寡核苷酸的目標(biāo)核酸 的選擇性鑒定中的模板依賴性延伸反應(yīng)的圖示。
圖5為示出使用常規(guī)引物對(duì)(IL-lb-5'-0和IL-lb-3'-0，泳道1; IL-19-5'-0和IL-19-3'-0，泳道3)和雙特異性寡核苷酸(IL-lb-5'和IL-lb-3': 泳道2; IL-19-5'和IL-19-3',泳道4)PCR擴(kuò)增細(xì)胞因子家族基因IL-1(3 和IL-19的結(jié)果的瓊脂4唐凝膠電泳照片。M為由Forever 100-bp Ladder Personalizer (視基因公司，韓國(guó)首爾)形成的100-bp大小的標(biāo)準(zhǔn)物 (marker)。
圖6A為表示DEG 10基因的3'-RACE (cDNA末端快速擴(kuò)增)結(jié)果 的瓊脂糖凝膠電泳照片，其說(shuō)明雙特異性寡核苦酸的PCR特異性。泳 道1表示具有完全配對(duì)序列的引物，泳道2 4表示在其3'-低Tm特異性 部分分別具有3、 2和1個(gè)石威基錯(cuò)配的引物，以及泳道5~7表示在其5'-高Tm特異性部分分別具有5、3和2個(gè)堿基錯(cuò)配的引物。M為由Forever 100-bp Ladder Personalizer生產(chǎn)的100-bp大小的標(biāo)準(zhǔn)物。
圖6B為示出DEG 10基因的3'-RACE結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳照 片，其說(shuō)明PCR中雙特異性寡核苷酸的錯(cuò)配容許性。泳道l表示具有 完全配對(duì)序列的引物，泳道2 4表示在其3'-j氐Tm特異性部分分別具有 3、 2和1個(gè)堿基錯(cuò)配的引物，以及泳道5 7表示在其5'-高Tm特異性 部分分別具有5、 3和2個(gè)堿基錯(cuò)配的引物。M為由Forever 100-bp Ladder Personalizer生產(chǎn)的100-bp大小的標(biāo)準(zhǔn)物。
圖7A表示用于小鼠胎盤(pán)特異性同源框家族基因尸&y/和ftx2的 3'-RACE的5'引物。Psxl-5'-40和Psx2-5'-40為常規(guī)引物，而Psxl-5'-41 和Psx2-5'-41為根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物。
圖7B為示出/te^和/fe^的3'-RACE結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳照片。 泳道1, -使用雙特異性寡核苷酸引物Psxl-5'-41的尸&y/的3'-RACE;泳
道2， 4吏用雙特異性寡核苷酸引物Psx2-5'-41的尸&y2的3'-RACE;泳 道3，使用常規(guī)引物Psxl-5'-40的ftx/的3'-RACE;以及泳道4，使用 常規(guī)引物Psx2-5'-40的尸&y2的3'-RACE。M為由Forever 100-bp Ladder Personalizer生產(chǎn)的100-bp大小的標(biāo)準(zhǔn)物。
圖8示出使用雙特異性寡核苷酸引物Psxl-5'-41(用于尸^/)和 Psx2-5'-41(用于/^x )作為測(cè)序引物由小鼠胎盤(pán)cDNA文庫(kù)直接循環(huán)測(cè) 序尸議/和尸m2基因的結(jié)果。
圖9示出使用9對(duì)細(xì)胞因子家族基因特異性雙特異性引物的多重 PCR的結(jié)果。泳道l， 9個(gè)細(xì)胞因子基因的多重PCR;泳道2， IL-3(200 bp)的單重PCR;泳道3, IL-15(250bp)的單重PCR;泳道4， IL-18(300 bp)的單重PCR;泳道5， IL-25(350 bp)的單重PCR;泳道6， IL-2(400 bp)的單重PCR;泳道7, IL-6(450bp)的單重PCR;泳道8, IL-19(500 bp)的單重PCR;泳道9， IL-l卩(550bp)的單重PCR;泳道10, IL-10(600 bp)的單重PCR。 M為由Forever 100-bp Ladder Personalizer生產(chǎn)的 100-bp大小的標(biāo)準(zhǔn)物。
圖10示出通過(guò)使用雙特異性寡核苦酸引物PCR擴(kuò)增人偏肺病毒 (hMPV)的融合糖蛋白(F)基因的結(jié)果。泳道l，使用引物對(duì)hMPV5'-585 和hMPV 3'-698的目標(biāo)PCR;泳道2,使用引物對(duì)hMPV5'-585和hMPV 3'-1007的目標(biāo)PCR;泳道3,使用人p-肌動(dòng)蛋白引物的目標(biāo)PCR;泳 道4,無(wú)才莫^反的目標(biāo)PCR;以及泳道5，無(wú)才莫4反的目標(biāo)PCR。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的主要目的在于(a)使用雙特異性寡核苷酸的多種方法以及 (b)所述雙特異性寡核苷酸。本發(fā)明的雙特異性寡核苷酸(下文稱為"DS oligo")使引物或探針與其目標(biāo)序列以提高的特異性進(jìn)行退火，從而可 以顯著提高核酸擴(kuò)增(尤其是PCR)和雜交反應(yīng)的特異性。
雙特異性寡核苷酸(DS Oligo)
在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，提供一種用于通過(guò)模板依賴性延伸 反應(yīng)合成核酸分子的雙特異性寡核苷酸，其由以下通式表示
5，-Xp-Yq-Zr-3，
其中，Xp表示5'-高Tm特異性部分，該部分具有與模板核酸的一
個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列；Yq表示包含至少兩個(gè) 通用堿基的間隔部分；Zr表示3'-低Tm特異性部分，該部分具有與模板 核酸的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列；p、 q和r表 示核苷酸的數(shù)目；以及X、 Y和Z為脫氧核苷酸或核苷酸；5'-高Tm特 異性部分的Tm高于3'-低Tm特異性部分的Tm,且在三個(gè)部分中間隔部 分具有最低的Tm;間隔部分在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性 部分與模板核酸退火的條件下形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)，5'-高Tm特
異性部分從而根據(jù)與模板核酸的退火特異性而與3'-低Tm特異性部分
分開(kāi)，因此寡核苷酸的退火特異性由5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特
異性部分雙重限定，從而提高了寡核苷酸的整體退火特異性。
本發(fā)明中使用的關(guān)于本發(fā)明的DS寡核苷酸(下文稱為"DS oligo") 的術(shù)語(yǔ)"雙特異性"意在描述其主要特征其與目標(biāo)序列的退火特異 性受其分開(kāi)的兩個(gè)部分，即5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分 的雙重限定。通常，引物或探針的退火特異性受其整個(gè)連續(xù)序列控制。 與此相反，DS oligo的退火特異性受其由間隔部分分開(kāi)的兩個(gè)部分(5'-高 Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分)的雙重限定，其中這三個(gè)部分
位于一個(gè)寡核苷酸序列上。這種雙重特異性使DS oligo用作呈現(xiàn)更高 特異性的引物和探針，所以本發(fā)明是新的，對(duì)現(xiàn)有技術(shù)是非顯而易見(jiàn) 的。
同時(shí)，如WO 03/050303中所公開(kāi)，本發(fā)明人已開(kāi)發(fā)了 ACP(退火 控制引物)以提高退火特異性，本發(fā)明中引入其技術(shù)內(nèi)容作為參考。本 發(fā)明的DSoligo與ACP的顯著區(qū)別在于如下(i)DS oligo具有兩個(gè)與 目標(biāo)序列雜交的特異性部分，而ACP具有一個(gè)特異性部分；(ii) DS oligo 中的三個(gè)部分根據(jù)Tm而被明顯區(qū)分開(kāi)，而ACP中的部分沒(méi)有；(iii)只 有5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分發(fā)生退火時(shí)，DS引物才 延伸以合成與模板互補(bǔ)的核酸分子，而ACP即使在3'-端部分發(fā)生退火 時(shí)也延伸；以及(iv)因此DS oligo的退火或雜交特異性受兩個(gè)分開(kāi)的部 分，即5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分的雙重限定，而ACP 的退火和雜交特異性只受3'-端部分控制。因此，可以理解，DS oligo 與目標(biāo)序列的退火或雜交特異性比ACP的退火和雜交特異性更高，說(shuō) 明DSoligo是新的，對(duì)ACP是非顯而易見(jiàn)的。
DS oligo的主要特征為在一個(gè)寡核苷酸分子中含有三個(gè)具有明顯 特征的不同部分5'-高Tm特異性部分、3'-低Tm特異性部分和間隔部 分。
DS oligo適用于涉及模板依賴性延伸反應(yīng)的多種方法和分析。本發(fā) 明中使用的術(shù)語(yǔ)"模板依賴性延伸反應(yīng)"指通過(guò)向其末端摻入連續(xù)核 苷酸以延伸與目標(biāo)序列雜交的寡核苷酸分子的反應(yīng)，其中延伸的序列 受互補(bǔ)的模板序列限定。
圖lA中示出了控制DSoligo雜交(退火)特異性的原理的圖示。參 考圖1A,將更詳細(xì)地描述DSoligo。
只有DS oligo的5'-高Tm特異性部分與4莫板退火時(shí)，其不能用作模 板依賴性延伸的引發(fā)位點(diǎn)，從而不發(fā)生延伸。
雖然DS oligo的5'-高Tm特異性部分與非目標(biāo)序列退火，但是具有
較短序列的3'-低Tm特異性部分不可能與非目標(biāo)序列退火。其原因在于 5'-高Tm特異性部分與3'-低Tm特異性部分在退火事件中由間隔部分分 開(kāi)。換句話說(shuō)，3'-低Tm特異性部分以相對(duì)獨(dú)立于5'-高Tm特異性部分 的方式巻入退火事件，并且3'-低Tm特異性部分的退火受5'-高Tm特異 性部分的退火的影響較小。與此相關(guān)，3'-低Tm特異性部分與非目標(biāo)序
列的退火的可能性變得更低。
在只有3'-低Tm特異性部分具有與非目標(biāo)位點(diǎn)互補(bǔ)的序列時(shí)，在特 定較高的嚴(yán)格條件下，例如5'-高Tm特異性部分退火的嚴(yán)格條件下也不
會(huì)發(fā)生退火。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，有利于使用DS oligo在退火溫度 比3'-低Tm特異性部分的Tm高的嚴(yán)格條件下進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)。
5'-高Tm特異性部分和3'-低L特異性部分具有與模板基本上互補(bǔ)
的序列時(shí)，DSoligo可以與模板退火，因此成功地進(jìn)行延伸。
不希望受到理論的束縛，應(yīng)該相信，間隔部分使3'-低Tm特異性部
分對(duì)退火條件(例如，溫度和序列互補(bǔ)性)更敏感。與此相關(guān)，3'-低Tm
特異性部分與非目標(biāo)序列之間非特異性雜交的概率在特定退火(或嚴(yán)格)
條件下變得更低。3'-低Tm特異性部分以及5'-高Tm特異性部分與其目
標(biāo)序列退火時(shí)，3'-低Tm特異性部分的3'端更易產(chǎn)生DNA聚合酶可以
延伸的位點(diǎn)。
本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸，，指能夠與無(wú)論是天然存在的還 是合成制備的目標(biāo)核苷酸序列特異性雜交的天然的或修飾的單體或連 接的線性低聚物，其包括脫氧核苦酸、核苦酸等。寡核香酸優(yōu)選為在 雜交中效率最大化的單鏈。寡核苷酸優(yōu)選為寡脫氧核苷酸。本發(fā)明的
寡核苷酸可以包括天然存在的dNMP(例如，dAMP、 dGM、 dCMP和 dTMP)、核苷酸類似物或核香酸衍生物。寡核苷酸還可以包括核香酸。 例如，本發(fā)明的寡核苷酸可以包括如肽核酸(PNA) (M. Egholm等人， Nature, 365:566-568(1993))、硫代磷酸酯DNA、 二硫代磷酸酯DNA、 氨基磷酸酯DNA、酰胺連接的DNA、 MMI-連接的DNA、 2'-0-曱基 RNA、 a-DNA和甲基磷酸酯DNA的具有骨架修飾的核苦酸；如2'-0-曱基RNA、 2'-氟脂A、 2'-氨基RNA、 2'-0-烷基DNA、 2'-0-烯丙基 DNA、 2-0-炔基DNA、己糖DNA、吡喃基(pyranosyl)RNA和失水己 糖醇DNA的具有糖修飾的核苷酸；以及具有如C-5取代的嘧啶(取代 基包括氟-、溴-、氯-、碘-、曱基-、乙基-、乙烯基-、曱?；?、乙炔基 -、丙炔基-、炔基-、噻唑基-、咪唑基-、吡啶基-)、含有C-7取代基(取 代基包括氟-、溴-、氯-、碘-、曱基-、乙基-、乙烯基-、曱酰基-、炔基 -、鏈烯基-、噻唑基-、咪唑基-、吡啶基-)的7-脫氮。票呤、肌苷和二氨 基噪呤的堿基修飾的核苷酸。
本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"引物"指寡核苷酸，其能夠在置于其中引 起與核酸鏈(模板)互補(bǔ)的51物延伸產(chǎn)物的合成的條件下時(shí)，即在核苷酸 和如DNA聚合酶的用于聚合的試劑的存在下，在合適的溫度和pH下 能用作合成的起始點(diǎn)。引物優(yōu)選為在擴(kuò)增中效率最大化的單鏈。引物 優(yōu)選為寡脫氧核苷酸。本發(fā)明的引物可以包含天然存在的dNMP(例如， dAMP、 dGM、 dCMP和dTMP)、修飾的核香酸或非天然核苦酸。引物
還可以包括核苷酸。引物必須足夠長(zhǎng)以在用于聚合的試劑的存在下啟 始延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度將取決于包括溫度、應(yīng)用和引物 來(lái)源的多種因素。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"退火"或"啟始"指寡脫氧 核香酸或核酸分子與模板核酸的同位，而所述同位使聚合酶將核苷酸 聚合進(jìn)與模板核酸或其一部分互補(bǔ)的核酸分子中。本發(fā)明中使用的術(shù) 語(yǔ)"雜交，，指由互補(bǔ)的單鏈核酸形成雙鏈核酸。在此沒(méi)有刻意區(qū)別"退 火"與"雜交"，且其可以互換地使用。
本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"探針"指包含與目標(biāo)核酸序列基本互補(bǔ)的 一個(gè)部分或多個(gè)部分的單鏈核酸分子。
本發(fā)明中使用的與本發(fā)明的DS oligo相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"部分"指由間 隔部分分開(kāi)的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)"5'-高Tm特異性部分"或"3'-低Tm 特異性部分"指分別在本發(fā)明的DS oligo的5'-端或3'-端的核苷酸序列， 其通過(guò)間隔部分分開(kāi)。與DSoligo相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"5'-高Tm特異性部分" 意在指在三個(gè)部分中具有最高Tm且具有與模板核酸的一個(gè)位點(diǎn)基本互 補(bǔ)的雜交核苷酸序列的部分。與DSoligo相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"3'-低Tm特異性
部分"指具有比5'-高Tm特異性部分低而比間隔部分高的Tm且具有與
模板核酸的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)的雜交核苷酸序列的部分。
本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"Tm"指一半核酸雙鏈分子變?yōu)閱捂湹慕怄?br> 溫度。與DSoligO中的部分相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"高Tm"和"低Tm"意在描述 相對(duì)Tm值而不是絕對(duì)Tj直。換句話說(shuō)，只需要5'-高Tm特異性部分的 Tm相對(duì)高于3'^氐Tm特異性部分的Tm。
設(shè)計(jì)5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分，以使其具有與模 板核酸的一個(gè)位點(diǎn)基本上互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列。本發(fā)明
中使用的與DS oligo相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"基本上互補(bǔ)"指充分地互補(bǔ)以在設(shè)
計(jì)的退火條件或嚴(yán)格條件下選擇性地與模板核酸序列雜交，退火的寡 核苷酸從而可以通過(guò)聚合酶延伸以形成模板的互補(bǔ)拷貝。因此，該術(shù) 語(yǔ)與"完全互補(bǔ)，，或其相關(guān)的術(shù)語(yǔ)具有不同的含義。應(yīng)該理解，達(dá)到
DS oligo可以用作引物或探針的程度，DS oligo的5'-高Tm特異性部分 和3'-低Tm特異性部分與模板可以具有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配。最優(yōu)選地， DS oligo的5'-高Tm特異性部分和/或3'-低Tm特異性部分具有與模板的 一個(gè)位點(diǎn)完全互補(bǔ)的核苷酸序列，即沒(méi)有錯(cuò)配。
DS oligo為成功地行使作用，重要的是，5'-高Tm特異性部分的Tm
比3'-低Tm特異性部分的Tm高。優(yōu)選的是，5'-高Tm特異性部分的Tm
在40。C 80。C、更優(yōu)選40。C 75。C、仍更優(yōu)選50。C 68。C 、最優(yōu)選50°C 65。C的范圍內(nèi)。優(yōu)選的是，3'-低Tm特異性部分的Tm在1(TC 4(TC、 更優(yōu)選15。C 4(TC、最優(yōu)選20'C 35t:的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，5'-高Tm特 異性部分的Tm比3' 氐Tm特異性部分的Tm高至少5°C 、更優(yōu)選至少10 °C、仍更優(yōu)選至少15°C、最優(yōu)選至少20°C。有利地，5'-高T,，，特異性 部分的Tm比3'"氐Tm特異性部分的Tm高5~70°C 、優(yōu)選10 70°C、更 優(yōu)選10 60°C、仍更優(yōu)選10 50。C、仍更優(yōu)選10 40°C、且最優(yōu)選20 40 °C。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，5'-高Tm特異性部分比3'-低Tm特異性部分
長(zhǎng)。5'-高Tm特異性部分的長(zhǎng)度優(yōu)選為15 40個(gè)核苷酸殘基，更優(yōu)選為 15 30個(gè)核苷酸殘基，且最優(yōu)選為20 25個(gè)核苷酸殘基。3'-低Tm特異 性部分的長(zhǎng)度優(yōu)選為3 15個(gè)核芬酸殘基，更優(yōu)選為5 15個(gè)核苷酸殘 基，且最優(yōu)選為6 12個(gè)核苷酸殘基。
包含至少兩個(gè)通用堿基的間隔部分對(duì)DS oligo的優(yōu)點(diǎn)和特征具有 部分作用。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"通用堿基"指能夠與其之間具有較
少差別的各天然DNA/RNA堿基形成堿基對(duì)的堿基。
已廣為已知，簡(jiǎn)并引物的一些多義位點(diǎn)的核苷酸已被如脫氧肌苷 (Ohtsuka, E等人，(1985) J. Biol. Chem. 260, 2605-2608;和Sakanari, J.A 等人，(1989) Proc. Natl Acad. Sci 86, 4863-4867)、 l-(2'-脫氧-(3-D-呋喃核 糖基)-3-硝基吡咯(Nichols, R等人，(1994) Nature 369, 492-493)和5-賄基 口引咮(Loakes， D等人，(1994) Nucleic Acids Res. 22, 4039-4043)代替，以 解決與簡(jiǎn)并引物相關(guān)的設(shè)計(jì)問(wèn)題，因?yàn)檫@種通用堿基能夠與全部四種 常規(guī)堿基非特異性的配對(duì)。然而，沒(méi)有任何報(bào)道這些通用堿基在寡 核苷酸分子中形成在退火(雜交)或擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生泡狀結(jié)構(gòu)的部分，然 后將兩個(gè)相對(duì)的臨近序列分開(kāi)，從而由于通過(guò)兩個(gè)分開(kāi)的特異性(退火) 部分的雙特異性而導(dǎo)致引物或探針與目標(biāo)序列的退火特異性升高。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，間隔部分中的通用石咸基選自包括脫氧肌苷、 肌芬、7-脫氮-2'-脫氧肌苷，2-氮-2'-脫氧肌苷、2'-OMe肌苷、2'-F肌苷、 脫氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2'-OMe 3-硝基吡咯、2'-F 3-硝基吡咯、 l-(2'-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脫氧5-硝基吲哚、5-硝基吲哚、 2'-OMe 5-硝基。引哚、2'-F 5-硝基吲咮、脫氧A-硝基苯并咪哇、4-硝基 苯并咪唑、脫氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑、脫氧水粉蕈素、 2'-F水粉蕈素、2'-F 4-硝基苯并咪唑、PNA-5-硝基吲哚(introindole)、 PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、 嗎啉代-5-硝基W哚、嗎啉代-水粉蕈素、嗎啉代-肌苦、嗎啉代-4-硝基 笨并咪唑、嗎啉代-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌苷、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸 酯-3-硝基吡咯、2'-0-曱氧基乙基肌苷、2'0-曱氧基乙基水粉蕈素、2'-0-曱氧基乙基5-硝基吲哚、2'-0-曱氧基乙基4-硝基苯并咪唑、2'-0-曱氧基 乙基3-硝基吡咯及其組合的組。通用堿基或非互換型堿基類似物更優(yōu) 選為脫氧肌苷、l-(2'-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯或5-硝基卩引哚， 最優(yōu)選為脫氧肌苷。
所述通用石咸基可以以連續(xù)的方式或以與如dNMPs的其它核苷酸間 隔的方式包含在間隔部分中。優(yōu)選的是，間隔部分包含具有優(yōu)選為脫 氧肌香的通用石威基的連續(xù)核苷酸。
關(guān)4t的是，DS oligo中的間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm， 以在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分與模板核酸退火的條件 下形成非堿基配對(duì)泡狀結(jié)構(gòu)，使得5'-高Tm特異性部分與3'-低Tm特異 性部分根據(jù)與模板核酸的退火特異性而分離，從而使寡核苷酸的退火
特異性受5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分的雙重限定，寡核
苷酸的整體退火特異性因此而顯著提高。間隔部分的TJ尤選在3°C 15 °C、更優(yōu)選4'C 15t:、最優(yōu)選5。C 10。C的范圍內(nèi)。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，5'-高Tm特異性部分與3'-低Tm特異性部分
之間的間隔部分包含至少3個(gè)通用;威基、更優(yōu)選至少4個(gè)通用堿基、 最優(yōu)選至少5個(gè)通用石咸基。才艮據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，間隔部分包含2 10 個(gè)通用堿基、更優(yōu)選3 10個(gè)通用堿基、仍更優(yōu)選4 8個(gè)通用堿基、最 優(yōu)選5~7個(gè)通用^威基。
需要具有較長(zhǎng)序列的引物或探針時(shí)，DS oligo的優(yōu)點(diǎn)最突出。例如， 根據(jù)常規(guī)技術(shù)，具有長(zhǎng)于35 bp的核苷酸序列的引物作為雜交序列易產(chǎn) 生非特異性擴(kuò)增子。相反，因?yàn)槠浒瑑蓚€(gè)根據(jù)與模板的分子間相互
作用(即，退火)而彼此分開(kāi)的雜交序列(即，5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分)，所以DS oligo即使具有較長(zhǎng)序列也可以產(chǎn)生特異
性擴(kuò)增子。例如，DS oligo可以包含3 5~45 bp的與目標(biāo)序列互補(bǔ)的雜 交序列。與此相關(guān)，應(yīng)該理解，本發(fā)明可以設(shè)計(jì)更長(zhǎng)序列的引物，而 這在常規(guī)引物設(shè)計(jì)策略中是不可行。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，5'-高Tm特異性部分的長(zhǎng)度為15 25個(gè)核苷 酸，間隔部分的長(zhǎng)度為3~15個(gè)核苷酸，且3'-低Tm特異性部分的長(zhǎng)度 為3~15個(gè)核苦酸。
更優(yōu)選地，5'-高Tm特異性部分的長(zhǎng)度為15 25個(gè)核苷酸，間隔部 分的長(zhǎng)度為3 10個(gè)核苷酸，且3'-低Tm特異性部分的長(zhǎng)度為5 15個(gè)核 香酸。更優(yōu)選地，5'-高Tm特異性部分的長(zhǎng)度為15 25個(gè)核苷酸，間隔 部分的長(zhǎng)度為5 7個(gè)核苷酸，且3'-低Tm特異性部分的長(zhǎng)度為6 10個(gè) 核普酸。根據(jù)實(shí)施例中所述的示例性和說(shuō)明性DSoligo， 5'-高Tm特異 性部分的長(zhǎng)度為約20個(gè)核苷酸，間隔部分的長(zhǎng)度為約5個(gè)核苷酸，且 3'-低Tm特異性部分的長(zhǎng)度為約8~10個(gè)核苷酸。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，DS oligo由下面的通式表示<formula>formula see original document page 31</formula>(Xp和&的定義和特征與前述相同，dl表示脫氧肌苷，(dl)q表示包含具 有通用;威基的連續(xù)核苷酸的間隔部分，且q為5 7的整數(shù))。
有趣的是，本發(fā)明的DS oligo在容許與其目標(biāo)序列的錯(cuò)配的嚴(yán)格 條件下還具有錯(cuò)配容許性。
圖1B中示出了控制DS oligo錯(cuò)配容許性的原理的圖示。在5'-高 Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分與模板退火的條件下，可以容許 在5'-高Tm特異性部分中具有一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選一至三個(gè)堿基錯(cuò)配。在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分與模板退火的條件下，可以 容許在3'-低Tm特異性部分中具有一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選一至兩個(gè)堿基錯(cuò) 配。此外，在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分與模板退火的 條件下，可以容許在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分中具有
一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選一至五個(gè)堿基錯(cuò)配。
為使DS oligo具有錯(cuò)配容許性，退火條件，尤其是退火溫度是重 要的。在如下條件下發(fā)生退火當(dāng)5'-高Tm特異性部分和/或3'-低Tm 特異性部分與目標(biāo)位點(diǎn)具有一個(gè)或多個(gè)、但是有限制的錯(cuò)配堿基時(shí)，
不會(huì)只有3'-低Tm特異性部分退火，而是全部部分發(fā)生退火。需要具有
錯(cuò)配容許性的DS oligo以擴(kuò)增或檢測(cè)具有遺傳多樣性的核苷酸序列。 具有錯(cuò)配容許性的DS oligo可以與呈現(xiàn)遺傳多樣性的目標(biāo)序列退火， 并成功擴(kuò)增和檢測(cè)目的核苷酸序列。換句話說(shuō)，最初開(kāi)發(fā)的用于顯著 提高退火和雜交特異性的DS oligo還可以用于在適當(dāng)調(diào)整退火或嚴(yán)格 條件時(shí)需要錯(cuò)配容許性的方法中。
在本發(fā)明的另 一個(gè)技術(shù)方案中，提供一種用于使寡核苷酸的退火 特異性能夠通過(guò)寡核苷酸的結(jié)構(gòu)而被雙重限定的方法，其包括如下步 驟(a)選擇目標(biāo)核酸序列；(b)設(shè)計(jì)寡核苷酸序列，其包含(i)與目標(biāo)核 酸基本互補(bǔ)的雜交序列和(ii)包含至少兩個(gè)通用堿基的間隔部分，使間 隔部分插入雜交序列以在該寡核苷酸中形成三個(gè)部分；以及(c)限定間 隔部分在寡核苷酸中的位置，以使間隔部分5 '-方向的部分具有比間隔 部分3 '-方向的部分更高的Tm，并使間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的 Tm，從而提供一種具有三個(gè)彼此不同Tm值的區(qū)分部分的寡核苷酸，其 中，(i)寡核苷酸的5'-高Tm特異性部分具有與目標(biāo)核酸基本互補(bǔ)的雜交 核苷酸序列；(ii)寡核苷酸的3'-低Tm特異性部分具有與目標(biāo)核酸基本
互補(bǔ)的雜交核苷S吏序列；以及(iii) 5'-高Tm特異性部分與3'-低Tm特異 性部分之間的寡核苷酸的間隔部分包含至少兩個(gè)通用i威基；且5'-高Tm 特異性部分的Tm比3M氐Tm特異性部分的Tm高，而間隔部分在三個(gè)部 分中具有最低的Tm,因此，寡核苷酸與目標(biāo)核酸的退火特異性受5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分的雙重限定。
本方法目的在于提供一種新方法以顯著提高將與其目標(biāo)序列雜交 的寡核苷酸的退火特異性。本方法還可以表述為用于提高寡核苷酸的 退火特異性的方法。而且，本發(fā)明表述為使用包含至少兩個(gè)通用堿基 的間隔部分用以提高與目標(biāo)序列雜交的寡核苷酸的退火特異性的方 法。
實(shí)施本發(fā)明以制備上文所述的DSoligo。因此，為避免不需要的冗 長(zhǎng)，其之間的共有描述不再重復(fù)，但是其好像被重復(fù)似的包含在所述 方法的il明中。
多數(shù)用于設(shè)計(jì)引物或探針的常規(guī)方法僅使用盡可能可與其目標(biāo)序 列雜交的序列。而且，為了提高寡核苷酸的退火特異性，已經(jīng)常規(guī)地 試圖調(diào)整如溫度和離子濃度的擴(kuò)增或雜交條件。
相反，本方法提供了 一種用于通過(guò)向寡核苷酸序列本身中引入新 的特征來(lái)提高退火特異性的新策略。本發(fā)明中使用的與能夠使寡核苷 酸的退火特異性被雙重限定相關(guān)的術(shù)語(yǔ)"通過(guò)寡核苷酸的結(jié)構(gòu)"指十 分有助于提高寡核苷酸的退火特異性的寡核苷酸的結(jié)構(gòu)，其通過(guò)向寡 核苷酸提供新的特征以使其根據(jù)退火特異性而被雙重限定。
在本方法中關(guān)^t是設(shè)計(jì)包含(i)與目標(biāo)核酸基本互補(bǔ)的雜交序列和 (ii)包含至少兩個(gè)通用堿基的間隔部分的寡核苷酸序列。在該步驟中，
寡核苷酸的結(jié)構(gòu)輪廓呈現(xiàn)為在寡核苷酸中表現(xiàn)為5'-端部分/間隔部分 /3'-端部分。5'-端部分和3'-端部分?jǐn)y帶與目標(biāo)核酸基本互補(bǔ)的雜交序列 且其通過(guò)間隔部分分開(kāi)。
本發(fā)明中最關(guān)鍵的步驟為確定間隔部分在寡核苷酸中的位置，以 使間隔部分5 '-方向的部分具有比間隔部分3 '-方向的部分更高的Tm, 并使間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm，從而提供一種具有三個(gè)彼 此不同Tm值的區(qū)分部分的寡核苷酸。
通過(guò)本方法《1入寡核苷酸的新結(jié)構(gòu)特征為(i)寡核苷酸序列中的 三個(gè)區(qū)分部分(5'-高Tm特異性部分、間隔部分和3'-j氐Tm特異性部分)； (ii)三個(gè)部分彼此不同的TJ直；(iii) 5'-高Tm特異性部分與3'-低Tm特異 性部分之間包含至少兩個(gè)通用堿基的間隔部分；(iv)在退火步驟中涉及 與目標(biāo)的分子間相互作用的兩個(gè)部分，其根據(jù)退火事件通過(guò)間隔部分 分開(kāi)；(v)按5'-高Tm特異性部分、3'-低Tm特異性部分和間隔部分的順
序的Tm值。這種結(jié)構(gòu)特征確保最終由本發(fā)明提供的寡核苷酸的退火特 異性受5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分的雙重限定，從而使
寡核苷酸與其目標(biāo)序列的退火特異性顯著提高。
根據(jù)本發(fā)明的方法設(shè)計(jì)和制備的寡核苷酸比沒(méi)有所述三個(gè)部分的 寡核苷酸表現(xiàn)出更高的退火特異性。
將描述DS oligo的特征和優(yōu)點(diǎn)如下
(a) DS oligo的間隔部分包含在DS oligo中產(chǎn)生最低Tm區(qū)域的至少
兩個(gè)通用堿基，使其在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分與模
板核酸退火的條件下，形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)。這種非堿基配對(duì)
的泡狀結(jié)構(gòu)能使5'-高Tm特異性部分與3'-低Tm特異性部分根據(jù)與模板 核酸的退火特異性而分開(kāi)；
(b) 5'-高Tm特異性部分的Tm比3'-低Tm特異性部分的Tm高，且間 隔部分呈現(xiàn)最低的Tm,其使得可以確定不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部
分退火的嚴(yán)格條件；
(c) 因此，DS oligo的整體退火特異性受5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分的雙重限定；以及
(d) 結(jié)果，DSoligo的整體退火特異性顯著提高。
應(yīng)該理解，本發(fā)明的DS oligo在如下多種方法中十分有用(i)基 于引物的核酸擴(kuò)增方法，如Miller, H. I (WO 89/06700)和Davey， C等人 (EP 329,822)的方法、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR， Wu, D.Y等人，Genomics 4: 560 (1989))、聚合酶連"l妄酶《連式反應(yīng)(Barany, PCR Methods and Applic, 1:5-16(1991))、 Gap-LCR(WO卯/01069)、修復(fù)纟連反應(yīng)(EP 439,182)、 3SR (Kwoh等人，PNAS， USA， 86:1173(1989))和NASBA (U.S. Pat, No. 5,130,238); (ii)基于引物延伸的技術(shù)，如循環(huán)測(cè)序法(Kretz等人，(1994) Cycle sequencing. PCR Methods Appl. 3:S107-SI 12)和焦石岸酸測(cè)序法 (Ronaghi等人，(1996) Anal. Biochem., 242: 84陽(yáng)89;和(1998) Science 281:363-365);以及(iii)基于雜交的技術(shù)，如使用核苷酸微陣列檢測(cè)目 標(biāo)核苷酸序列。
本發(fā)明的DS oligo可以應(yīng)用于多種核酸擴(kuò)增、測(cè)序和基于雜交的 技術(shù)。證明DS oligo作用的代表性例子如下
I.合成核酸分子的應(yīng)用 在本發(fā)明的另 一個(gè)技術(shù)方案中，提供一種使用雙特異性寡核苷酸 通過(guò)基板依賴性延伸反應(yīng)合成核酸分子的方法，其包括如下步驟
(a) 使雙特異性寡核苷酸與模板核酸分子退火，其中，所述雙特異
性寡核苷酸具有三個(gè)部分，其中5'-高Tm特異性部分具有與^^莫板核酸的
一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，間隔部分包含至少
兩個(gè)通用堿基，且3'-低Tm特異性部分具有與模板核酸的一個(gè)位點(diǎn)基本 互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，5'-高Tm特異性部分的Tm高于3'-低Tm特異性部分的Tm,間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm,間隔 部分在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分與模板核酸退火的條 件下形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)，其中在不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部
分的退火的條件下進(jìn)行退火；以及
(b) 延伸所述雙特異性寡核香酸以合成與i^莫板核酸互補(bǔ)的核酸分子。
因?yàn)楸景l(fā)明的合成方法使用本發(fā)明的DS oligo,省略其之間的共有
描述，以避免本說(shuō)明書(shū)的復(fù)雜性而導(dǎo)致不必要的重復(fù)。
使用本發(fā)明的DS oligo的本應(yīng)用可以提供用于通過(guò)涉及退火和延
的改進(jìn)方法。尤其是，通過(guò)重復(fù)其中退火和延伸步驟后接著變性步驟 的模板依賴性延伸反應(yīng)的方法，可以完成與目標(biāo)序列互補(bǔ)的核酸序列 的合成。
本發(fā)明的方法可以用于合成與任何模板核酸分子互補(bǔ)的核酸分
子。該分子可以是DNA或RNA。該分子可以是雙鏈或單鏈形式。在 作為原材料的核酸為雙鏈時(shí)，優(yōu)選將雙鏈變成單鏈或部分單鏈形式。
已知分離鏈的方法包括但不限于加熱、堿、曱酰胺、尿素和glycoxal 處理，酶方法(例如，解i走酶作用)和結(jié)合蛋白。例如，可以通過(guò)在范圍 為80。C 105。C的溫度下加熱而完成鏈分離。Joseph Sambrook等人， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)提供了用于完成所述處理的通用 方法。
使用mRNA作為原材料時(shí)，在進(jìn)行退火步驟之前需要反轉(zhuǎn)錄步驟， 其具體內(nèi)容參見(jiàn)Joseph Sambrook,等人，A/o/ecu/ar CAm ^ >1丄aZ7arato7 Afe""a/, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor， N.Y.(2001);以及Noonan, K. F等人，Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988))。 使用可與mRNA的poly A尾巴雜交的寡核苷酸dT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。 該寡核苷酸dT引物包含dTMP,只要該dT引物可以用作引物，其一 個(gè)或多個(gè)可以用dNMP替換?？梢杂镁哂蠷Nase H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn) 行反轉(zhuǎn)錄。如果使用具有RNase H活性的酶，通過(guò)仔細(xì)選擇反應(yīng)條件 可以省去單獨(dú)的RNase H消化步驟。
本發(fā)明不需要模板核酸分子具有任何特殊序列和長(zhǎng)度。具體而言， 該分子包括任何天然存在的原核、真核(例如，原生生物和寄生蟲(chóng)，真 菌，酵母，高等植物，低等和高等動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物和人)、病毒(例 如，皰滲病毒、HIV、流感病毒、EB病毒、肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)鹽病 毒等)或類病毒核酸。該核酸分子還可以是任何已經(jīng)或者可以化學(xué)合成 的核酸分子。因此，該核酸序列可以或不會(huì)在自然界發(fā)現(xiàn)。
用于本發(fā)明的DS oligo與模板的一個(gè)位點(diǎn)雜交或退火而形成雙鏈 結(jié)構(gòu)。Joseph Sambrook等人,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)以
及Haymes, B. D等人,Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)中描述了適于形成這種雙鏈結(jié)構(gòu)的 核酸退火的條件。DS oligo的5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部 分的序列不需要呈現(xiàn)出精確的互補(bǔ)性，其只需要在序列上基本互補(bǔ)以 能夠形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。因此，與完全互補(bǔ)的偏差是允許的，只要 這種偏差不足以阻止形成雙鏈結(jié)構(gòu)的雜交。DS oligo與才莫板核酸的一個(gè) 位點(diǎn)的退火是其使用聚合酶的模板依賴性聚合的先決條件。影響DS oligo與其互補(bǔ)核酸的堿基配對(duì)的因素(參考Joseph Sambrook等人, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001);以及Haymes， B.D等人，Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press,華盛頓市(1985))隨 后影響啟動(dòng)效率。DS oligo的核苷酸組成會(huì)影響最佳的退火溫度，因此 可以影響其啟動(dòng)效率。
DS oligo的5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分在退火步驟 中起到用作雜交部分或特異性決定位點(diǎn)(即，雙特異性決定位點(diǎn))的作 用，而間隔部分不用作雜交位點(diǎn)且不和模板相互作用而堿基配對(duì)。
多種DNA聚合酶可以用于本方法的延伸步驟，其包括大腸桿菌(E. coli) DNA聚合酶I"Klenow"片段、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶和噬菌體T7 DNA聚合酶。聚合酶優(yōu)選為可以從多種細(xì)菌種，包括r力e/m^ ag朋&iw
Z&cococcw51 //fe/afo <口 iyracoccws y^/7'o w p^^中獲得的熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶。在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選在反應(yīng)容器中提供過(guò)量的用于 這種反應(yīng)的成分。所指的延伸反應(yīng)的成分的過(guò)量是指各成分的量使得 完成所述延伸的能力基本不受所述成分的濃度的限制。需要向反應(yīng)混
合物中4是供充足量的如Mg"的輔因子以及dATP、 dCTP、 dGTP和 dTTP，以達(dá)到所需的延伸程度。
本方法中的退火或雜交在DS oligo與模板核酸特異性結(jié)合的嚴(yán)格 條件下進(jìn)行。用于退火的嚴(yán)格條件將是序列依賴性的且根據(jù)環(huán)境參數(shù) 而改變。在本方法中， 一般在較高的嚴(yán)格條件下進(jìn)行退火步驟。然而， 如果將本方法應(yīng)用于需要錯(cuò)配容許性的方法中，優(yōu)選的是，盡管存在 一個(gè)或多個(gè)但有限的堿基對(duì)錯(cuò)配，但是在5'-高Tm特異性部分和3'-低 Tm特異性部分與模板退火的條件下進(jìn)行退火步驟。這種錯(cuò)配容許性在 具有遺傳多樣性的基因的擴(kuò)增和檢測(cè)中十分有用。嚴(yán)格條件可以由本 領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定。
有利的是，在比3'-低Tm特異性部分的Tm高的退火溫度下進(jìn)行退 火步驟，從而確保不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部分的退火。優(yōu)選地，退 火溫度比3'-低Tm特異性部分的Tm高至少5°C、更優(yōu)選至少l(TC、仍 更優(yōu)選至少15。C、且最優(yōu)選至少20。C。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，退火溫度在約40。C 75。C 、更優(yōu)選45°C 72 。C、仍更優(yōu)選50。C 68。C、且最優(yōu)選55。C 65。C的范圍內(nèi)。本方法中適 用的退火溫度可以通過(guò)獨(dú)立地考慮5'-高U爭(zhēng)異性部分和3'-低Tm特異 性部分的Tm而確定。換句話說(shuō)，不通過(guò)5'-高Tm特異性部分和3'-低
Tm特異性部分的總長(zhǎng)度和核苷酸組成，而是通過(guò)5'-高Tm特異性部分 和/或3'-低Tm特異性部分其單個(gè)的長(zhǎng)度和核苷酸組成來(lái)確定本方法中 的退火溫度。通常，通過(guò)只考慮5'-高Tm特異性部分的Tm而確定的退
火溫度會(huì)比3'-低Tm特異性部分的Tm高，且變成最佳溫度。
如果在退火步驟中需要錯(cuò)配容許性，優(yōu)選調(diào)整退火溫度以使其變 得比上述的更低。
本方法可以與許多其它本領(lǐng)域中已知的方法結(jié)合以實(shí)現(xiàn)特定目 的。例如，在延伸步驟后可以接著合成產(chǎn)物的分離(或純化)。其可以通 過(guò)凝膠電泳、柱層析、親和層析或雜交實(shí)現(xiàn)。另外，本發(fā)明的合成產(chǎn) 物可以插入用于克隆的合適載體中。此外，本發(fā)明的合成產(chǎn)物可以在 合適的宿主表達(dá)載體中表達(dá)。
II.擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的應(yīng)用
在本發(fā)明的又一個(gè)技術(shù)方案中，提供一種由DNA或核酸混合物選 擇性擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的方法，其包括使用 一對(duì)雙特異性寡核苷酸作 為引物通過(guò)至少兩個(gè)循環(huán)的引物退火、引物延伸和變性來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)核 酸；其中，所述雙特異性寡核苷酸具有三個(gè)部分，其中5'-高Tm特異性 部分具有與目標(biāo)核酸的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序 列，間隔部分包含至少兩個(gè)通用堿基，且3'-低Tm特異性部分具有與目 標(biāo)核酸的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，5'-高Tm特 異性部分的Tm高于3'-低Tm特異性部分的Tm,間隔部分在三個(gè)部分中 具有最低的Tm;間隔部分在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部 分與目標(biāo)核酸退火的條件下形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)；其中在不會(huì) 只發(fā)生3'-低Tm特異性部分的退火的條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)中的退火。
因?yàn)楸景l(fā)明的擴(kuò)增方法使用本發(fā)明的DS oligo，省略其之間的共有 描述，以避免本說(shuō)明書(shū)的復(fù)雜性而導(dǎo)致不必要的重復(fù)。此外，因?yàn)楸?發(fā)明的方法涉及退火和延伸步驟，省略對(duì)這兩個(gè)步驟的描述，以避免 本說(shuō)明書(shū)的復(fù)雜性而導(dǎo)致不必要的重復(fù)。例如，本方法與前述用于合
成核酸分子的方法之間使用的DS oligo的組成和結(jié)構(gòu)以及用于退火和 延伸的條件是相同的。
使用本發(fā)明的DS oligo的本應(yīng)用可以提供一種通過(guò)進(jìn)行核酸擴(kuò)增、 優(yōu)選PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)由核酸或核酸混合物(DNA或mRNA)選 擇性擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的改進(jìn)方法。
圖2示出了使用如上所述DS oligo來(lái)選擇性擴(kuò)增雙鏈DNA的目標(biāo) 核酸的圖示。如圖2中所示， 一對(duì)DS oligo與變性的ds DNA才莫^反退 火。5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分在退火步驟中起到用作 雜交部分或特異性決定位點(diǎn)(即，雙特異性決定位點(diǎn))的作用，而間隔部 分不用作雜交位點(diǎn)且不和模板相互作用而堿基配對(duì)。此時(shí)，間隔部分 在DS oligo中形成泡狀結(jié)構(gòu)，以使兩個(gè)端部，即5'-高Tm特異性部分和 3'-低Tm特異性部分可以在空間上被分開(kāi)，以雙重限定DS oligo的整體 特異性。后續(xù)反應(yīng)的具體內(nèi)容與本文前述本領(lǐng)域中已知的常規(guī)基于引 物的核酸擴(kuò)增的具有內(nèi)容相似。
可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的各種基于引物的核酸擴(kuò)增進(jìn)行本發(fā)明， 以擴(kuò)增核酸序列。優(yōu)選地，根據(jù)美國(guó)專利號(hào)4,683,195、 4,683,202,和 4,800， 159中所公開(kāi)的PCR法、更優(yōu)選熱啟動(dòng)PCR法進(jìn)行本方法。
圖3示出了使用DS oligo來(lái)選擇性擴(kuò)增mRNA的目標(biāo)核酸的圖示。 在第一步驟中，使用可與mRNA的poly A尾巴雜交的oligo dT引物和 逆轉(zhuǎn)錄酶，將從多種生物樣品中獲得的mRNA反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄的具體 內(nèi)容參考 Joseph Sambrook等人,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001);以及Noonan, K. F.等人，Nucleic Acids Res. 16:10366
(1988))。后續(xù)反應(yīng)的描述與本文前述本領(lǐng)域中已知的常規(guī)基于引物的 核酸擴(kuò)增的描述相似。
III.多重DNA擴(kuò)增的應(yīng)用
在本發(fā)明的另 一個(gè)技術(shù)方案中，提供一種在同 一反應(yīng)中使用兩對(duì) 或更多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或更多個(gè)目標(biāo)核苷酸序列的方法，其包括 使用兩對(duì)或更多對(duì)雙特異性寡核苷酸作為引物通過(guò)進(jìn)行至少兩個(gè)循環(huán) 的引物退火、引物延伸和變性來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列，其特征在于，
所述雙特異性寡核苷酸具有三個(gè)部分，其中5'-高Tm特異性部分具有與
目標(biāo)核苷酸序列的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，
間隔部分包含至少兩個(gè)通用堿基，且3'-低Tm特異性部分具有與目標(biāo)核 苷酸序列的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，5'-高Tm
特異性部分的Tm高于3'^氐Tm特異性部分的Tm,間隔部分在三個(gè)部分 中具有最j氐的Tm;間隔部分在5'-高Tm特異性部分和3M氐Tm特異性
部分與目標(biāo)核苷酸序列退火的條件下，形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)，
其中在不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部分的退火的條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)
中的退火。
使用本發(fā)明的DS oligo的本申請(qǐng)還可以提供一種在同 一反應(yīng)中使 用多對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)序列的改進(jìn)方法。通常，因?yàn)樾枰罴裀CR 反應(yīng)以沒(méi)有任何非特異性副產(chǎn)物地恰好擴(kuò)增一特異性位點(diǎn)，所以很難 確定用以平行擴(kuò)增超過(guò)10個(gè)目標(biāo)序列的多重PCR的條件。因?yàn)橥嘶?需要在足夠高的溫度下發(fā)生以在反應(yīng)中發(fā)生完全地DNA-DNA配對(duì)， 所以本發(fā)明的DS oligo由于其改進(jìn)擴(kuò)增特異性的功能而在多重DNA擴(kuò) 增的最優(yōu)化中是理想的。本發(fā)明中使用的"多重PCR"指單一聚合酶
鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)混合物中的多個(gè)目標(biāo)DNA的同時(shí)擴(kuò)增。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，所述多重方法包括使用DS oligo 的引物對(duì)進(jìn)行包括至少兩個(gè)循環(huán)的引物退火、引物延伸和變性的擴(kuò)增 反應(yīng)，其特征在于引物為雙特異性寡核苷酸，其具有三個(gè)部分，其中 5'-高Tm特異性部分具有與目標(biāo)核苷酸序列的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其 雜交的雜交核苷酸序列，間隔部分包含至少兩個(gè)通用堿基，且3'-低Tm 特異性部分具有與目標(biāo)核苷酸序列的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的
雜交核苷酸序列，5'-高Tm特異性部分的Tm高于3M氐Tm特異性部分的
Tm;間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm,間隔部分在5'-高Tm特異 性部分和3'-低Tm特異性部分與目標(biāo)核苷酸序列退火的條件下形成非 堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)；其中在不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部分的退火的 條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)中的退火。
因?yàn)槭褂帽景l(fā)明的DS oligo的本應(yīng)用根據(jù)前述用于擴(kuò)增核酸序列 的本方法進(jìn)行，所以除了使用多個(gè)目標(biāo)核普酸序列和引物對(duì)之外，省 略其之間的共有描述，以避免本說(shuō)明書(shū)的復(fù)雜性而導(dǎo)致不必要的重復(fù)。
例如，本方法與前述用于擴(kuò)增核酸序列的方法之間使用的DS oligo的 組成和結(jié)構(gòu)以及用于擴(kuò)增的條件是相同的。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，退火溫度在約4(TC 70。C、更優(yōu)選45。C 68 。C、仍更優(yōu)選5(TC 65。C、且最優(yōu)選55。C 65。C的范圍內(nèi)。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，來(lái)自各目標(biāo)核苷酸序列的擴(kuò)增產(chǎn)物其大小 不同，以用于后續(xù)分析。才艮據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，多重目標(biāo)核苷酸序列 的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)大小分開(kāi)來(lái)分析。使用本領(lǐng)域中的多種已知方法，
如通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠板或瓊脂糖凝膠板的電泳和核苷酸測(cè)序進(jìn)行大 小分開(kāi)比較。核苷酸測(cè)序可以通過(guò)來(lái)自各制造商的自動(dòng)測(cè)序儀迅速地 進(jìn)行。
如下面的實(shí)施例中所舉例說(shuō)明的，本發(fā)明的多重性可以使最終擴(kuò) 增的產(chǎn)物避免背景問(wèn)題以及由本領(lǐng)域已知的常規(guī)多重方法引起的非特 異性。
多重?cái)U(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)在于多種疾病或特定核苷s臾序列變換(例如，單核 苷酸多態(tài)性或點(diǎn)突變)可以在同 一反應(yīng)中分析?？梢酝瑫r(shí)進(jìn)行分析的數(shù)
目沒(méi)有限制，然而，其上限大概為約20個(gè)，且其可以取決于分辨率和 可使用的用以分辨擴(kuò)增產(chǎn)物的方法所需的大小差別。
本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于遺傳和傳染病診斷、性別鑒定、遺傳連 鎖分析以及法醫(yī)學(xué)研究。
IV.DNA測(cè)序的應(yīng)用
利用DS oligo的模板依賴性延伸原理，改進(jìn)的特異性使DS oligo 作為液相測(cè)序的引物(尤其是循環(huán)測(cè)序)或作為固相測(cè)序(尤其是寡核苷 酸芯片測(cè)序)的探針而被用于直接測(cè)序中。
在本發(fā)明另一個(gè)技術(shù)方案中，提供一種使用雙特異性寡核苷酸由 DNA或核酸的混合物測(cè)序目標(biāo)核酸分子的方法，其包括如下步驟
(a)使用所述雙特異性寡核苷酸作為測(cè)序引物，通過(guò)進(jìn)行至少兩個(gè) 循環(huán)的引物退火、引物延伸和變性來(lái)合成與所測(cè)序的目標(biāo)核酸分子互 補(bǔ)的核酸分子，其中，所述雙特異性寡核苷酸具有三個(gè)部分，其中5'-高Tm特異性部分具有與目標(biāo)核酸分子的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交
的雜交核苷酸序列，間隔部分包含至少兩個(gè)通用堿基，且3'-低Tm特異 性部分具有與目標(biāo)核酸分子的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核
苷酸序列，5'-高Tm特異性部分的Tm高于3'-低Tm特異性部分的Tm,
間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm;間隔部分在5'-高Tm特異性部
分和3'-低Tm特異性部分與目標(biāo)核酸分子退火的條件下形成非堿基配
對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)；其中在不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部分的退火的條件下 進(jìn)行合成反應(yīng)中的退火；以及
(b)測(cè)定合成的互補(bǔ)核酸分子的核苷酸序列。
通常，DNA測(cè)序已通過(guò)如Maxam-Gilbert測(cè)序法、Sanger測(cè)序法、 焦磷酸測(cè)序法和外切核酸酶消化測(cè)序法的多種方法進(jìn)行。本測(cè)序法意 在改進(jìn)焦磷酸測(cè)序法以及熱循環(huán)測(cè)序法。
本發(fā)明可以根據(jù)Sanger雙脫氧法的變形形式進(jìn)行。本發(fā)明的熱循 環(huán)測(cè)序可以在PCR擴(kuò)增的核酸模板上進(jìn)行。另外，根據(jù)本發(fā)明，熱循 環(huán)測(cè)序?qū)⒃跍y(cè)序之前沒(méi)有PCR擴(kuò)增的核酸模板上進(jìn)行。
簡(jiǎn)而言之，Sanger測(cè)序法基于DNA聚合酶會(huì)將2',3'-雙脫氧核苷 酸摻入核酸鏈中而導(dǎo)致鏈終止的原理(Sanger等人，(1977) PNAS. USA 74:5463)。由Sanger開(kāi)發(fā)的方法指雙脫氧鏈終止法。在該方法中的最 常規(guī)一種中，所需序列的DNA片段被克隆進(jìn)如M13的單鏈DNA噬菌 體中。這些p藍(lán)菌體DNA可以用作通過(guò)DNA聚合酶I的Klenow片段 的互補(bǔ)鏈的啟動(dòng)合成的模板。引物為與M13載體中靠近克隆插入片段 的3'端的區(qū)域特異雜交的合成寡核苷酸。在四個(gè)測(cè)序反應(yīng)中的每個(gè)中， 啟動(dòng)合成在充足的四種可能的脫氧核苷酸其中一種的雙脫氧類似物的 存在下進(jìn)行，以使生長(zhǎng)鏈通過(guò)摻入這些死端式核苷酸而隨機(jī)終止。調(diào)
整雙脫氧與脫氧形式的相對(duì)濃度，以使對(duì)應(yīng)于可以通過(guò)凝膠電泳分辨 的所有可能鏈長(zhǎng)度的終止事件蔓延。摻入生長(zhǎng)鏈的標(biāo)記用于顯影各電 泳軌跡中的DNA圖形的放射自顯影圖形。通過(guò)檢測(cè)四泳道中條帶的圖 形而確定克隆核酸模板中的脫氧核苷酸的序列。
作為Sanger法的變形，熱循環(huán)測(cè)序法一般涉及到包含核酸測(cè)序引 物、脫氧核苷三磷酸、 一種多種雙脫氧核苷三磷酸(ddNTPs)、合適的 緩沖溶液、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和待測(cè)序的核酸 模板的溶液的使用。熱循環(huán)測(cè)序法的具體內(nèi)容可以參考美國(guó)專利號(hào) 5,432,065、 5,723,298、 5，756，285、 5,817,797和5,831,065，其全部技術(shù) 內(nèi)容引入本發(fā)明中作為參考。該方法的步驟通常在與普通PCR相似的 熱循環(huán)條件下進(jìn)行。
一旦在核酸模板上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，分子序列的測(cè)定需要鑒定反應(yīng) 產(chǎn)物。本技術(shù)領(lǐng)域中已知多種檢測(cè)方法。這些方法通常涉及如Ausubel, F. M等人，Current Protocols in Molecular Biology, (1993) John Wiley & Sons, Inc.,紐約，N.Y中所述的包括放射性核苷酸、熒光、紅外線和化 學(xué)發(fā)光標(biāo)記的標(biāo)記的檢測(cè)。這些標(biāo)記可以用引物或ddNTP、優(yōu)選ddNTP 來(lái)標(biāo)記。最優(yōu)選的標(biāo)記為包括6-羧基熒光素、6-羧基-X-羅丹明、3-(s-羧基戊基)-3'-乙基-5，5'-二甲基氧雜羰花菁、6-羧基-X-羅丹明、4,4-二氟 _4_硼_3 a,4a-二氮-s-二吡咯曱烷-3-丙酸衍生物和4，7-二氯羅丹明染料的 熒光標(biāo)記。
退火溫度優(yōu)選在約40°C 70°C、更優(yōu)選在45°C 68°C、最優(yōu)選在50 'C 65'C的范圍內(nèi)。
如下面的實(shí)施例中所示，本方法提供目標(biāo)核酸分子的高特異性測(cè)
序。更具體地，使用設(shè)計(jì)具有DS oligo的獨(dú)特結(jié)構(gòu)的測(cè)序引物可以差 異的測(cè)序小鼠胎盤(pán)特異性同源框家族基因尸&y/和Psx2。這種差異性測(cè)
序在測(cè)序引物的整個(gè)序列僅有3'-低Tm特異性部分中的一個(gè)堿基不同
時(shí)變得突出。
令人驚訝地，本發(fā)明可以不經(jīng)過(guò)純化和分離而直接將包含在基因
組DNA或一組cDNA中的目標(biāo)核酸分子測(cè)序。成功直接測(cè)序基因組 DNA或一組cDNA中的目標(biāo)核酸分子目前還沒(méi)有才艮道。當(dāng)將本測(cè)序方 法應(yīng)用到直接測(cè)序包含在來(lái)自總RNA的 一組cDNA中的目標(biāo)核酸分子 時(shí)，該方法包括如下步驟
(a) 在足以進(jìn)行模板促使的酶促脫氧核糖核酸合成的條件下，使一 組mRNA和與mRNA的polyA尾巴雜交的寡核苷酸dT引物接觸；
(b) 反轉(zhuǎn)錄與寡核苷酸dT引物雜交的mRNA，以制備和與寡核苷 酸dT引物雜交的mRNA互補(bǔ)的一組第一 cDNA鏈；
(c) 使用雙特異性寡核苷酸作為測(cè)序引物，通過(guò)進(jìn)行至少兩個(gè)循環(huán) 的引物退火、引物延伸和變性來(lái)合成待測(cè)序的第一 cDNA鏈的互補(bǔ)核 酸分子，其中，所述雙特異性寡核苷酸具有三個(gè)部分，其中5'-高Tm 特異性部分具有與第一 cDNA鏈的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜 交核苦酸序列，間隔部分包含至少兩個(gè)通用堿基，且3'-低Tm特異性部 分具有與第一 cDNA鏈的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸
序列，5'-高Tm特異性部分的Tm高于3'-低Tm特異性部分的Tm,間隔
部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm;間隔部分在5'-高Tm特異性部分和 3'-低Tm特異性部分與第一cDNA鏈退火的條件下，形成非堿基配對(duì)的 泡狀結(jié)構(gòu)；其中在不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部分的退火的條件下進(jìn)行
合成反應(yīng)中的退火；以及
(d)測(cè)定合成的第一 cDNA鏈的核香酸序列。 V.檢測(cè)具有遺傳多樣性的核酸分子的應(yīng)用
在本發(fā)明另 一技術(shù)方案中，提供一種通過(guò)雙特異性寡核苷酸的模 板依賴性延伸反應(yīng)檢測(cè)具有遺傳多樣性的核酸分子的方法，其包括如 下步驟
(a)使所述雙特異性寡核苷酸與模板核酸分子退火，其中，所述雙 特異性寡核苷酸具有三個(gè)部分，其中5'-高Tm特異性部分具有與模板核 酸的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苦酸序列，間隔部分包含 至少兩個(gè)通用堿基，且3'-低Tm特異性部分具有與模板核酸的一個(gè)位點(diǎn)
基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，5'-高Tm特異性部分的L高
于3'-低Tm特異性部分的Tm,間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm; 間隔部分在5'-高Tn，特異性部分和3'-低Tm特異性部分與模板核酸退火 的條件下，形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)，其中在不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm 特異性部分的退火的條件下進(jìn)行退火，且在5'-高Tm特異性部分和/或 3'-低Tm特異性部分與其目標(biāo)位點(diǎn)具有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配堿基時(shí)進(jìn)行退
火；
(b)延伸所述雙特異性寡核苷酸，以合成與模板互補(bǔ)的核酸分子；
以及
(c)檢測(cè)所述雙特異性寡核苷酸的模板依賴性延伸的發(fā)生。
因?yàn)槭褂帽景l(fā)明的DS oligo的本應(yīng)用根據(jù)前述用于合成核酸序列 的方法進(jìn)行，所以省略其之間的共有描述，以避免本說(shuō)明書(shū)的復(fù)雜性 而導(dǎo)致不必要的重復(fù)。
使用本發(fā)明的DS oligo的本應(yīng)用可以提供用于通過(guò)涉及退火和延
伸步驟的模板依賴性延伸反應(yīng)來(lái)選擇性檢測(cè)具有遺傳多樣性的核酸序 列的改進(jìn)方法。尤其是，可以通過(guò)重復(fù)其中退火和延伸步驟后接著變 性步驟的模板依賴性延伸反應(yīng)過(guò)程而完成具有遺傳多樣性的目標(biāo)核酸 的斗企測(cè)。
本發(fā)明是基于DS oligo的錯(cuò)配容許性。
多種基因組已經(jīng)報(bào)道了遺傳多樣性。這種現(xiàn)象被認(rèn)為是成功檢測(cè) 目的基因或基因組的障礙。本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)使用具有
錯(cuò)配容許性的DS oligo來(lái)克服這種常規(guī)問(wèn)題的方法。具有特定序列的 DS oligo可以與呈現(xiàn)遺傳多樣性的幾個(gè)目標(biāo)序列退火，從而成功進(jìn)行所 需核酸序列的擴(kuò)增和檢測(cè)。換句話說(shuō)，最初開(kāi)發(fā)的用于顯著提高退火 和雜交特異性的DS oligo還可以用于在適當(dāng)調(diào)整退火或嚴(yán)格條件時(shí)需 要錯(cuò)配容許性的方法中。
為了提供呈現(xiàn)錯(cuò)配容許性的DS oligo，其應(yīng)該在通過(guò)排列所有可用 的序列而產(chǎn)生的核酸分子的保守序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)。本發(fā)明中使用的 術(shù)語(yǔ)"保守區(qū)域"指基因的多種不同核苷酸序列之間明顯相似的基因 的核普酸序列片段或蛋白質(zhì)的氨基酸序列片段。該術(shù)語(yǔ)與術(shù)語(yǔ)"保守 序列"互換使用。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，保守區(qū)域中的最保守序列位于DS oligo的3
'端部分，且最低保守序列位于間隔部分中。5'-高Tm特異性部分和/或
3'-低Tm特異性部分，優(yōu)選5'-高Tm特異性部分由于DS oligo的錯(cuò)配容
許性而可以與其目標(biāo)位點(diǎn)具有一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選一至三個(gè)、更優(yōu)選一 至兩個(gè)錯(cuò)配堿基。
為賦予DSoligo錯(cuò)配容許性，退火條件，尤其是退火溫度很重要。 在不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部分的退火的條件下進(jìn)行退火，而在5'-高Tm特異性部分和/或3'-低Tm特異性部分與其目標(biāo)位點(diǎn)具有一個(gè)或多
個(gè)錯(cuò)配堿基時(shí)全部部分發(fā)生退火。
退火溫度優(yōu)選在約40°C 70°C、更優(yōu)選在45°C~68°C、最優(yōu)選在 5(TC 65。C的范圍內(nèi)。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，根據(jù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行本發(fā)明。
可以通過(guò)多種常規(guī)技術(shù)進(jìn)行本方法的檢測(cè)步驟。例如，如果本方 法以產(chǎn)生足以在凝膠中檢測(cè)的產(chǎn)物的重復(fù)方式進(jìn)行，那么可以通過(guò)常 規(guī)凝膠電泳進(jìn)行才莫板依賴性延伸的產(chǎn)物檢測(cè)。如果標(biāo)記那些可通過(guò)光 語(yǔ)測(cè)量法、光化學(xué)測(cè)量法、生物化學(xué)測(cè)量法、生物電子測(cè)量法、免疫 化學(xué)測(cè)量法、電子測(cè)量法和化學(xué)測(cè)量法檢測(cè)的材料，那么可以進(jìn)行合 適的測(cè)量法以檢測(cè)模板依賴性延伸的發(fā)生。
遺傳多樣性在病毒基因組中最頻繁發(fā)現(xiàn)和產(chǎn)生(Nathalie B等人, (2004) Journal of Clinical Microbiology, 42， 3532; Tersa C等人，(2002) Journal of Infectious Diseases, 185, 1660; Takashi E等人,(2004) Journal of Clinical Microbiology, 42, 126;以及Elizabeth R等人，(2001) ClinicalInfectious Diseases, 32， 1227)。與此相關(guān)，優(yōu)選的是，待檢測(cè)的具有遺 傳多樣性的核酸分子為呈現(xiàn)遺傳多樣性的病毒的核酸。例如，將本發(fā) 明應(yīng)用于通過(guò)PCR檢測(cè)呈現(xiàn)遺傳多樣性的人偏肺病毒時(shí)，設(shè)計(jì)具有DS oligo結(jié)構(gòu)的最優(yōu)選引物對(duì)示于SEQ ID NO: 39 (用作5'引物)和40 (用作 3'引物)或者SEQ ID NO: 39和41 (用作3'引物)中。
VI.使用固定有DS oligo的孩i陣列檢測(cè)目標(biāo)核酸序列的應(yīng)用
本應(yīng)用為一種通過(guò)在固定有DS oligo的微陣列上重復(fù)模板依賴性 的反應(yīng)來(lái)檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列的新方法。
在本發(fā)明的另 一技術(shù)方案中，提供一種通過(guò)模板依賴性延伸反應(yīng) 來(lái)檢測(cè)核酸樣品中的目標(biāo)核苷酸序列的方法，其包括如下步驟
(a) 延伸固定于基底上作為探針的雙特異性寡核苷酸，其包括至少 一個(gè)循環(huán)的雜交、模板依賴性延伸和變性，其中通過(guò)使雙特異性寡核 芬酸與核酸樣品接觸而進(jìn)行雜交，其中，所述雙特異性寡核芬酸具有 三個(gè)部分，其中5'-高Tm特異性部分具有與目標(biāo)核苷酸序列的一個(gè)位點(diǎn) 基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，間隔部分包含至少兩個(gè)通用 堿基，且3'-低Tm特異性部分具有與目標(biāo)核苷酸序列的一個(gè)位點(diǎn)基本互 補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，5'-高Tm特異性部分的Tm高于3'-低 Tm特異性部分的Tm,間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm;間隔部 分在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分與目標(biāo)核苷S菱序列退火 的條件下，形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)，其中在不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm 特異性部分的雜交的條件下進(jìn)行雜交；以及
(b) 分析模板依賴性延伸的發(fā)生。
圖4中示出了通過(guò)使用固定有DS oligo的微陣列而4企測(cè)核酸樣品 中的目標(biāo)核苷酸序列的圖示。
可以在通過(guò)最優(yōu)化程序而常規(guī)確定的合適雜交條件下使用DS oligo進(jìn)行所述方法。根據(jù)包括寡核苷酸和目標(biāo)核苷酸序列的長(zhǎng)度和GC 含量的多種因素可以改變?nèi)鐪囟?、成分濃度、雜交和漂洗時(shí)間、緩沖 液成分和其pH及離子強(qiáng)度的條件。例如，當(dāng)使用相對(duì)短的寡核苷酸時(shí)， 優(yōu)選釆用低的嚴(yán)格條件。用于雜交的具體條件可以參考Joseph Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 以及M丄.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)。
DS oligo固定于基底上。優(yōu)選的基底包括合適的固體或半固體載 體，如膜、濾膜、芯片、載玻片、晶片、纖維、磁性或非磁性珠、凝 膠、管、板、大分子、微顆粒和毛細(xì)管?？梢岳猛ㄟ^(guò)紫外線照射的 化學(xué)結(jié)合或共價(jià)結(jié)合進(jìn)行這種固化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，DS oligo結(jié)合到經(jīng)修飾以包含環(huán)氧化合物或醛基的玻璃表面上或結(jié)合到涂 覆多溶素的表面上。此外，DS oligo通過(guò)連接劑(例如，乙二醇低聚物 和聯(lián)氨)結(jié)合到基底上?？梢酝ㄟ^(guò)如光刻法、噴墨法、機(jī)械點(diǎn)樣法及其 衍生技術(shù)的常規(guī)制造技術(shù)制造固定的DS oligo以制成陣列和用于特定 應(yīng)用的陣列。
根據(jù)本方法，優(yōu)選將延伸步驟中使用的dNTPs標(biāo)記。使用可通過(guò) 光語(yǔ)測(cè)量法、光化學(xué)測(cè)量法、生物化學(xué)測(cè)量法、生物電子測(cè)量法、免 疫化學(xué)測(cè)量法、電子測(cè)量法或化學(xué)測(cè)量法^r測(cè)的材料用以標(biāo)記。例如，
所述標(biāo)記包括但不限于如P"和s35的放射性同位素、化學(xué)發(fā)光化合物、 如熒光標(biāo)記和染料的光譜標(biāo)記以及磁性標(biāo)記。例如，染料包括但不限 于喹啉染料、三芳基曱烷染料、酞、偶氮染料和花菁染料。熒光標(biāo)記
包括zf旦不限于熒光素、藻紅素、羅丹明、麗絲胺Cy3和Cy5 (Pharmacia)。 才艮據(jù)本領(lǐng)域中的多種方法進(jìn)行標(biāo)記。
核酸樣品中的目標(biāo)核苷酸序列與固定于基底、優(yōu)選為固體載體上 的作為探針的DS oligo雜交，然后與目標(biāo)核苷酸序列雜交的DS oligo 使用dNTPs、優(yōu)選為熒光標(biāo)記的dNTPs和DNA聚合酶以模板依賴性 的方式延伸。優(yōu)選重復(fù)步驟(a)以使雜交反應(yīng)進(jìn)行到全部或多數(shù)DS oligo 與目標(biāo)核苷酸序列雜交的程度，從而使雜交結(jié)果更可再生。
根據(jù)所使用的標(biāo)記的類型以本領(lǐng)域中已知的多種方法證明雜交的 發(fā)生。例如，對(duì)于焚光標(biāo)記使用顯微鏡，優(yōu)選共聚焦熒光顯微鏡，用 這種設(shè)備^^測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度隨雜交的程度成比例地增強(qiáng)。通常，熒光 顯微鏡安裝有掃描設(shè)備，該設(shè)備形成雜交強(qiáng)度的定量二維圖象。用這 種設(shè)備檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度隨雜交的程度以及模板依賴性延伸的程度成 比例地增強(qiáng)。
現(xiàn)通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，明 顯的是，這些實(shí)施例目的在于更具體的示例性說(shuō)明，且如附屬權(quán)利要 求中所述的本發(fā)明的范圍不限于這些實(shí)施例或受這些實(shí)施例所限制。
實(shí)施例
實(shí)施例1:使用雙特異性(DS)寡核苷酸的PCR特異性本發(fā)明開(kāi)發(fā)的DS寡核苷酸用作擴(kuò)增小鼠細(xì)胞因子家族基因IL-19 和IL-1(3的目標(biāo)核苷酸序列的引物。使用DS引物擴(kuò)增IL-19和IL-l卩的 目標(biāo)核苷酸序列的方法和結(jié)果在下文中描述。
選擇下面的常規(guī)引物序列并用于與DS寡核苷酸比較PCR特異性
該實(shí)施例中使用的IL-19(500 bp)特異性常規(guī)引物為
IL19-5'-0 5'-GTCTCATCTGCTGCCCTTAAGTCTCTAGGAGAACT陽(yáng)3' (SEQIDNO:l);和
IL19-3'-0
5'-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGCTTTACAATAAGTTAG-3' (SEQ IDNO:2)。
該實(shí)施例中使用的IL-1(3(550 bp)特異性常規(guī)引物為
ILlb-5'-0 5'-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCAATACCCAAAGAAG-3' (SEQIDNO:3);以及
ILlb-3'-0 5'-AGACCTCAGTGCAGGCTATGACCAATTCATCCC-3' (SEQ ID NO:4)。
將本發(fā)明的DS寡核苷酸應(yīng)用到這些常規(guī)引物序列，以證明DS寡
性產(chǎn)物的主要問(wèn)題。
除了 5'部分和3'部分之間的包含多脫氧肌苷[poly(dl)]接頭的間隔 部分之外，下面的DS引物包含與上述常規(guī)引物相同的序列。設(shè)計(jì)DS
引物使其以如下方式包含5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分
5'-高Tm特異性部分的Tm高于3'-低Tm特異性部分的Tm,而間隔部分 在三個(gè)部分中具有最低的Tm。
該實(shí)施例中4吏用的IL-19(500 bp)的DS引物為
IL19-5' 5'-GTCTCATCTGCTGCCCTTAA匪TAGGAGAACT誦3' (SEQ IDNO:5);以及
IL19-3' 5'-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGIIIIICAATAAGTTAG-3' (SEQIDNO:6)，其中I為脫氧肌苷。
該實(shí)施例中使用的IL-1(3(550 bp)的DS引物為
ILlb-5' 5'-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCIiniCCAAAGAAG-3' (SEQIDNO:7);以及
ILlb-3' 5'-AGACCTCAGTGCAGGCTATGIIinTTCATCCC-3' (SEQ ID NO:8),其中I為脫氧肌苷。
以20 pi的終體積進(jìn)行目標(biāo)PCR擴(kuò)增，其包含2 (il (50 ng)從小鼠 系ICR的胎盤(pán)組織分離的基因組DNA、含有15 mM MgCl2的2 (il 10 x PCR反應(yīng)緩沖液(Roche)、 2 (il dNTP (dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP各 2 mM)、 1 )il 5' DS或常規(guī)引物(10 pM)、 1 pl 3' DS或常規(guī)引物(10 )iM) 以及0.5 pl Taq聚合酶(5單位&1; Roche)，將包含反應(yīng)混合物的管置于 預(yù)加熱(94。C)的熱循環(huán)儀，樣品在94。C變性5分鐘，接著進(jìn)行30個(gè)循 環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94。C下1分鐘、60。C下1分鐘、72°CT 1分鐘，然后 在72。C下溫育7分鐘。通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物且通過(guò)溴化乙錠染色來(lái)
檢測(cè)。還可以通過(guò)放射自顯影法或通過(guò)如銀染(Gottschlich等人，(1997) Res. Commun. Mol. Path. Pharm. 97, 237- 240; Kociok， N等人.(1998) Mol. Biotechnol. 9, 25-33)或者通過(guò)使用熒光標(biāo)記的寡核苷酸(Bauer D 等人，(1993) Nucleic Acids Res. 21, 42
和3 '-部分與模板退火的高嚴(yán)格條件下實(shí)現(xiàn)。同時(shí)，DS寡核苷酸的錯(cuò)
配容許性在盡管存在一個(gè)或多個(gè)、但是有限的堿基對(duì)錯(cuò)配而5'-和3'-部 分與模板退火的嚴(yán)格條件下實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明開(kāi)發(fā)的DS寡核苷酸的雙特異性通過(guò)被鑒定在小鼠胎 盤(pán)表達(dá)的新基因DEGIO的3'-RACE根據(jù)雜交特異性和錯(cuò)配容許性來(lái)評(píng) 價(jià),(Kim， YJ 等人,(2004) Annealing control primer system for identification of differentially expressed genes on agarose gels. BioTechniques 36:424-434; XM-129567)。為進(jìn)行評(píng)價(jià)，將兩部分中的 幾個(gè)核苷酸用其它核苷酸替換以與目標(biāo)模板序列錯(cuò)配。
該實(shí)施例中使用的5'-DEG10特異性DS引物為
DEG10-5'-108: 5'-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTCCGATG-3' (SEQIDNO: 9);
DEG10-5'-l03: 5'-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCiniICT^CGAT^-3' (SEQIDNO: 10);
DEG10-5'-102: 5'-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIIIIICTCC^ATG-3' (SEQIDNO: 11);
DEG10-5'-101: 5'-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIiniCTCCGATG-3' (SEQIDNO: 12);
DEG10-5'-15 8:5'-TGTA^TTATG^GT^TCQTCCinnCTCCGATG-3' (SEQIDNO: 13);
DEG10-5'-13 8: 5'-TGTAgTTTTG^GTTTC^TCCninCTCCGATG-3' (SEQIDNO: 14);以及
DEG10-5'-128 : 5'-TGTAGTTATGGGTATCCTCCIIIIICTCCGATG-3' (SEQEDNO: 15)，其中，替換的核苷酸下標(biāo)并加粗，且I為脫氧肌苷。
A:在高嚴(yán)格性下的PCR特異性的提高
如前述(Hwang, I.T等人,(2003) Annealing control primer system for improving specificity of PCR amplification. BioTechniqms 35:1180-1184),由小鼠品系ICR的17.5-dpc (E17.5)胎盤(pán)組織分離總 RNA并用于通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶的第一鏈cDNA的合成。在42'C下，使用總 RNA在包括如下成分的20 [d反應(yīng)體積中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1.5小時(shí)3嗎 總RNA、 4 |il 5 x反應(yīng)緩沖液(美國(guó)Promega)、 5 jil dNTPs (各2 mM)、 2 )il的10 jiM cDNA合成引物(oligo (dT)2。-連接物)、0.5 (il RNase抑制 劑(40單位/jil， Promega)以及1 (il逆轉(zhuǎn)錄酶(200單位/(il， Promega)。通 過(guò)加入180 )il超純H20稀釋第 一鏈cDNA。 cDNA合成《1物oligo (dT)fs-ACPl為5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIini(T)18-3',其中 I為脫氧肌苷。
在20 )il的最終體積中進(jìn)行DEGIO的3'-RACE ，其包含2 (il (30 ng) 稀釋的第 一鏈cDNA、包含15 mM MgCl2 (Roche)的2 (il 10 x PCR反應(yīng) 緩沖液、2 pi dNTP (dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP各2 mM)、 1 pi DEG10 特異性DS引物(10 ^M)之一、1 )il oligo (dT)15-ACP2 (10 jiM)以及0.5 )il Taq聚合酶(5單位/)il; Roche);將包含反應(yīng)混合物的管置于預(yù)加熱(94 。C)的熱循環(huán)儀，樣品在94。C變性5分鐘，接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè) 循環(huán)為94。C下1分鐘、68。C下1分鐘、72。C下1分鐘，然后在72。C下溫 育 7 分 鐘 。 oligo (dT)15-ACP2 為 5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIin(T)15-3',其中I為脫氧肌芬。
B. DS寡核香酸的錯(cuò)配容許性
除了退火溫度之外，釆用實(shí)施例2A中使用的用于DEG10的 3'-RACE的樣品DS引物、模板和PCR條件。在如下條件下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增94。C下5分鐘、60。C下3分鐘、72。C下3分鐘，如此一個(gè)循環(huán)； 接著29個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94。C下40秒、65。C下1分鐘、72。C下40 秒；以及在72 。C下最后延伸7分鐘。
結(jié)果，圖6A通過(guò)DEG10的3'-RACE呈現(xiàn)了 DS寡核苷酸引物的 高雜交特異性。完整無(wú)損的5'-DEG10特異性DS引物(DEG10-5'-108) 產(chǎn)生DEG10 3'-RACE的預(yù)期677-bp產(chǎn)物(泳道1)。與此相對(duì)，在5'部 分或3'部分具有錯(cuò)配序列的其它引物(DEG10-5'-103、 DEG10-5'-102、 DEG10-5'-101、 DEG10-5'-158、 DEG10-5'-138以及DEG10-5'-128)不產(chǎn) 生任何產(chǎn)物3'部分具有三個(gè)堿基錯(cuò)配(泳道2)、兩個(gè)堿基錯(cuò)配(泳道3) 或一個(gè)堿基錯(cuò)配(泳道4); 5'部分具有五個(gè)堿基錯(cuò)配(泳道5)、三個(gè)堿基 錯(cuò)配(泳道6)或兩個(gè)堿基錯(cuò)配(泳道7)。
這些結(jié)果證實(shí)DS引物的雙特異性在這種高的嚴(yán)格條件下不但可 以區(qū)分在3'端的錯(cuò)配堿基，而且還可以區(qū)分在5'端的錯(cuò)配堿基。
通常，因?yàn)?'端為通過(guò)DNA聚合酶延伸的區(qū)域，所以應(yīng)該與模板 完全互補(bǔ)的引物區(qū)域?yàn)?'端，因此最重要的是確保與正確的目標(biāo)序列 的退火的發(fā)生。同時(shí)，5'端引物在限定與目標(biāo)序列的退火特異性中的重 要性相對(duì)較低，且其可以修改以包含如限制性酶切位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列
的與模板不互補(bǔ)的另外序列(McPherson, MJ., Moller， S.G. (2000) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y.)。與此相比，通過(guò)由于其獨(dú)特結(jié)構(gòu)的雙特異性而可以辨認(rèn)5'端以 及3'端中錯(cuò)配堿基，證明了 DS引物的突出優(yōu)點(diǎn)。
圖6B通過(guò)DEGIO的3'-RACE示出了 DS寡核苦酸引物的錯(cuò)配容 許性。雖然在其5'端或3'端不含有或含有幾個(gè)錯(cuò)配核苷酸的DS引物 (DEG10-5'-108、 DEG10-5'-101、 DEG10-5'-128以及DEG10-5'-138)仍然 產(chǎn)生預(yù)期677 bp的DEG10 3'-RACE產(chǎn)物(泳道1、 4、 6和7)。與此相 比，其5'端或3'端含有多個(gè)錯(cuò)配核苷酸的其它引物(DEG10-5'-103、 DEG10-5'-102以及DEG10-5'-158)不產(chǎn)生任何產(chǎn)物(泳道2、 3和5)。這 些結(jié)果證實(shí)DS引物可以應(yīng)用到需要錯(cuò)配容許性的多種核苷酸序列的 擴(kuò)增。
總而言之，這些結(jié)果支持以下DS引物的原理
1) 只有當(dāng)5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分發(fā)生退火時(shí)， DS引物才延伸以合成與模板互補(bǔ)的核酸分子(泳道1);然而
2) 當(dāng)只有5'-高Tm特異性部分發(fā)生退火而3'-低Tm特異性部分不發(fā) 生退火時(shí)，DS引物不延伸，從而不合成與模板互補(bǔ)的核酸分子(泳道 2 4);以及
3) 即使3'-低Tm特異性部分的序列與模板完全配對(duì)，在高嚴(yán)格條件 下也不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部分的退火。關(guān)于退火部分，DS引物 與退火控制引物(ACP)明顯不同，退火控制引物(ACP)在起始PCR步驟 中只通過(guò)3'端部分的退火而延伸(Hwang, I.T等人，(20(B) Annealing
control primer system for improving specificity of PCR amplification. BioTechniques 35:1180-1184)。
實(shí)施例3:使用雙特異性(DS)寡核苷酸的單g辨認(rèn)
為證實(shí)DS寡核苷酸用于單堿基辨認(rèn)的雙特異性，用常規(guī)引物或 DS引物擴(kuò)增小鼠胎盤(pán)特異性同源框家族基因尸^/和兩個(gè)尸m 的cDNA在核苷酸水平的全部序列同源性為91%(Han, YJ.，等人，(2000) Identification and characterization of Psx2, a novel member of the Psx (placenta-specific homeobox) family.Gene 241:149-155)。 設(shè)計(jì)5'-引物以 通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)^咸基的差別來(lái)辨認(rèn)尸^/和尸m2 (圖7A)。然而，設(shè)計(jì) 3'-引物使其具有兩個(gè)尸&ycDNA的保守序列。尸雙/和/fe。特異性常規(guī) 和DS引物序列如下
Psxl-5'-10: 5'-AAGGAAGACATGCTGGTGATGGTGCTTCT^GCI-3' (SEQIDNO: 16);
Psx2-5'-10: 5'-AAGGAAGACATGCTGGTGATGGTGCTTCTQGCG-3' (SEQIDNO: 17);
Psxl-5'-l 1: 5'-AAGGAAGACATGCTGGTGATninTTCT^GC;i-3' (SEQ ID NO: 18);
Psx2-5'-11: 5'-AAGGAAGACATGCTGGTGATiniITTCTQGCW (SEQIDNO: 19);
Psxl-5'-40: 5'-TCTTGCACGATGGATGGGTGTGGATGAAT^TGA-3' (SEQIDNO: 20);
Psx2-5'-40: 5'-TCTTGCACGATGGATGGGTGTGGATGAATeTGA-3' (SEQIDNO: 21);
Psxl-5'-41 : 5'-TCTTGCACGATGGATGGGTGIiniGAAIQIGA-3' (SEQIDNO: 22);
Psx2-5'國(guó)41: 5'-TCTTGCACGATGGATGGGTGIiniGAAI0GA-3' (SEQ ID NO: 23);以及
Psx-3'-2: 5'-TTCATCCACACCCATCCATCIIIIIAGATCCCT-3' (SEQ ID NO: 24)，其中尸m/或尸m2特異性核苷酸下標(biāo)并加粗。
A. 第一鏈cDNA合成
使用實(shí)施例2中合成的小鼠胎盤(pán)第一鏈cDNA作為尸m cDNA的 3'-RACE和目標(biāo)PCR的原材料。
B. 使用ftx/和T^;^特異性DS引物的尸ay/和尸&y2的3'-RACE
在20 )il的終體積中進(jìn)行/tef/和P雙2的3'-RACE，其包含2 (il (30 ng)稀釋的第 一鏈cDNA、包含15 mM MgCl2的2 pl 10 x PCR反應(yīng)緩沖 液(Roche)、 2 jil dNTP (dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP各2 mM)、 1 jil 5'-尸&y7 或5'-尸"2特異性DS或常規(guī)引物(10 iiM)之一、1 (il oligo (dT),5-ACP2 (10 )iM)以及0.5 |il Taq聚合酶(5單位V1; Roche);將包含反應(yīng)混合物 的管置于預(yù)加熱(94。C)的熱循環(huán)儀；樣品在94。C變性5分鐘，接著進(jìn) 行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94。C下1分鐘、60 65。C下1分鐘、72。C下 1分鐘，然后在72。C下溫育7分鐘。
C.使用尸&y/和Pay2特異性DS引物的尸m/和化x2的目標(biāo)核酸
擴(kuò)增
在20 (il的終體積中進(jìn)行尸m/和Ax2的目標(biāo)PCR擴(kuò)增，其包含2 (30 ng)稀釋的第 一鏈cDNA、包含15 mM MgCl2的2 10 x PCR反 應(yīng)緩沖液(Roche)、 2 iildNTP(dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP各2mM)、 1 |il 5'-尸m7或5'-7^x2特異性DS或常規(guī)引物(10 jiM)之一、1 |il Psx-3'-2 (10 (iM)以及0.5 pl Taq聚合酶(5單位4il; Roche),將包含反應(yīng)混合物 的管置于預(yù)加熱(94。C)的熱循環(huán)儀；樣品在94。C變性5分鐘，接著進(jìn) 行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94。C下1分鐘、6(K65。C下1分鐘、72。C下 1分鐘，然后在72。C下溫育7分鐘。
結(jié)果，圖7B示出了通過(guò)5'-Zte^或5'-尸m2特異性引物產(chǎn)生的 3'-RACE和目標(biāo)PCR的產(chǎn)物。因?yàn)閮蓚€(gè)尸mcDNA由于靠近其3'-端的 29-bp的缺失或插入而彼此不同，所以期望通過(guò)其3'-RACE擴(kuò)增大小差 別29-bp的產(chǎn)物。使用尸&y/或尸m2特異性DS引物Psxl-5'-41和 Psx2-5'-41的尸雙cDNA的3'-RACE各自產(chǎn)生分別對(duì)應(yīng)于預(yù)期大小 311-bp (泳道l)和282-bp (泳道2)的單一條帶。由3'-RACE產(chǎn)生的產(chǎn)物 的后續(xù)序列分析證實(shí)5'-尸&y/和5'-Zfc。特異性引物分別擴(kuò)增尸m1和 尸^2 cDNA。與此相比，不符合DC寡核苷酸原理的常規(guī)引物(Psxl-5'-40 和Psx2-5'-40)不區(qū)分兩個(gè)尸&ycDNA(泳道3和4)。
這些結(jié)果說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的DS引物可以辨認(rèn)單堿基錯(cuò)配。因此， DS寡核苷酸可以用于鑒定點(diǎn)突變或單核苷酸多態(tài)性分型。
實(shí)施例4:使用雙特異性(DS)寡核苷酸從cDNA庫(kù)直接測(cè)序目標(biāo) cDNA
多數(shù)鑒定并分離新cDNA的嘗試導(dǎo)致獲得只由部分mRNA的序列 表示的克隆。 一旦鑒定了部分序列，通常可以通過(guò)典型的cDNA文庫(kù) 篩選或如RACE (cDNA末端快速擴(kuò)增)的基于PCR的方法獲得轉(zhuǎn)錄物 的剩余部分，然后測(cè)序所獲得的cDNA。因此，全部目前的方法是獲得 轉(zhuǎn)錄物剩余部分的序列信息的前提步驟。如果缺失序列信息直接由目 標(biāo)細(xì)胞產(chǎn)生的一組cDNA獲得，那么就可以完全繞過(guò)這些耗時(shí)的前提 步驟，且目標(biāo)cDNA的序列可以由粗生物樣品直接測(cè)定。
本發(fā)明的DS寡核苷酸用作使用胎盤(pán)第一鏈cDNA庫(kù)直接測(cè)序小 鼠胎盤(pán)特異性同源框基因尸mcDNA的引物。在此描述用于直接測(cè)序來(lái) 自胎盤(pán)cDNA庫(kù)的胎盤(pán)特異性基因cDNA的方法和結(jié)果。使用與實(shí)施 例3中使用的相同的引物5'-Psx特異性DS。其為Psxl-5'-l 1 、Psx2-5'-l 1 、 Psxl-5'-41和Psx2-5'-41。
A. 第一鏈cDNA合成
使用實(shí)施例2中合成的小鼠胎盤(pán)第一鏈cDNA作為尸雙cDNA直 接測(cè)序的模板。
B. 使用Pm特異性DS引物直接測(cè)序來(lái)自胎盤(pán)cDNA庫(kù)的尸m cDNA
在20 pl的終體積中進(jìn)行循環(huán)測(cè)序反應(yīng)，其包含13 )il (150 ng)稀釋 的第 一鏈cDNA、 2 )al的ABI PRISM Big Dye Terminator Reaction mix (Applied Biosystems，美國(guó))、3 |il的5 x觀'J序纟爰沖液(Applied Biosystems) 以及1.6 pi的5'-Psxl-或5'-Psx2-特異性DS引物(l iiM)之一，將包含反 應(yīng)混合物的管置于預(yù)加熱(94。C)的熱循環(huán)儀；樣品在94。C變性5分鐘，
接著進(jìn)行40 50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為9fC下10秒鐘、50 6(TC下3分 鐘、60 65。C下4分鐘。測(cè)序產(chǎn)物以如下步驟純化加入2 pl的3 M乙 酸鈉(pH4.6)和50pl新鮮的冷的100%EtOH; 2)在-75。C下放置30分 鐘；3)在13,000 g離心15-30分鐘并除去上清液；4)用200 [il的70% EtOH洗滌；5)在13,000 g離心15~30分鐘并小心地除去上清液，干 燥。在恰好將測(cè)序產(chǎn)物加入ABI PRISM 3100基因分析儀之前，將片狀 沉淀物在10 |il的HiDi甲酰胺中重懸。
令人吃驚地，尸雙DS引物精確地測(cè)序其特異性/fercDNA。換句話 說(shuō)，Ax/特異性DS引物(Psxl-5'-41)只測(cè)序尸&y/ cDNA, /fc^特異性 DS引物(Psx2-5'-41)只測(cè)序Ax2 cDNA(圖8)。尸雙2中的29-bp缺失區(qū) 域用黑棒示出。與此相比，不符合DS寡核苷酸原理的常規(guī)引物 (Psxl-5'-40和Psx2-5'-40)不區(qū)分兩個(gè)尸mcDNA。
認(rèn)單堿基錯(cuò)配。
實(shí)施例5:使用雙特異性(DS)寡核苷酸的多重PCR
為了證實(shí)DS寡核苷酸引物在多重PCR中的擴(kuò)增，用DS引物擴(kuò) 增九個(gè)不同的細(xì)胞因子家族基因。在此描述使用DS引物的多重PCR 擴(kuò)增的方法和結(jié)果。設(shè)計(jì)細(xì)胞因子家族基因特異性DS引物以通過(guò)使用 各細(xì)胞因子基因的最長(zhǎng)外顯子序列產(chǎn)生50 bp的梯度。
該實(shí)施例中4吏用的用于IL-3 (200 bp)的DS引物為
IL3畫(huà)5' 5'-GCTGCCAGGGGTCTTCATTCmiICTGGATGA-3' (SEQ ID NO: 25);以及
IL3-3' 5 '誦GGCCATGAGGAACATTCAGAIIinGGTGCTCT-3' (SEQ ID NO: 26)。
該實(shí)施例中使用的用于IL-15(250 bp)的DS引物為
ILl5-5' 5'-ATGTAGCAGAATCTGGCTGCinnATGTGAGG-3' (SEQ ID NO: 27);以及
ILl5-3' 5'-ATGTGATCCAAGTGGCTCATIiniCCTTGTTAGG-3' (SEQ ID NO: 28)。
該實(shí)施例中使用的用于IL-18(300 bp)的DS引物為
ILl8-5' 5'-AGGAAATGGATCCACCTGAAIIIIITGATGATATA-3' (SEQ ID NO: 29);以及
ILl8-3' 5'-ATGGAAATACAGGCGAGGTCimiAAGGCGCA-3' (SEQ ID NO: 30)。
該實(shí)施例中4吏用的用于IL-25(350 bp)的DS引物為
IL25-5' 5'畫(huà)AGCTCTCCAAGCTGGTGATCIiniCAAGGCGG陽(yáng)3' (SEQ ED NO: 31);以及
IL25-3' 5'-GAGCTGCCCTGGATGGGGTTIiniGTGGTCCT-3' (SEQ ID NO: 32)。
該實(shí)施例中4吏用的用于IL-2(400 bp)的DS引物為
IL2誦5' 5'畫(huà)CTCTGACAACACATTTGAGTGCimiCGATGATGAG-3' (SEQIDNO: 33);以及
IL2-3'5'-GTGCTGTCCTAAAAATGACAGAIIIIIGAGCTTATTT-3' (SEQIDNO: 34)。
該實(shí)施例中4吏用的用于IL-6(450 bp)的DS引物為
IL6-5' 5'-CCAATGCTCTCCTAACAGATAAIIIIIAGTCACAGAA-3' (SEQIDNO: 35);以及
IL6-3'5'-AGGTAAACTTATACATTCCAAGAAAIiniTGGCTAGG-3' (SEQIDNO: 36)。
該實(shí)施例中4吏用的用于IL-19(500 bp)的DS引物為
JL19-5' 5'-GTCTCATCTGCTGCCCTTAAIIIIITAGGAGAACT陽(yáng)3' (SEQ ID NO: 5);以及
EL19-3' 5'-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGIiniCAATAAGTTAG-3' (SEQIDNO: 6)。
該實(shí)施例中使用的用于IL-l(3(550 bp)的DS引物為
ILlb-5' 5 '-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCnniCCAAAGAAG-3' (SEQIDNO: 7);以及
ILlb-3' 5'-AGACCTCAGTGCAGGCTATGiniITTCATCCC-3' (SEQ ID NO: 8)。
該實(shí)施例中4吏用的用于IL-10(600 bp)的DS引物為
IL10-5' 5'畫(huà)AAGGCCATGAATGAATTTGAiniITCATCAACTG-3' (SEQ ID NO: 37);以及
IL10-3' 5'誦TGACAGTAGGGGAACCCTCTIIinGCTGCAGG-3' (SEQ ID NO:38)。
A. ^f吏用 一對(duì)細(xì)胞因子家族基因特異性DS引物的單重PCR
在20 pl的終體積中進(jìn)行各細(xì)胞因子家族基因的單一 目標(biāo)PCR擴(kuò) 增，其包含2pl(50ng)的小鼠基因組DNA、 2 |al包含15 mM MgCl2的 10 x PCR反應(yīng)緩沖液(Roche)、 2 (il的dNTP (dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP 各2mM)、 ljul的各細(xì)胞因子家族基因特異性5'DS引物(10(aM)、 1 )il 的各細(xì)胞因子家族基因特異性3' DS引物(IO (iM)以及0.5 ^的Taq聚 合酶(5單位/pl; Roche)，將包含反應(yīng)混合物的管置于預(yù)加熱(94。C)的熱 循環(huán)儀，樣品在94。C變性5分鐘，接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為 94。C下1分鐘、60 65。C下1分鐘、72。C下1分鐘，然后在72。C下溫育 7分鐘。
B. 使用九對(duì)細(xì)胞因子家族基因特異性DS引物的多重PCR
通過(guò)使用9對(duì)細(xì)胞因子家族基因特異性DS引物在單個(gè)管中進(jìn)行多 重PCR,反應(yīng)混合物的終體積為50 其包含IOO ng的小鼠基因組 DNA、 5 )il包含15 mM MgCl2的10 x PCR反應(yīng)緩沖液(Roche)、 5 的 dNTP(dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP各2mM)、 l(il的各細(xì)胞因子家族 基因特異性5' DS引物(0.2~5 (iM)、 1 pi的各細(xì)胞因子家族基因特異性 3'DS引物(0.5~5 pM)以及0.5 (al的Taq聚合酶(5單位/pl; Roche),將 包含反應(yīng)混合物的管置于預(yù)加熱(94。C)的熱循環(huán)儀，該P(yáng)CR條件為 94。C下5分鐘、50。C下3分鐘、72。C下3分鐘，如此一個(gè)循環(huán)；接著 進(jìn)行29個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94。C下40秒鐘、60。C下1分鐘、72。C下 40秒鐘；在72。C下最后延伸5分鐘的循環(huán)。
如圖9中所示，多重PCR產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于9個(gè)不同細(xì)胞因子基因產(chǎn)物 的預(yù)期大小200 bp 600 bp的多條帶(圖4，泳道1)。各單重PCR擴(kuò)增 產(chǎn)生分別對(duì)應(yīng)于200 bp的IL-3 (圖4,泳道2)、 250 bp的IL-15 (圖4, 泳道3)、 300 bp的IL-18 (圖4，泳道4)、 350 bp的IL-25 (圖4，泳道 5)、 400 bp的IL-2 (圖4，泳道6)、 450 bp的IL-6 (圖4，泳道7)、 500 bp 的IL-19 (圖4,泳道8)、 550 bp的IL-l卩(圖4，泳道9)以及600 bp的 IL-10(圖4，泳道10)。
因此，可以理解，通過(guò)本發(fā)明開(kāi)發(fā)的DS引物可以成功地應(yīng)用于多 重PCR。 DS寡核苷酸的獨(dú)特結(jié)構(gòu)可以克服任何常規(guī)多種PCR的共同 問(wèn)題，即引物干擾和二聚體形成。
實(shí)施例6:使用雙特異性(DS)寡核苷酸的錯(cuò)配容許性檢測(cè)人偏肺病
毒
為證實(shí)DS寡核苷酸引物在錯(cuò)配容許性中的應(yīng)用，使用DS引物檢 測(cè)臨床樣品中的人偏肺病毒(hMPV)。在此描述使用DS引物檢測(cè)人偏 肺病毒的方法和結(jié)果。該實(shí)施例不會(huì)構(gòu)成本發(fā)明檢測(cè)特定病毒的應(yīng)用 的限制。
基于通過(guò)基于排列所有可用的hMPV分離株的序列而產(chǎn)生的融合 糖蛋白(F)基因保守區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)DS引物(參見(jiàn)表1)。為容許這些分離株
的遺傳多樣性，基于以下標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)引物(a)盡管存在一個(gè)或多個(gè)、但 是有限的堿基對(duì)錯(cuò)配，但是保守區(qū)域的長(zhǎng)度至少為30個(gè)核苷酸(表1); (b)保守區(qū)域中的多數(shù)錯(cuò)配序列優(yōu)選位于DS引物中的間隔部分(例如， hMPV 5'-585、 hMPV 3'-698和hMPV 3'-1007); (c)另外，錯(cuò)配的核苷酸 位于5'-端部分中，其可以用如脫氧肌苷的通用石威基替換(例如，hMPV 3'-698和hMPV 3'-1007);以及(d) 3'-端部分中的一個(gè)或兩個(gè)錯(cuò)配核苷 酸可以用簡(jiǎn)并核苷酸或通用石威基替換(例如，hMPV 3'-1007 )。
表l.基于所有可用hMPV分離抹的融合糖蛋白(F)基因的保守區(qū)域 的hMPV特異性DS寡核苷酸引物
序列
分離林號(hào)
病毒序歹'J《
引物(585):
AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAGgTTgCTAAATGTTG' AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAG^T^CTAAATGTTG- AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAG^T^CTAAATGTTG-'AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAG^TT工CTAAATGTTG. 'AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAG^TT￡CTAAATGTTG. AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAGGTTTCTAAATGTTG'
1
3
4 1 9 14
5'—AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAIIII工CTAAATGTTG—3'
病毒序列、
3'-引物(698):
......AACAT2AgTTTTAT工TG衛(wèi)CCTGCAGM;GTTGGCATGT"…
......AACAT￡AgTTTTAT5TG￡CCTGCAGATGTTGGCATGT'…'
......AACAT工A^TTTTATgTG2CCTGCAGATGTTGGCATGT
......AACAT￡A§TTTTJVr￡TGICCTGCAGAa:GTTGGCATGT…"
......AaCAT5A^TTTTAT2TG工CCTGCAGATGTTGGCATGT
......AACAT2A^TTTTAT2TG^CCTGGRGATGTTGGCATGT
......AACAT￡A^TTTTAT^TGZCCTGCAGATGTTGGCATGT.…'
5' —AACATCAITTTTATITGTCCTGCAI工:riITGGCATGT-3'
4 3 12
2
3 3
5
病毒序列乂
3'-引物(1007):
......TTGA2TG￡TCAGC^ACATTgAT^CC^GCIGCTGTGTC-
......T T GAgT G￡TCAGC^ACAT TgAT5CC工GC工GCT GT GTC'
......TTGA工TG2TCAGC^ACATTgAT2CC工GC^GCTGTGTC'
......T T GA工T G￡TCAG CgACAT T￡AT￡CC^GC2GCT GT GT C
......TTGA工TG工TCAGC^ACATTgAT2CC^GC工GCTGTGTC.
......TTGA2TGgrCAGC^ACATT^AT工CC工GC工GCTGTGTC.
......T T GA工T GgT CAGC^ACAT T^AT工CC93c5GCTGT GT C■
5'-TTGAITGCTCAGCIACATTGATI工I工工CWGCTGTGTC-
2
7
8 1
1
9
2
* hMPV分離林之間的遺傳多樣性表示為加下劃線的核苦酸 該實(shí)施例中使用的hMPVF基因的特異性DS引物為 hMPV 5'-585
5'曙AGCTTCAGTCAATTCAACAGAAIiniCTAAATGTTG-3' (SEQ ID NO: 39);
hMPV 3'-698 5'-AACATCAITTTTATITGTCCTGCAimiTGGCATGT-3' (SEQIDNO: 40);以及
hMPV 3,-1007
5'畫(huà)TTGAITGCTCAGCIACATTGATninCWGCTGTGTC-3' (SEQ ID NO: 41),
其中W可以為A或T,且I為脫氧肌苷。
根據(jù)制造商的操作說(shuō)明(RNAzol LS; Tel-Test公司)使用脂Azol B 法提取病毒總RNA。在42。C下，使用病毒總RNA在包括如下成分的 20 fil反應(yīng)體積中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1.5小時(shí)以合成cDNA: 5 (il總RNA(大 約100 ng)、 4 |il 5 x反應(yīng)緩沖液(美國(guó)Promega)、 5 (il dNTPs (各5 mM)、 2 |il的10 (iM隨機(jī)六脫氧核苷酸、0.5 pi RNase抑制劑(40單位/(il， Promega)以及1 (il莫洛尼鼠類白血病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(200單位/fil, Promega)。
在20 pi的終體積中進(jìn)行hMPV F基因的目標(biāo)PCR擴(kuò)增，其包含2 pi (30 ng)第 一鏈cDNA、 2 (il包含15 mM MgCl2的10 x PCR反應(yīng)緩沖 液(Roche)、 2 (il的dNTP(dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP各2mM)、 1 |J 5' hMPV特異性DS引物(hMPV 5'-585; 10 ^M)、 1 3' hMPV特異性 DS引物(hMPV 3'-698或hMPV 3'-1007; 10 [iM)以及0.5 |il的Taq聚合 酶(5單位/^il; Roche)，將包含反應(yīng)混合物的管置于預(yù)加熱(94。C)的熱循 環(huán)儀，樣品在94。C變性5分鐘，接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94 。C下1分鐘、60 65。C下1分鐘、72。C下1分鐘，然后在72。C下溫育7 分鐘。
如圖10B中所示，各對(duì)hMPV特異性DS引物(hMPV 5'-585和 hMPV 3'-698以及hMPV 5'-585和hMPV 3'-1007)產(chǎn)生分別對(duì)應(yīng)于 150-bp和459-bp預(yù)期大小的單一條帶(泳道1和2)。后續(xù)序列分析證實(shí)
其為hMPV融合糖蛋白(F)基因的部分序列。與此相比，在沒(méi)有模板的 陰性對(duì)照PCR中這些引物不產(chǎn)生產(chǎn)物(泳道4和5)。作為陽(yáng)性對(duì)照，使 用人(3-肌動(dòng)蛋白特異性引物對(duì)(泳道3)。
這些結(jié)果表明DS引物可以用于檢測(cè)來(lái)自具有呼吸性傳染病的患 者的hMPV。因此，可以推出DS寡核普酸可以在PCR擴(kuò)增中用作引 物或在寡核香酸芯片中作為探針，其可以應(yīng)用到在本領(lǐng)域中所遇到的 所有可能的情況中。
實(shí)施例7:使用固定有DS Oligo的微陣列檢測(cè)目標(biāo)核苷酸序列
通過(guò)DNA合成4義(Expedite 8900核酸合成系統(tǒng)，Applied Biosystems (ABI))根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作說(shuō)明合成與目標(biāo)核酸分子的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的DS oligo。將合成的DS oligo固定于玻璃載玻片上形成微陣列。然后，將 包含50~200 ng的DNA樣品、5 jil的10 x PCR緩沖液(Promega)、 5 pl 的15 mM MgCl2、 5 pi萸光標(biāo)記的dNTP (dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP 各2 mM)以及0.5 (il的T叫聚合酶(5單位/(il; Promega)的模板依賴性 延伸反應(yīng)混合物加到微陣列上，然后將微陣列置于預(yù)加熱(94。C)的熱循 環(huán)儀。根據(jù)如下熱循環(huán)進(jìn)行模板依賴性延伸反應(yīng)在94。C變性5分鐘， 接著15 50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94。C下1分鐘、50 65。C下1~3分鐘、 60 72。C下1 4分鐘，然后在72。C下延伸5分鐘。接著模板依賴性延伸 反應(yīng)，漂洗延伸的DS oligo并利用微陣列掃描儀通過(guò)其熒光圖檢測(cè)， 然后分析熒光圖。
實(shí)施例8:使用DS寡核苷酸的SNP(單核苷酸多態(tài)性)分型
在3'-低Tm特異性部分的中心替換一個(gè)多態(tài)性堿基(詢點(diǎn))，并通過(guò)
DNA合成儀(Expedite 8卯0核酸合成系統(tǒng)，Applied Biosystems (ABI)) ^^據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作i^明合成DS oligo。將合成的DS oligo固定于玻璃載玻 片上形成微陣列。然后，將包含50 200ng的DNA樣品、5 |il的10x PCR緩沖液(Promega)、 5^1的15mMMgCl2、 5 |il熒光標(biāo)記的dNTP (dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP各2 mM)以及0.5 pl的Taq聚合酶(5單 位/pl; Promega)的模板依賴性延伸反應(yīng)混合物加到微陣列上，然后將 微陣列置于預(yù)加熱(94。C)的熱循環(huán)儀。根據(jù)如下熱循環(huán)進(jìn)行模板依賴性 延伸反應(yīng)在94。C變性5分鐘，接著15 50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94°C 下1分鐘、50 65。C下1 3分鐘、60 72。C下1 4分鐘，然后在72。C下 延伸5分鐘。接著模板依賴性延伸反應(yīng)，漂洗延伸的DS oligo并利用 微陣列掃描儀通過(guò)其焚光圖檢測(cè)，然后分析熒光圖。
雖然已經(jīng)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)該理解，在本發(fā)明的 實(shí)質(zhì)內(nèi)的變化和修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員變得顯而易見(jiàn)，本發(fā)明的 范圍通過(guò)附屬權(quán)利要求和其等效物確定。
權(quán)利要求
1、一種使用雙特異性寡核苷酸通過(guò)模板依賴性延伸反應(yīng)合成核酸分子的方法，其包括如下步驟(a)使雙特異性寡核苷酸與模板核酸分子退火，其中，所述雙特異性寡核苷酸具有三個(gè)部分，其中5′-高Tm特異性部分具有與模板核酸的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，間隔部分包含至少兩個(gè)通用堿基，且3′-低Tm特異性部分具有與模板核酸的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列；5′-高Tm特異性部分的Tm高于3′-低Tm特異性部分的Tm，間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm；間隔部分在5′-高Tm特異性部分和3′-低Tm特異性部分與模板核酸退火的條件下形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)，其中在不會(huì)只發(fā)生3′-低Tm特異性部分的退火的條件下進(jìn)行退火；以及(b)延伸所述雙特異性寡核苷酸以合成與模板核酸互補(bǔ)的核酸分子。
2、 一種由DNA或核酸混合物選擇性擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列的方法， 其包括使用包括至少一種雙特異性寡核苷酸的引物對(duì)，通過(guò)進(jìn)行至 少兩個(gè)循環(huán)的引物退火、引物延伸和變性來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)核酸；其中，所 述雙特異性寡核苷酸具有三個(gè)部分，其中5'-高Tm特異性部分具有與目 標(biāo)核酸的 一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核香酸序列，間隔部分 包含至少兩個(gè)通用堿基，且3'-低Tm特異性部分具有與目標(biāo)核酸的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，5'-高Tm特異性部分的 Tm高于3'-低Tm特異性部分的Tm,間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm;間隔部分在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分與目標(biāo)核酸 退火的條件下，形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)；其中在不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部分的退火的條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)中的退火。
3、 一種在同一反應(yīng)中使用兩對(duì)或更多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或更多 個(gè)目標(biāo)核酸序列的方法，其包括使用其中引物對(duì)的至少一種引物為 雙特異性寡核香酸的兩個(gè)或更多個(gè)引物對(duì)通過(guò)進(jìn)行至少兩個(gè)循環(huán)的引 物退火、引物延伸和變性來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸序列，其特征在于，所述 雙特異性寡核苷酸具有三個(gè)部分，其中5'-高Tm特異性部分具有與目標(biāo) 核苷酸序列的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，間隔部分包含至少兩個(gè)通用堿基，且3'-低Tm特異性部分具有與目標(biāo)核苷酸 序列的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，5'-高Tm特異 性部分的Tm高于3'"氐Tm特異性部分的Tm，間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm;間隔部分在5'-高Tm特異性部分和3W氐Tm特異性部分 與目標(biāo)核苷酸退火的條件下形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)；其中在不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部分的退火的條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)中的退火。
4、 一種使用雙特異性寡核苷酸由DNA或核酸的混合物測(cè)序目標(biāo) 核酸分子的方法，其包括如下步驟(a)使用所述雙特異性寡核苷酸作為測(cè)序引物，通過(guò)進(jìn)行至少兩個(gè) 循環(huán)的引物退火、引物延伸和變性來(lái)合成與所測(cè)序的目標(biāo)核酸分子互 補(bǔ)的核酸分子，其中，所述雙特異性寡核苷酸具有三個(gè)部分，其中5'-高Tm特異性部分具有與目標(biāo)核酸分子的 一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交 的雜交核普酸序列，間隔部分包含至少兩個(gè)通用堿基，且3'-低Tm特異 性部分具有與目標(biāo)核酸分子的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，5'-高Tm特異性部分的Tm高于3'—氐Tm特異性部分的Tm， 間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm;間隔部分在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分與目標(biāo)核酸分子退火的條件下形成非堿基配 對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)，其中在不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部分的退火的條件下進(jìn)行合成反應(yīng)中的退火；以及(b) 測(cè)定合成的互補(bǔ)核酸分子的核苷酸序列。
5、 一種通過(guò)雙特異性寡核香酸的模板依賴性延伸反應(yīng)檢測(cè)具有遺 傳多樣性的核酸分子的方法，其包括如下步驟(a)使所述雙特異性寡核苷酸與模板核酸分子退火，其中，所述雙 特異性寡核苷酸具有三個(gè)部分，其中5'-高Tm特異性部分具有與模板核 酸的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，間隔部分包含 至少兩個(gè)通用堿基，且3'-低Tm特異性部分具有與模板核酸的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，5'-高Tm特異性部分的Tm高于3'-低Tm特異性部分的Tm，間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm;間隔部分在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分與模板核酸退火 的條件下形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)，其中在不會(huì)只發(fā)生3'-低Tm特異性部分的退火的條件下進(jìn)行退火，且在5'-高L特異性部分和/或3'-低Tm特異性部分與其目標(biāo)位點(diǎn)具有一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配堿基時(shí)進(jìn)行退火；(b)延伸所述雙特異性寡核苷酸，以合成與模板互補(bǔ)的核酸分子；以及(c) 檢測(cè)所述雙特異性寡核苷酸的模板依賴性延伸的發(fā)生。
6、 一種通過(guò)雙特異性寡核苷酸的模板依賴性延伸反應(yīng)來(lái)檢測(cè)核酸 樣品中的目標(biāo)核苷酸序列的方法，其包括如下步驟 (a) 延伸固定于基底上作為探針的所述雙特異性寡核苷酸，其包括 至少一個(gè)循環(huán)的雜交、模板依賴性延伸和變性，其中通過(guò)使所述雙特 異性寡核苷酸與核酸樣品接觸而進(jìn)行雜交，其中，所述雙特異性寡核苷酸具有三個(gè)部分，其中5'-高Tm特異性部分具有與目標(biāo)核苷酸序列的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，間隔部分包含至少兩個(gè)通用i威基，且3'-低Tm特異性部分具有與目標(biāo)核苷酸序列的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，5'-高Tm特異性部分的Tm 高于3'-低Tm特異性部分的Tm，間隔部分在三個(gè)部分中具有最低的Tm; 間隔部分在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分與目標(biāo)核苷酸序 列退火的條件下形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)，其中在不會(huì)只發(fā)生3'-低 Tn、特異性部分的雜交的條件下進(jìn)行雜交；以及(b) 分析模板依賴性延伸的發(fā)生。
7、根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述間隔部分 中的通用堿基選自包括脫氧肌苷、肌苷、7-脫氮-2'-脫氧肌苷，2-氮-2'-脫氧肌普、2'-OMe肌苦、2'-F肌苦、脫氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、 2'-OMe 3-硝基吡咯、2'-F 3-硝基吡咯、1-(2'-脫氧-p-D-呋喃核糖基)-3-硝 基吡咯、脫氧5-硝基口引咮、5-硝基巧l哚、2'-OMe 5-硝基吲哚、2'-F 5-硝基口引咮、脫氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脫氧4-氨基苯并 咪唑、4-氨基苯并咪唑、脫氧水粉蕈素、2'-F水粉蕈素、2'-F4-硝基苯 并咪唑、PNA-5-硝基吲哚、PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基 苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、嗎啉代-5-硝基吲哚、嗎啉代-水粉蕈素、 嗎啉代-肌香、嗎啉代-4-硝基苯并咪唑、嗎啉代-3-硝基吡咯、氨基磷酸 酯-5—硝基p引哚、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌苷、氨基磷酸酯 -4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2'-0-甲氧基乙基肌苷、2'0- 甲氧基乙基水粉蕈素、2'-0-曱氧基乙基5-硝基吲哚、2'-0-曱氧基乙基 4-硝基苯并咪唑、2'-0-曱氧基乙基3-硝基吡咯及其組合的組。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述通用堿基為脫氧肌苷、 1-(2'-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯或5-硝基吲哚。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述通用堿基為脫氧肌苷。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述間隔部 分包含具有通用堿基的連續(xù)核苷酸。
11、 根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述5'-高Tm特異性部分比所述3'-低Tm特異性部分長(zhǎng)。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述3'-低Tm 特異性部分具有與模板核酸的一個(gè)位點(diǎn)完全互補(bǔ)以與其雜交的雜交核 香酸序列。
13、 根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述5'-高Tm 特異性部分的長(zhǎng)度為15 40個(gè)核苷酸。
14、 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述5'-高Tm特異性部 分的長(zhǎng)度為15 25個(gè)核苷酸。
15、 根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述間隔部 分的長(zhǎng)度為至少3個(gè)核苷酸。
16、 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述間隔部 分的長(zhǎng)度為3 10個(gè)核苷酸。
17、 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述3'-低Tm特異性部分的長(zhǎng)度為3 15個(gè)核苷酸。
18、 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述5'-高Tm 特異性部分的長(zhǎng)度為15 25個(gè)核苷酸、所述間隔部分的長(zhǎng)度為3 10個(gè) 核芬酸、且所述3'-低Tm特異性部分的長(zhǎng)度為3 15個(gè)核苷酸。
19、 根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述5'-高Tm 特異性部分的Tm在40。C 8(TC的范圍內(nèi)。
20、 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述3'-低L 特異性部分的Tm在1(TC 4(TC的范圍內(nèi)。
21、 根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述間隔部 分的Tm在3 °C 15 °C的范圍內(nèi)。
22、 根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在45。C 68。C 的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行退火。
23、 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其中，通過(guò)重復(fù)其中所述 雙特異性寡核苦酸退火和延伸步驟后接著變性步驟的模板依賴性延伸 反應(yīng)的方法完成目標(biāo)核酸序列的合成。
24、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，根據(jù)聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)進(jìn)行所述擴(kuò)增。
25、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述待測(cè)序的目標(biāo)核酸 分子包含于基因組DNA或一組cDNA中。
26、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述具有遺傳多樣性的 核酸分子為呈現(xiàn)遺傳多樣性的病毒的核酸。
27、 一種用于通過(guò)模板依賴性延伸反應(yīng)合成核酸分子的雙特異性 寡核苷酸，其由以下通式表示<formula>formula see original document page 8</formula>其中，Xp表示5'-高Tm特異性部分，該部分具有與模板核酸的一 個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苦酸序列，Yq表示包含至少兩個(gè) 通用堿基的間隔部分，Zf表示3'-低Tm特異性部分，該部分具有與模板核酸的一個(gè)位點(diǎn)基本互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列，p、 q和r表 示核苷酸的數(shù)目；以及X、 Y和Z為脫氧核苷酸或核苷酸；5'-高Tm特 異性部分的Tm高于3M氐Tm特異性部分的Tm，且在三個(gè)部分中間隔部 分具有最低的Tm;間隔部分在5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性 部分與模板核酸退火的條件下形成非堿基配對(duì)的泡狀結(jié)構(gòu)，使5'-高Tm特異性部分從而根據(jù)與模板核酸的退火特異性而與3'-低Tm特異性部分分開(kāi)，因此寡核苷酸的退火特異性由5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm 特異性部分雙重限定，從而提高了寡核苷酸的整體退火特異性。
28、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的雙特異性寡核苷酸，其中，所述間隔 部分中的通用i咸基選自包括脫氧肌苷、肌苦、7-脫氮-2'-脫氧肌苷，2-氮-2'-脫氧肌苷、2'-OMe肌苦、2'-F肌苷、脫氧3-硝基吡咯、3-硝基吡 咯、2'-OMe 3-硝基吡咯、2'-F 3-硝基吡咯、l-(2'-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脫氧5-硝基。引哚、5-硝基吲哚、2'-OMe5-硝基吲哚、2'-F 5-硝基巧l哚、脫氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脫氧4-氨基苯并 咪唑、4-氨基笨并咪唑、脫氧水粉蕈素、2'-F水粉蕈素、2'-F4-硝基苯 并咪唑、PNA-5-硝基吲哚、PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基 苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、嗎啉代-5-硝基吲哚、嗎啉代-水粉蕈素、 嗎啉代-肌苷、嗎啉代-4-硝基苯并咪唑、嗎啉代-3-硝基吡咯、氨基磷酸 酯-5-硝基P引咮、氨基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌苷、氨基磷酸酯 -4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2'-0-曱氧基乙基肌苷、2'0-曱氧基乙基水粉蕈素、2'-0-曱氧基乙基5-硝基吲哚、2'-0-曱氧基乙基 4-硝基苯并咪唑、2'-0-曱氧基乙基3-硝基吡咯及其組合的組。
29、 根據(jù)權(quán)利要求28所述的雙特異性寡核苷酸，其中，所述通用 堿基為脫氧肌苷、l-(2'-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯或5-硝基吲 哚。
30、 根據(jù)權(quán)利要求29所述的雙特異性寡核苷酸，其中，所述通用 堿基為脫氧"幾苷。
31、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的雙特異性寡核苷酸，其中，所述間隔 部分包含具有通用堿基的連續(xù)核苷酸。
32、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的雙特異性寡核苷酸，其中，所述5'-高Tm特異性部分比所述3'-低Tm特異性部分長(zhǎng)。
33、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的雙特異性寡核苷酸，其中，所述3'-低Tm特異性部分具有與模板核酸的一個(gè)位點(diǎn)完全互補(bǔ)以與其雜交的雜 交核苦酸序列。
34、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的雙特異性寡核苷酸，其中，p表示15 40 的整數(shù)。
35、 根據(jù)權(quán)利要求34所述的雙特異性寡核苷酸，其中，p表示15~25 的整數(shù)。
36、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的雙特異性寡核苷酸，其中，q為至少3。
37、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的雙特異性寡核苷酸，其中，q表示3 10 的整數(shù)。
38、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的雙特異性寡核苷酸，其中，r表示3~15 的整數(shù)。
39、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的雙特異性寡核苷酸，其中，p為15 25 的整數(shù)、q為3 10的整數(shù)、且r為3 15的整數(shù)。
40、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的雙特異性寡核苷酸，其中，所述5'-高Tm特異性部分的L在4(TC 8(TC的范圍內(nèi)。
41、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的雙特異性寡核苷酸，其中，所述3'-低Tm特異性部分的Tm在1(TC 4(TC的范圍內(nèi)。
42、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的雙特異性寡核苷酸，其中，所述間隔 部分的Tm在3。C 15"的范圍內(nèi)。
43、 一種用于使寡核苷酸的退火特異性能夠通過(guò)寡核苷酸的結(jié)構(gòu) 而被雙重限定的方法，其包括如下步驟(a)選擇目標(biāo)核酸序列；(b) 設(shè)計(jì)寡核苷酸序列，其包含(i)與目標(biāo)核酸基本互補(bǔ)的雜交序列和(ii)包含至少兩個(gè)通用堿基的間隔部分，使間隔部分插入雜交序列以 在該寡核苷酸中形成三個(gè)部分；以及(c) 限定間隔部分在寡核苷酸中的位置，以使間隔部分5 '-方向的部 分具有比間隔部分3 '-方向的部分更高的Tm，并使間隔部分在三個(gè)部分 中具有最低的Tm，從而提供一種包含三個(gè)彼此具有不同Tm值的區(qū)分 部分的寡核苷酸，其中，(i)寡核苷酸的5'-高Tm特異性部分具有與目標(biāo) 核酸基本互補(bǔ)的雜交核苷酸序列；(ii)3'-低Tm特異性部分具有與目標(biāo)核 酸基本互補(bǔ)的雜交核苷酸序列；以及(iii) 5'-高Tm特異性部分與3'-低 Tm特異性部分之間的間隔部分包含至少兩個(gè)通用堿基；且5'-高Tm特 異性部分的Tm比3M氐Tm特異性部分的Tm高，而間隔部分在三個(gè)部分 中具有最低的Tm,因此，寡核苷酸與目標(biāo)核酸的退火特異性受5'-高Tm特異性部分和3'-低Tm特異性部分的雙重限定。
44、根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述間隔部分中的通用 堿基選自包括脫氧肌苷、肌苷、7-脫氮-2'-脫氧肌苷，2-氮-2'-脫氧肌苷、 2'-OMe肌苦、2'-F肌苷、脫氧3-硝基吡咯、3-硝基吡咯、2'-OMe 3-硝 基吡咯、2'-F 3-硝基吡咯、1-(2'-脫氧-(3-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、脫 氧5-硝基吲哚、5-硝基吲哚、2'-OMe5-硝基吲哚、2'-F 5-硝基吲哚、脫 氧4-硝基苯并咪唑、4-硝基苯并咪唑、脫氧4-氨基苯并咪唑、4-氨基苯 并咪唑、脫氧水粉蕈素、2'-F水粉蕈素、2'-F4-硝基苯并咪唑、PNA-5-硝基吲哚、PNA-水粉蕈素、PNA-肌苷、PNA-4-硝基苯并咪唑、PNA-3-硝基吡咯、嗎啉代-5-硝基。引哚、嗎啉代-水粉蕈素、嗎啉代-肌苦、嗎啉 代_4-硝基苯并咪唑、嗎啉代-3-硝基吡咯、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚、氨 基磷酸酯-水粉蕈素、氨基磷酸酯-肌普、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯、2'-0-曱氧基乙基肌苷、2'0-曱氧基乙基水粉蕈 素、2'-0-曱氧基乙基5-硝基吲哚、2'-0-曱氧基乙基4-硝基苯并咪唑、2'-0-曱氧基乙基3-硝基吡咯及其組合的組。
45、 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述通用堿基為脫氧肌 苷、l-(2'-脫氧-P-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯或5-硝基吲哚。
46、 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中，所述通用堿基為脫氧肌苷。
47、 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，其中，所述間隔部分包 含具有通用^5咸基的連續(xù)核苷酸。
48、 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述5'-高Tm特異性部 分比所述3'-低Tm特異性部分長(zhǎng)。
49、 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述3'-低Tm特異性部分具有與^:莫板核酸的一個(gè)位點(diǎn)完全互補(bǔ)以與其雜交的雜交核苷酸序列。
50、根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，p表示15 40的整數(shù)。
51、根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，p表示15 25的整數(shù)。
52、根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，q為至少3。
53、根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其巾，q表示3 10的整數(shù)。
54、根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，r表示3 15的整數(shù)。
55、 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，p為15 25的整數(shù)、q 為3 10的整凄t、且r為3 15的整數(shù)。
56、 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述5'-高Tm特異性部 分的Tm在4(TC 8(TC的范圍內(nèi)。
57、 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述3'-低Tm特異性部 分的Tm在1(TC 4(TC的范圍內(nèi)。
58、 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述間隔部分的Tm在 3'C 15。C的范圍內(nèi)。
59、 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述模板依賴性延伸反 應(yīng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及多種使用雙特異性寡核苷酸的通過(guò)模板依賴性延伸反應(yīng)的方法及其包含三個(gè)不同T_m部分的雙特異性寡核苷酸。本發(fā)明中所證實(shí)的為該雙特異性寡核苷酸的特征，其為高雜交特異性和錯(cuò)配容許性。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101189336SQ200680007217
公開(kāi)日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月5日
發(fā)明者千鐘潤(rùn) 申請(qǐng)人:視基因公司