專利名稱：一種禽用特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及到一種禽用特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法。
背景技術(shù)：
雞傳染性支氣管炎氏病是雞常見的一種傳染性疾病，是由傳染性支氣管炎病毒引起的具有高度傳染性的疾病，死亡率很高。雞傳染性支氣管炎氏病目前還沒有有效的藥物治療。控制辦法應(yīng)以防疫、檢疫、消毒為主。轉(zhuǎn)移因子是從淋巴細胞中提取的一種低分子多肽與核酸復(fù)合物，能特異性或非特異性地提高機體免疫功能，傳遞免疫信息，被譽為細胞免疫激活劑。它無種屬特異性，可在種屬間傳遞，動物來源可用于人類。轉(zhuǎn)移因子是由動物免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的可對抗外源性病原體的防御性肽類活性物質(zhì)，分子量小、具有抗細菌、真菌、病毒和原蟲作用，作為具有特異性與非特異性的免疫活性細胞調(diào)節(jié)因子，廣泛應(yīng)用于治療任何動物病毒性疾病、真菌感
染ο轉(zhuǎn)移因子常規(guī)的制備方法是將動物新鮮或冷凍的脾臟及淋巴結(jié)用組織搗碎機破碎細胞，制成勻漿，加適量純化水，混勻，置-20°C反復(fù)凍融5 8次；將凍融的勻漿離心(離心溫度4°C )，去沉淀，留上清液備用；上清液裝透析袋，半成品過濾除菌；成品的配置與檢驗。常規(guī)制備轉(zhuǎn)移因子活性不高，沒有特性性。轉(zhuǎn)移因子是經(jīng)誘導(dǎo)，由動物免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的可對抗外源性病原體的防御性肽類活性物質(zhì)，分子量小、活性強，具有抗細菌、真菌、病毒和原蟲作用，甚至對癌細胞也具有殺傷作用，應(yīng)用十分廣泛。轉(zhuǎn)移因子作為具有特異性與非特異性的免疫活性細胞調(diào)節(jié)因子， 廣泛應(yīng)用于治療任何動物病毒性疾病、真菌感染、細胞免疫減弱或缺陷病以及惡性腫瘤的輔助治療，并有好的療效。但制備轉(zhuǎn)移因子的工藝繁瑣復(fù)雜、回收率低、無特異性。聚肌胞是一種人工合成的雙鏈核糖核酸，可誘導(dǎo)低水平的干擾素具有一定的抗病毒作用；此外還有調(diào)節(jié)機體免疫功能，促進人體非特異性免疫功能和某些特異性免疫功能。 聚肌胞能刺激單核巨噬細胞系統(tǒng)，增強吞噬細胞的吞噬功能，增加抗體的形成，刺激同種移植反應(yīng)及遲發(fā)型過敏反應(yīng)等。本發(fā)明通過體外制備抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子特異性強、回收率高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過提供一種禽用特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中制備的轉(zhuǎn)移因子針對疾病沒有特異性，治療效果不穩(wěn)定等缺點。本發(fā)明方法特異性強、成本低、回收率高、效果更好。聚肌胞能刺激單核巨噬細胞系統(tǒng)，增強吞噬細胞的吞噬功能，增加抗體的形成。淋巴細胞經(jīng)聚肌胞和雞傳染性支氣管炎病毒混合誘導(dǎo)培養(yǎng)后，抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的活性更高。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案如下一種禽用特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，由如下步驟組成
(1)無菌采取實驗豬脾臟或抗凝血，用脾臟或外周血制備淋巴細胞單層；(2)對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)；(3)當淋巴傳代細胞長成單層后，用聚肌胞和雞傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)，即獲得體外抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。刺激豬脾細胞和豬血淋巴細胞增殖的聚肌胞的質(zhì)量濃度為200_500mg/L。本發(fā)明制備方法中使用的各項成分均為市售品，規(guī)格為藥用級。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明以較少的豬脾臟或外周血為原料，制成淋巴細胞單層，在體外培養(yǎng)，然后用聚肌胞和雞傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)誘導(dǎo)淋巴細胞單層即可體外生產(chǎn)出大量抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子的混合體，本發(fā)明的方法制備的抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子無需進一步的提純，直接將混合體用于禽類，即可起到抗雞傳染性支氣管炎病毒及抗菌的作用，同時提高禽類的免疫力。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1 一種禽用特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具體步驟是(1)無菌采取豬的抗凝血，用外周血制備淋巴細胞單層，步驟為 無菌靜脈采取豬全血25毫升，加0. 8 %肝素溶液0. 3ml抗凝，靜置45分鐘，用帶膠球吸管吸取紅細胞層以上的所有血漿，特別是緊接紅細胞層上的白細胞層要盡量吸取，分裝于消毒離心管內(nèi)，用PBS (pH為7. 2)液反復(fù)洗滌2 3次，離心速度800 1200轉(zhuǎn)/分， 然后用含30 %犢牛血清水解乳蛋白40毫升進行白細胞培養(yǎng)，均勻混合后分裝于容量100毫升培養(yǎng)方瓶或磚瓶中，塞緊瓶塞，置37°C恒溫箱中或磚瓶機中培養(yǎng)，經(jīng)2 3天，白細胞均勻貼壁，即制成淋巴細胞單層。(2)對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)；在作傳代細胞培養(yǎng)前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，以確定細胞已長成單層， 即可進行細胞的傳代培養(yǎng)。(3)當淋巴傳代細胞長成單層后，更換維持液同時加入聚肌胞(終濃度為350mg/ L)和雞傳染性支氣管炎病毒(終濃度為640血凝單位/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)。當淋巴細胞傳代長成單層后，聚肌胞和雞傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)。(4)經(jīng)培養(yǎng)2 3天，離心細胞培養(yǎng)液，收集上清，上清液在4°C下磁力攪拌透析， 超濾除菌，即制成抗雞雞傳染性支氣管炎特異型轉(zhuǎn)移因子。轉(zhuǎn)移因子濃度的測定、抑菌實驗的方法、半成品和成品的檢驗項目均同實施例1。 本方法生產(chǎn)的的轉(zhuǎn)移因子為黃色澄明液體，多肽含量0. 32g/L，核糖含量0. 27g/L。實施例2一種禽用特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具體步驟是(1)無菌采取實驗豬脾臟，用脾臟制備淋巴細胞單層，步驟為A、處理豬脾臟取新鮮豬脾臟置于無菌容器中，加入PBS(pH為7. 2)溶液浸泡半小時或浸于質(zhì)量百分濃度為1 %的新潔爾滅溶液中，取出以酒精消毒脾臟表面，用解剖剪及鑷子去除脾臟脂肪及包膜，用PBS (pH為7. 2)液洗滌一次，再將脾臟剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪將脾臟剪成lmm3小塊，再用PBS (pH為7. 2)液洗滌2_3次，以去除血細胞、色素物質(zhì)及剪碎過程中機械損傷的細胞；B、消化及分散組織塊將上步清洗過的PBS(pH7. 2)液吸掉、將剪碎的組織塊移入錐形瓶中，按組織塊體積的5倍量加入0. 25%胰蛋白酶液(pH為7. 6 7. 8)，置37°C水浴中消化20 40分鐘。 每隔10分鐘搖動一次錐形瓶，以便組織塊散開，以利繼續(xù)消化，直到組織變成松散、表面發(fā)毛時為止，這時從水浴中取出錐形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用PBS (pH為7. 2)液洗滌2 3 次，用0. 5%水解乳蛋白-Hanks液洗，用口徑稍大的細管吹打數(shù)次，用四層紗布濾過；C、細胞計數(shù)采用血球計數(shù)板進行計數(shù)，計數(shù)方法與白細胞計數(shù)相同；D、細胞懸液的分裝和培養(yǎng)按細胞計數(shù)結(jié)果，將細胞懸液用DMEM營養(yǎng)液調(diào)整至60萬個細胞/毫升。將細胞懸液分裝入細胞培養(yǎng)瓶(IOOml)和細胞轉(zhuǎn)瓶，分裝量為該瓶容量的1/5，蓋上蓋，做好標識， 然后將細胞培養(yǎng)瓶和轉(zhuǎn)瓶分別放在二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機上培養(yǎng)；E、觀察置于37°C培養(yǎng)的細胞，需逐日進行觀察。若細胞已生長，則要觀察細胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長階段直至形成淋巴細胞單層。(2)對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)在作傳代細胞培養(yǎng)前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下現(xiàn)察，以確定細胞已長成單層， 即可進行細胞的傳代培養(yǎng)。(3)當淋巴傳代細胞長成單層后，用聚肌胞和雞傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)當脾淋巴傳代細胞長成單層后，更換維持液同時加入聚肌胞(終濃度為420mg/L) 和雞傳染性支氣管炎病毒(終濃度為640血凝單位/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)。(4)誘導(dǎo)培養(yǎng)M小時，將細胞培養(yǎng)物經(jīng)超聲破碎后取樣檢測轉(zhuǎn)移因子和的濃度。轉(zhuǎn)移因子濃度的測定對轉(zhuǎn)移因子的定量多以多肽含量定量用Folin酚法或分光光度法測定多肽含量，以多肽含量Img為一個轉(zhuǎn)移因子單位。本方法生產(chǎn)的的轉(zhuǎn)移因子為黃色澄明液體，多肽含量0. 48g/L，核糖含量0. 34g/L。半成品和成品的檢驗半成品檢定半成品進行細菌內(nèi)毒素、無菌檢查、pH值等項檢測。成品檢定成品分別作轉(zhuǎn)移因子和的鑒別試驗、外觀檢測、PH值、多肽含量、特異活性試驗、蛋白質(zhì)反應(yīng)、無菌檢查、細菌內(nèi)毒素、異常毒性等項檢驗。實施例3一種禽用特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具體步驟是(1)取新鮮豬脾臟置于無菌玻璃容器中，加入PBS (pH為7. 2)溶液浸泡半小時或浸于質(zhì)量百分濃度為1 %的新潔爾滅溶液中，取出以酒精消毒脾臟表面，用解剖剪及鑷子去除脾臟脂肪及包膜，用PBS (pH為7. 2)液洗滌一次，再將脾臟剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪將脾臟剪成lmm3小塊，再用PBS (pH為7. 2)液洗滌2_3次；
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(2)將上步清洗過的PBS (pH7. 2)液吸掉、將剪碎的組織塊移入錐形瓶中，按組織塊體積的5倍量加入0. 25%胰蛋白酶液(pH為7. 6 7. 8)，置37°C水浴中消化20 40 分鐘。每隔10分鐘搖動一次錐形瓶，以便組織塊散開，以利繼續(xù)消化，直到組織變成松散、 表面發(fā)毛時為止，這時從水浴中取出錐形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用PBS(pH為7. 2)液洗滌 2 3次，用0. 5%水解乳蛋白-Hanks液洗，用口徑稍大的細管吹打數(shù)次，用四層紗布濾過；(3)將細胞懸液用DMEM營養(yǎng)液調(diào)整至60萬/毫升細胞懸液，然后分裝入細胞培養(yǎng)瓶和細胞轉(zhuǎn)瓶，分別放在二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機上培養(yǎng)；(4)經(jīng)2 3天，白細胞均勻貼壁，即制成淋巴細胞單層，可進行細胞的傳代培養(yǎng)。 當長成單層后，更換維持液同時用聚肌胞(終濃度為150mg/L)和雞傳染性支氣管炎病毒 (終濃度為2560血凝單位/ml)誘導(dǎo)培養(yǎng)。(5)經(jīng)培養(yǎng)1 2天，離心細胞培養(yǎng)液，收集上清，上清液透析，超濾除菌，上清液即為特異型轉(zhuǎn)移因子。應(yīng)用實例200只20日齡只40日齡肉雞(經(jīng)過健康檢查無菌)分為A、B、C、D、E共5組，B、 C、D、E組經(jīng)過人工感染0. 5ml雞傳染性支氣管炎病毒強毒攻毒后作實驗。A組為健康組，不感染病毒，不給藥；B組陰性對照組，感染病毒，不給藥；C組本發(fā)明為藥物(實施例1)低劑量組，按禽0. 5ml/只雞/天肌肉注射；D組為本發(fā)明藥物高劑量組，按禽1. Oml/只雞/天注射；E組為黃芪多糖組(天津艾森生物公司)，按禽0. 5g/只雞/天注射。結(jié)果表明，采用本發(fā)明藥物治療雞傳染性傳染性支氣管炎病毒病有著明顯的療效。本發(fā)明天然藥物組合物實驗結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種禽用特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征是由如下步驟組成(1)無菌采取豬脾臟或豬血，用脾臟或外周血制備淋巴細胞單層；(2)對淋巴細胞單層進行傳代培養(yǎng)；(3)當淋巴傳代細胞長成單層后，用聚肌胞和雞傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)，即獲得抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述一種禽用特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征是刺激豬脾細胞和豬血淋巴細胞增殖的聚肌胞的質(zhì)量濃度為200-500mg/L。
全文摘要
一種禽用特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及到一種禽用特異性轉(zhuǎn)移因子的制備方法。本發(fā)明以豬脾臟或外周血為原料，制成淋巴細胞單層，在體外培養(yǎng)淋巴細胞，然后用聚肌胞和雞傳染性支氣管炎病毒誘導(dǎo)培養(yǎng)，體外生產(chǎn)出大量抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。本發(fā)明的方法體外制備的抗雞傳染性支氣管炎病毒特異性轉(zhuǎn)移因子用于治療雞傳染性傳染性支氣管炎病，同時提高禽類的免疫力。
文檔編號A61K35/14GK102151290SQ20091030363
公開日2011年8月17日 申請日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者王麗莉, 王文彪 申請人:天津艾森生物工程有限公司