專利名稱：纖維堆囊菌菌株及其在埃博霉素合成方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程和生物制藥領(lǐng)域，具體涉及纖維堆囊菌株51orangi umcellulosum So2163 ,還涉及該菌株在埃博霉素合成方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見病和多發(fā)病，是世界各國醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域中的重要科研課題，目前尚無滿意的治療措施。紫杉醇作為目前應(yīng)用最為廣泛的抗腫瘤藥物，其年銷量達(dá)到了 20億美元，占抗腫瘤藥物市場(chǎng)份額的10%。由于其抗癌普擴(kuò)大以及非腫瘤性疾病方面良好的治療前景，預(yù)計(jì)今后世界需求量將達(dá)到每年2000公斤，而美國BMS公司紫杉醇制劑的售價(jià)為每公斤500-1000萬美元。埃博霉素作為與紫杉醇具有相同抗腫瘤機(jī)制的一類大環(huán)內(nèi)酯類化合物，能夠抑制癌癥晚期紡錘體和紡錘絲的形成，從而抑制有絲分裂，組織癌細(xì)胞增值，也具有光譜的抗癌療效。同時(shí)埃博霉素與紫杉醇相比還具備以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):良好的水溶性；更廣的抗癌譜；更強(qiáng)的對(duì)耐藥性腫瘤的抑制能力；以及最重要的一點(diǎn)——它是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的促微管聚合活性化合物，具備大規(guī)模發(fā)酵制備的潛力。自從1996年被發(fā)現(xiàn)以來，逐漸成為抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)，目前已經(jīng)有很多埃博霉素類化合物進(jìn)入不同水平的臨床評(píng)估階段，并且其中之一——ixabepilong，埃博霉素的大患內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)類似物，已經(jīng)于2007年10月經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，展示了良好的治療效果。埃博霉素類藥物也被認(rèn)為是紫杉醇的更新?lián)Q代產(chǎn)品，其市場(chǎng)容量不會(huì)低于10億美元/年，我國的年銷售額也將在I億美元以上。Epothilone的制備方法目前主要有三種，分別是化學(xué)全合成法、生物合成法和化學(xué)修飾法。

鑒于其簡單的化學(xué)結(jié)構(gòu)和很好的抗腫瘤療效，印othilone —經(jīng)發(fā)現(xiàn)就成為生物有機(jī)化學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)，目前已經(jīng)有數(shù)十條全合成路線相繼報(bào)道，且較為詳盡的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系也已經(jīng)被推導(dǎo)，印othilone全合成工作也于上世紀(jì)末在我國開展，但是由于埃博霉素的結(jié)構(gòu)相對(duì)仍較為復(fù)雜，化學(xué)全合成步驟冗長，產(chǎn)率非常低，不具備工業(yè)化生產(chǎn)的前景。人們通過對(duì)epothilone的構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)其16元大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中的?；糠峙c其生物活性密切相關(guān)，而0-烷基部分的修飾對(duì)其活性影響不大，因此通過對(duì)天然epothilone進(jìn)行化學(xué)修飾開發(fā)新的結(jié)構(gòu)類似物具有良好的應(yīng)用前景。目前批準(zhǔn)上市的ixabepilone和處于臨床評(píng)估的BMS-310705均是化學(xué)修飾的結(jié)構(gòu)類似物。但是化學(xué)修飾法也必須依賴于大量原料的供應(yīng)才能夠?qū)嵤Ｒ虼松锖铣扇匀皇莈pothilone生產(chǎn)的唯一有效途徑。Epothilone產(chǎn)生菌最早報(bào)道的是來自于美國Emporia州立大學(xué)的SMP44菌株以及來自于德國國家生物技術(shù)研究中心GBF的So ce90菌株，其印othilone A的產(chǎn)量均為20mg/L左右。國內(nèi)目前僅有少數(shù)幾個(gè)單位在研究埃博霉素的發(fā)酵生產(chǎn)，能夠應(yīng)用的菌株數(shù)量稀少且多為野生菌株，因此開發(fā)尋找新的能夠合成埃博霉素的微生物菌株具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了能夠合成埃博霉素的纖維堆囊菌{Sorangium cellulosum) So2163,還提供了利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素的方法。本發(fā)明的纖維堆囊菌株{Sorangium c<977w7o5 ) So2163,該菌株已于2012年6月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國武漢市武漢大學(xué)，保藏編號(hào)=CCTCCN0.M 2012211。上述菌株的16S rDNA序列片段長度為1466bp。纖維堆囊菌株其培養(yǎng)方法，包括下述的步驟:采用CNST培養(yǎng)基于30°C培養(yǎng)5天，待菌落擴(kuò)展充分并形成子實(shí)體結(jié)構(gòu)后，轉(zhuǎn)入EMP發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)時(shí)間7-8天。纖維堆囊菌株的培養(yǎng)方法中，向發(fā)酵該菌株所用的EPM培養(yǎng)基中添加了大孔類吸附樹脂，優(yōu)選為1%的XAD-16大孔吸附樹脂。培養(yǎng)完成后用色譜純甲醇浸提樹脂吸附產(chǎn)物。本發(fā)明還要保護(hù)的是，纖維堆囊菌株在生產(chǎn)抗腫瘤藥物埃博霉素、在埃博霉素類化合物及以埃博霉素為母核的結(jié)構(gòu)衍生物、埃博霉素A、埃博霉素B生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明的纖維堆囊菌株So2163，是一株分離自土壤樣品的天然埃博霉素產(chǎn)生菌，可以在液體發(fā)酵條件下合成埃博霉素，因此具備開發(fā)成藥用原料生產(chǎn)菌種的潛力，可以帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和市場(chǎng)價(jià)值。


圖1實(shí)施例2中菌株的細(xì)胞圖片；
圖2實(shí)施例2中菌株菌落形態(tài)照片；
圖3實(shí)施例4中菌株發(fā)酵粗提物的HPLC檢測(cè)譜 圖4實(shí)施例4中菌株合成的埃博霉素A的LC-MS檢測(cè)譜圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
來對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但并不以此限制本發(fā)明。菌株纖維堆囊菌{Sorangium c<977w7o5 ) So2163,該菌株已于2012年6月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào):CCTCC M 2012211。實(shí)施例中所用原料均從市場(chǎng)購得，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均參照常規(guī)條件如Sambrook等人所著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989),實(shí)施例中所用核磁共振儀為Bruker Avance600型核磁共振波譜儀。實(shí)施例1
菌株So2163的分離方法
將土壤樣品磨碎后均勻?yàn)⒃贑NST培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)7-10天后觀察，待初步長出菌落后挑取接種于新的CNST培養(yǎng)基進(jìn)行純化保存。CNST 培養(yǎng)基配方(/L) =KNO3 0.5g/L ； Na2HPO4 0.25g/L ； MgSO4 lg/L ；pH 7.5 ;固體培養(yǎng)基添加1.2%的瓊脂粉，鋪放滅菌處理的濾紙片做碳源；102.34 kPa 30min濕熱滅囷后備用。實(shí)施例2
菌株So2163的種屬鑒定 (I)形態(tài)學(xué)方法鑒定
將菌株So2163采用CNST培養(yǎng)基于30°C培養(yǎng)5天，待菌落擴(kuò)展充分并形成子實(shí)體結(jié)構(gòu)后進(jìn)行鏡檢，分別觀測(cè)其菌體細(xì)胞、子實(shí)體形態(tài)和擴(kuò)展菌膜形態(tài)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見附圖1)，結(jié)果表明，該菌株具備典型的纖維堆囊菌cellulosum)形態(tài)學(xué)特征。(2)分子生物學(xué)方法鑒定
通過設(shè)計(jì) 16S rDNA 細(xì)菌通用擴(kuò)增引物 27F (5，-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)和1492R (5，-TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)，以菌株So2163基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了長度為1466bp的16S rDNA片段，通過測(cè)序后與GeneBank中序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與Sorangium cellulosum 16S rDNA序列同源性達(dá)到99%以上(序列結(jié)果見序列表I)。根據(jù)實(shí)施例2的結(jié)果，將 該微生物鑒定為Sorangium屬，命名為So2163。實(shí)施例3
菌株So2163的培養(yǎng)方法及發(fā)酵產(chǎn)物前處理過程
合成埃博霉素采用EPM培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)時(shí)間7-8天，發(fā)酵結(jié)束后收集XAD-16大孔吸附樹脂，蒸餾水洗滌2-3次后采用2倍體積色譜純甲醇浸提2小時(shí)，IOOOOrpm離心處理IOmin后及得到發(fā)酵粗提物。EPM培養(yǎng)基配方(/L):馬鈴薯淀粉2.0 g、葡萄糖2.0 g、豆餅粉2.0 g ;脫脂牛奶
1.0 g,MgSO4 1.0 g,CaCl2 1.0 g、VB12 0.5 mg,Amberlite XAD-16 大孔吸附樹脂 2% (v/v)，調(diào)節(jié)pH 7.2，121°C滅菌處理20min。實(shí)施例4
菌株So2163發(fā)酵產(chǎn)物中所含埃博霉素的分析和鑒定方法
(I)薄層層析(TLC)
使用石油醚:丙酮=4:1展開劑體系，對(duì)So2163發(fā)酵粗提物進(jìn)行展開，在GF254硅膠板上通過紫外光照射觀察明顯的暗點(diǎn)，并與埃博霉素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者有相同的Rf值，初步證明兩者為同一物質(zhì)。(2)高效液相色譜(HPLC)
選擇分析性C-18 ODS色譜柱(4.6X250 mm, Kromasil),色譜條件:檢測(cè)波長249nm,流速0.8 mL/min，流動(dòng)相為甲醇:水=7: 3，實(shí)驗(yàn)表明發(fā)酵產(chǎn)物中含有與埃博霉素標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同的物質(zhì)(見附圖3)，(埃博霉素A的保留時(shí)間為7.5 min，埃博霉素B的保留時(shí)間為8.7 min)根據(jù)峰面積可以計(jì)算出發(fā)酵產(chǎn)物中埃博霉素的含量。(3 )液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜(LC-MS )
實(shí)施例中使用少量經(jīng)制備液相色譜純化后的發(fā)酵樣品進(jìn)行了液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)。結(jié)果表明樣品中的主要成分分子量為493.4 (+1 H+)，與埃博霉素A標(biāo)準(zhǔn)品分子量相同(如附圖4)，說明兩者為同一物質(zhì)。
(4)核磁共振(NMR)
實(shí)施例中使用一定量的經(jīng)HPLC純化后的樣品進(jìn)行了核磁共振檢測(cè)，通過實(shí)驗(yàn)表明，發(fā)酵樣品同埃博霉素B標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的響應(yīng)信號(hào)，從分子結(jié)構(gòu)上證明兩者為同一物質(zhì)。
權(quán)利要求
1.纖維堆囊菌株{Sorangiumc<977w7o5 ) So2163,該菌株已于2012年6月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào):CCTCC M 2012211。
2.如權(quán)利要求1所述的纖維堆囊菌株，其特征是，該菌株的16SrDNA序列片段長度為1466bp。
3.如權(quán)利要求1所述的纖維堆囊菌株其培養(yǎng)方法，包括下述的步驟:采用CNST培養(yǎng)基于30°C培養(yǎng)5天，待菌落擴(kuò)展充分并形成子實(shí)體結(jié)構(gòu)后，轉(zhuǎn)入EMP發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為300C，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)時(shí)間7-8天。
4.如權(quán)利要求3所述的纖維堆囊菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于:發(fā)酵該菌株所用的EPM培養(yǎng)基中添加了大孔類吸附樹脂。
5.如權(quán)利要求3或4所述的纖維堆囊菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于:發(fā)酵該菌株所用的EPM培養(yǎng)基中添加了 1%的XAD-16大孔吸附樹脂。
6.如權(quán)利要求5所述的纖維堆囊菌株的培養(yǎng)方法，其特征在于:培養(yǎng)完成后用色譜純甲醇浸提樹脂吸附產(chǎn)物。
7.如權(quán)利要求1或2所述的纖維堆囊菌株在生產(chǎn)抗腫瘤藥物埃博霉素中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求1或2中所述的纖維堆囊菌株在埃博霉素類化合物及以埃博霉素為母核的結(jié)構(gòu)衍生物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1或2中所述的纖維堆囊菌株在埃博霉素A、B生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程和生物制藥領(lǐng)域，具體涉及纖維堆囊菌株Sorangiumcellulosum So2163，還涉及該菌株在埃博霉素合成方面的應(yīng)用。纖維堆囊菌株(Sorangiumcellulosum)So2163，該菌株已于2012年6月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC M 2012211。本發(fā)明的纖維堆囊菌株SorangiumcellulosumSo2163，為埃博霉素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的菌株資源。
文檔編號(hào)C12P17/18GK103146594SQ20121044167
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月8日
發(fā)明者趙林, 劉新利, 李越中, 李鵬飛, 孫欣 申請(qǐng)人:山東輕工業(yè)學(xué)院