一種50nm銀粒子的定量檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種50nm銀粒子的定量檢測(cè)方法。檢測(cè)方法步驟包括：制備50nm銀粒子的免疫原和包被抗原、制備50nm銀粒子高特異性抗體、制備酶標(biāo)抗體、用吸光度法測(cè)定50nm銀粒子含量。本發(fā)明檢測(cè)方法特異性高，靈敏度高，操作相對(duì)簡(jiǎn)單。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種50nm銀粒子的定量檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米材料檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種50nm銀粒子的定量檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 多個(gè)世紀(jì)以來(lái)，銀通常被作為金屬銀被大家廣泛使用，如銀飾品和銀器具?，F(xiàn)如 今，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，以納米技術(shù)為核心的新科技革命已經(jīng)成為當(dāng)今時(shí)代的主題。銀常 作為納米粒子的形式滲透到我們?nèi)粘Ｉ钆c生產(chǎn)中。同其他有機(jī)的抗微生物相比，納米銀 具有抗菌性和低毒性，因此納米銀在抗菌藥物和食品生產(chǎn)中已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用。納米銀對(duì) 環(huán)境安全和人類(lèi)健康貢獻(xiàn)極大，開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景極其廣闊，在生活日漸便捷化的今日，納米銀 添加制品已成為廣大消費(fèi)者的必備用品。
[0003] 我們知道，納米銀可以通過(guò)直接或間接接觸等途徑進(jìn)入環(huán)境和人體，在納米銀如 此廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景下，我們對(duì)納米銀可能產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)和潛在的毒理性研究還不 夠充分。白春禮院士在293次香山會(huì)議上的報(bào)告指出："在發(fā)展納米的同時(shí)，同步開(kāi)展其安 全性研究，使納米技術(shù)成為人類(lèi)第一個(gè)在其可能產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)之前，就已經(jīng)過(guò)認(rèn)真的研究， 引起廣泛重視，并最終能安全造福人類(lèi)的技術(shù)。"同時(shí)，2003年，Science和Nature也相繼 發(fā)表文章，探討納米材料的生物效應(yīng)、對(duì)環(huán)境和健康的影響。因此，對(duì)納米材料的研究及其 重要。
[0004] 目前，我們可以通過(guò)透射式電子顯微鏡（TEM)、原子力顯微鏡（AFM)和掃描電子顯 微鏡（SEM)等對(duì)納米銀的尺寸、外貌和結(jié)構(gòu)形態(tài)做一定的研究，但對(duì)于納米銀的定量檢測(cè) 卻是一項(xiàng)極其具有挑戰(zhàn)性的工作。目前，我們對(duì)納米粒子的定量檢測(cè)方法主要有電感耦合 等離子體質(zhì)譜法、分光光度法、火焰原子吸收光譜法和電化學(xué)法等，但上述方法均存在一定 的缺陷，比如電感稱(chēng)合等離子體質(zhì)譜法只適用特定尺寸的納米粒子，對(duì)于小尺寸的納米粒 子并不適用；分光光度法和火焰原子吸收光譜法干擾因素較多，對(duì)含量較高樣品的測(cè)定結(jié) 果尚可，但對(duì)低含量樣品的檢測(cè)能力不強(qiáng)；而電化學(xué)分析法定量分析穩(wěn)定性差，靈敏度低， 不適合理論應(yīng)用。所以，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、適用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控的痕量分析方法已經(jīng)迫在眉 睫。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種50nm銀粒子的定量檢測(cè)方法，本 發(fā)明檢測(cè)方法對(duì)痕量50nm銀粒子的檢測(cè)方法特異性高，靈敏度高，操作相對(duì)簡(jiǎn)單。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] -種50nm銀粒子的定量檢測(cè)方法，步驟包括：
[0008] a、制備50nm銀私子的免疫原和包被抗原；
[0009] b、將免疫原注射到動(dòng)物體內(nèi)，制得50nm銀粒子高特異性抗體；
[0010] C、制備酶標(biāo)抗體；
[0011] d、用吸光度法測(cè)定50nm銀粒子含量，利用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法將標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè) 樣競(jìng)爭(zhēng)抗體的反應(yīng)，酶標(biāo)抗體的酶可以促使底物液發(fā)光，從而測(cè)得吸光度值，即可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn) 曲線(xiàn)來(lái)定量檢測(cè)50nm銀粒子含量。
[0012] 所述50nm銀粒子的制備方法為：
[0013] 稱(chēng)取27. 8mg的AgN03溶解于100mL蒸餾水中溶解，再轉(zhuǎn)移到三角燒瓶中，緩慢攪 拌下油浴加熱至沸騰，快速加入3mL 1 %的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)沸騰35分鐘，冷卻后用棕 色瓶收集，4ΓΙ?！ご?zhèn)溆?，所得溶液即為?0nm銀粒子的溶液。
[0014] 所述步驟a中50nm銀粒子的免疫原的制備方法為：
[0015] 在攪拌下將巰基乙酸（TGA)水溶液加入到50nm銀粒子溶液中，在攪拌15-20min 后，分別加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDAC)和N-羥基琥珀酰 亞胺（NHS)的水溶液，室溫避光下攪拌3-4h，然后再調(diào)節(jié)pH9?10,加入牛血清白蛋白溶液 (BSA, sigma公司），4°C下攪拌5-6h,將所得溶液裝入透析袋中，用蒸餾水透析12小時(shí)以 上，避光低溫保存。
[0016] 所述避光低溫保存溫度為CC;
[0017] 所述巰基乙酸水溶液質(zhì)量百分比濃度為9.9%，50nm銀粒子溶液濃度lOOyg/ mL，EDAC 溶液濃度為 10mg/mL，NHS 溶液濃度為 10mg/mL，BSA 濃度為 10g/L，TGA、EDAC 和 NHS的物質(zhì)的量比1:2:4 ;納米銀粒子溶液、巰基乙酸溶液和牛血清白蛋白溶液的體積比為 400:1:10 ；
[0018] 所述包被抗原的制備方法基本同免疫原的制備方法，不同處在于用質(zhì)量百分比 1 %卵清蛋白溶液（OVA)代替10g/L牛血清白蛋白；
[0019] 所述步驟b中高特異性抗體的制備方法為：
[0020] 將免疫抗原與弗氏佐劑以體積比1:1混溶，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行多次免疫，制得50nm銀粒 子高特異性抗體。
[0021] 所述多次免疫方法為：第一次動(dòng)物免疫將免疫抗原與弗氏完全佐劑混溶，免疫劑 量0. 5mg?lmg/kg/次，免疫注射，免疫三周后，進(jìn)行六次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫是將免疫抗原 與弗氏不完全佐劑混溶，進(jìn)行免疫注射，免疫劑量〇. 5mg?lmg/kg/次，六次加強(qiáng)免疫間隔 為2-3周，經(jīng)六次加強(qiáng)免疫后，從動(dòng)物靜脈采血，血清室溫20-251!靜置〇. 5-lh，在冰箱 4?#置2h后吸取上層澄清的血清，制得高特異性抗體。
[0022] 所述弗氏佐劑制備方法為：將液體石蠟和羊毛脂按2:1體積比用超聲清洗器超聲 3小時(shí)左右，使之完全混勻，制得不完全弗氏佐劑；臨用前向不完全弗氏佐劑中加入卡介苗 即為完全弗氏佐劑，不完全弗氏佐劑與卡介苗的體積比為6:1。
[0023] 所述動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物、禽類(lèi)，哺乳動(dòng)物包括家兔、馬、羊、鼠、豬和猴，優(yōu)選兔和 鼠，禽類(lèi)包括雞、鴨和鵝，優(yōu)選雞；所述的動(dòng)物為適齡、健壯、無(wú)感染的動(dòng)物，優(yōu)選雄性動(dòng)物， 動(dòng)物的年齡應(yīng)為青壯年，兔齡選月齡2?5個(gè)月，體重2?3Kg的成年雄兔，雞優(yōu)選蛋雞。
[0024] 所述的免疫注射的部位包括腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)、皮下和皮內(nèi)注射， 這些方法可以單獨(dú)使用或多次組合使用，優(yōu)選背部皮下多點(diǎn)注射、皮內(nèi)多點(diǎn)注射和腿部肌 肉注射單獨(dú)或多種組合注射。
[0025] 所述的佐劑也可以為胞壁酸二肽、多糖類(lèi)物質(zhì)等有機(jī)佐劑，或者明礬等無(wú)機(jī)佐劑。
[0026] 所述步驟c酶標(biāo)抗體的制備方法為：
[0027] 取辣根過(guò)氧化物酶lOmg溶于0. 4mL 0. 05mol/L pH9. 6碳酸鈉緩沖液即CB緩沖 液，待溶解后加入25%戊二醛0. lmL，然后37°C溫育2小時(shí)；之后加入0-4°C無(wú)水乙醇2mL， 2500r/min離心15分鐘，傾去上清液；取沉淀用80%乙醇411^混懸，同上離心，傾去乙醇，將 管倒置，使乙醇充分流出；沉淀用lmL 0.05mol/L pH9.6 CB緩沖液溶解，加入0.5-lmL50nm 銀粒子抗體，放在冰箱內(nèi)過(guò)夜后，用少量的NaH2P04調(diào)至中性即可。最后用飽和硫酸銨溶液 沉淀法將其純化，純化抗體于4°C或-20°C保存。
[0028] 所述步驟d具體為：
[0029] 1)包被：將包被抗原與水以1:50?1:200稀釋后制成稀釋液，優(yōu)選1:100,用稀 釋液包被96孔酶標(biāo)板，每孔加稀釋液80?150 μ L，優(yōu)選100 μ L，放置4°C過(guò)夜，取出用洗滌 液PBST洗滌2?6次，每次2?6分鐘，優(yōu)選洗滌3?5次，每次3?5分鐘。
[0030] 2)封閉：加入質(zhì)量百分比濃度為1 %?5% OVA溶液，優(yōu)選1 %的OVA ;每孔100? 200 μ L，優(yōu)選150?200 μ L，封閉沒(méi)有包被抗原的多余的部分，30°C?40°C溫育0. 5?2. 0 小時(shí)后，取出用洗滌液PBST洗滌2?6次，每次2?6分鐘，優(yōu)選37°C溫育0. 5?1. 0小時(shí) 后，取出用洗滌液PBST洗滌3?5次，每次3?5分鐘。
[0031] 3)競(jìng)爭(zhēng)：加入50 μ 1/孔不同濃度含50nm銀粒子的溶液和樣品溶液，然后加入分 別加入50 μ L酶標(biāo)抗體，使之發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。30°C?40°C下溫育1?5小時(shí)，優(yōu)選37°C下 溫育3小時(shí)，使待測(cè)物質(zhì)和固相抗原同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)抗體上的結(jié)合位點(diǎn)，取出用洗滌液PBST 洗漆2?6次，每次2?6分鐘，優(yōu)選洗漆3?5次，每次3?5分鐘。
[0032] 4)檢測(cè)：加入底物液顯色，每孔80?120 μ L，優(yōu)選每孔100 μ L，溫育30分鐘后， 用2mol/L的H2S04終止液停止反應(yīng)。用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490nm時(shí)的吸光強(qiáng)度。
[0033] 5)、根據(jù)吸光強(qiáng)度和含50nm銀粒子的溶液濃度繪制工作曲線(xiàn)，根據(jù)工作曲線(xiàn)求得 待測(cè)樣品溶液中50nm銀粒子的含量。
[0034] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0035] (1)抗體實(shí)用性強(qiáng)：本發(fā)明制備出了特異性好、效價(jià)高的多克隆抗體。
[0036] (2)提供了一種對(duì)納米材料的定量檢測(cè)方法：通過(guò)制備的納米銀的多克隆抗體， 使我們能夠測(cè)量痕量50nm AgNPs。
[0037] (3)此免疫分析方法特異性高，靈敏度高，操作相對(duì)簡(jiǎn)單。

【具體實(shí)施方式】
[0038] 實(shí)驗(yàn)藥品及儀器：
[0039] (1)實(shí)驗(yàn)試劑
[0040] 牛血清蛋白（BSA)，羊血清蛋白（0VA)，辣根過(guò)氧化物酶（HRP)，液體石蠟，羊毛 月旨，無(wú)水乙醚，戊二醛（25% )，液體卡介苗，75%醫(yī)用酒精，氫氧化鈉，尿素，無(wú)水碳酸鈉，碳 酸氫鈉，磷酸氫二鈉，氨水，硝酸銀，巰基乙酸（99%，C 2H402S)，N-羥基琥珀酰亞胺（98%， C4H5N03)，檸檬酸三鈉，磷酸，硫酸，乙醇，檸檬酸，鄰苯二胺，鹽酸，氯化鈉，磷酸二氫鈉，硫酸 銨，四硼酸鈉，Tween-20,過(guò)氧化氫，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
[0041] ⑵實(shí)驗(yàn)儀器
[0042] UV-4100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，集散式恒溫加熱磁力攪拌器，磁力攪拌器，透 析袋，一次性注射器，多功能酶標(biāo)儀，SCQ50超聲波清洗器，TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)，96孔 酶標(biāo)板。
[0043] (3)溶液的配制
[0044] 1) 1 %檸檬酸三鈉：50mg檸檬酸三鈉溶解在4. 95mL蒸餾水中
[0045] 2)生理鹽水：0· 85g NaCl用蒸餾水定容到100mL
[0046] 3)包被液緩沖液（0· 05mol/L，pH = 9. 6 碳酸鈉緩沖液，CB) :NaC030. 0795g， NaHC030. 147g溶于蒸餾水，定容到50mL
[0047] 4)稀釋液（0· Olmol/L，pH = 7· 4 磷酸鹽緩沖液，PBS) :Na2HP04 · 12H20 2. 96g， NaH2P04 · 2H20 (λ 2964g，NaCl 8. 0g，KC1 (λ 2g 溶于蒸餾水，定容到 lOOOmL
[0048] 5)洗滌液（0· 01mol/L，pH = 7. 4，PBST):由稀釋液中加體積分?jǐn)?shù)(λ 05%吐溫制成
[0049] 6)封閉液：質(zhì)量百分比為1 %的卵清蛋白（OVA)溶液，溶劑為PBS
[0050] 7)底物液：檸檬酸0. 5106g Na2HP04 · 12H20 1. 8408g溶于蒸餾水，定容到50mL，稱(chēng) 取4mg鄰苯二胺溶于10mL上述溶液中，臨用前加入15 μ L 30%的H202
[0051] 8)終止液：2mol/L硫酸溶液。
[0052] 實(shí)施例1
[0053] (1) 50nm AgNPs 即 50nm 銀粒子全抗原
[0054] 1) 50nm AgNPs 的制備
[0055] 稱(chēng)取27. 8mg的AgN03溶解于100mL蒸餾水中溶解，再轉(zhuǎn)移到三角燒瓶中，緩慢攪 拌下油浴加熱至沸騰，快速加入3mL 1 %的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)沸騰35分鐘，冷卻后用棕 色瓶收集，41*:存?zhèn)溆茫萌芤杭礊?0nm AgNPs。
[0056] 2)免疫抗原和包被抗原的制備
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 一種50nm銀粒子的定量檢測(cè)方法，步驟包括： a、 制備50nm銀粒子的免疫原和包被抗原； b、 將免疫原注射到動(dòng)物體內(nèi)，制得50nm銀粒子高特異性抗體； c、 制備酶標(biāo)抗體； d、 用吸光度法測(cè)定50nm銀粒子含量，利用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法將標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣競(jìng) 爭(zhēng)抗體的反應(yīng)，酶標(biāo)抗體的酶可以促使底物液發(fā)光，從而測(cè)得吸光度值，即可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 來(lái)定量檢測(cè)50nm銀粒子含量。
2. 如權(quán)利要求1所述的測(cè)試方法，其特征在于： 所述步驟a中50nm銀粒子的免疫原的制備方法為： 在攪拌下將巰基乙酸溶液加入到50nm銀粒子溶液中，在攪拌15-20min后，分別加入 1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫避光下 攪拌3-4h，然后再調(diào)節(jié)pH9?10,加入牛血清白蛋白溶液，4°C下攪拌5-6h，將所得溶液裝入 透析袋中，用蒸餾水透析12小時(shí)以上，避光低溫保存。
3. 如權(quán)利要求2所述的測(cè)試方法，其特征在于：所述巰基乙酸溶液質(zhì)量百分比濃度為 9. 9 %，50nm銀粒子溶液溶液濃度100 μ g/mL，1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基）碳化二亞胺 鹽酸鹽溶液濃度為10mg/mL，N-羥基琥珀酰亞胺溶液濃度為10mg/mL，牛血清白蛋白濃度為 10g/L，TGA、EDAC和NHS的物質(zhì)的量比1:2:4 ;納米銀粒子溶液、巰基乙酸溶液和牛血清白 蛋白溶液的體積比為400:1:10。
4. 如權(quán)利要求1所述的測(cè)試方法，其特征在于：所述步驟b中高特異性抗體的制備方 法為： 將免疫抗原與弗氏佐劑以體積比1:1混溶，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行多次免疫，制得50nm銀粒子高 特異性抗體。
5. 如權(quán)利要求4所述的測(cè)試方法，其特征在于：所述多次免疫方法為：第一次動(dòng)物免疫 將免疫抗原與弗氏完全佐劑混溶，免疫劑量〇. 5mg?lmg/kg/次，免疫注射，免疫三周后，進(jìn) 行六次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫是將免疫抗原與弗氏不完全佐劑混溶，進(jìn)行免疫注射，免疫劑量 0. 5mg?lmg/kg/次，六次加強(qiáng)免疫間隔為2-3周，經(jīng)六次加強(qiáng)免疫后，從動(dòng)物靜脈采血， 血清室溫20-25°C靜置0. 5-lh，在冰箱4°C靜置2h后吸取上層澄清的血清，制得高特異性 抗體。
6. 如權(quán)利要求1所述的測(cè)試方法，其特征在于：所述步驟c酶標(biāo)抗體的制備方法為： 取辣根過(guò)氧化物酶l〇mg溶于0. 4mL 0. 05mol/L pH9. 6碳酸鈉緩沖液即CB緩沖液，待 溶解后加入25%戊二醛0. lmL，然后37°C溫育2小時(shí)；之后加入0-4°C無(wú)水乙醇2mL，2500r/ min離心15分鐘，傾去上清液；取沉淀以80%乙醇4mL混懸，同上離心，傾去乙醇，將管倒 置，使乙醇充分流出；沉淀用lmL 0.05mol/L pH9.6CB緩沖液溶解，加入0.5-lmL50nm銀粒 子抗體，放在冰箱內(nèi)過(guò)夜后，用少量的NaH2P0 4調(diào)至中性即可。最后用飽和硫酸銨溶液沉淀 法將其純化，純化抗體于4°C或_20°C保存。
7. 如權(quán)利要求1所述的測(cè)試方法，其特征在于：所述步驟d具體為： 1)包被：將包被抗原與水以1:50?1:200稀釋后制成稀釋液，優(yōu)選1:100,用稀釋液 包被96孔酶標(biāo)板，每孔加稀釋液80?150 μ L，優(yōu)選100 μ L，放置4°C過(guò)夜，取出用洗滌液 PBST洗滌2?6次，每次2?6分鐘，優(yōu)選洗滌3?5次，每次3?5分鐘。 2) 封閉：加入質(zhì)量百分比濃度為1%?5% OVA溶液，優(yōu)選1%的OVA;每孔100? 200 μ L，優(yōu)選150?200 μ L，封閉沒(méi)有包被抗原的多余的部分，30°C?40°C溫育0. 5?2. 0 小時(shí)后，取出用洗滌液PBST洗滌2?6次，每次2?6分鐘，優(yōu)選37°C溫育0. 5?1. 0小時(shí) 后，取出用洗滌液PBST洗滌3?5次，每次3?5分鐘。 3) 競(jìng)爭(zhēng)：加入50 μ 1/孔不同濃度含50nm銀粒子的溶液和樣品溶液，然后加入分別加 入50yL酶標(biāo)抗體，使之發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。30°C?40°C下溫育1?5小時(shí)，優(yōu)選37°C下溫育 3小時(shí)，使待測(cè)物質(zhì)和固相抗原同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)抗體上的結(jié)合位點(diǎn)，取出用洗滌液PBST洗滌 2?6次，每次2?6分鐘，優(yōu)選洗漆3?5次，每次3?5分鐘。 4) 檢測(cè)：加入底物液顯色，每孔80?120 μ L，優(yōu)選每孔100 μ L，溫育30分鐘后，用 2mol/L的H2S04終止液停止反應(yīng)。用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490nm時(shí)的吸光強(qiáng)度。 5) 、根據(jù)吸光強(qiáng)度和含50nm銀粒子的溶液濃度繪制工作曲線(xiàn)，根據(jù)工作曲線(xiàn)求得待測(cè) 樣品溶液中50nm銀粒子的含量。
【文檔編號(hào)】G01N33/535GK104251902SQ201410513013
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】張明翠, 吳瑕玉 申請(qǐng)人:安徽師范大學(xué)