提高生產(chǎn)子囊霉素產(chǎn)量的基因工程菌株及構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及通過構(gòu)建雙基因串聯(lián)過表達(dá)載體，并在 吸水鏈霉菌子囊亞種菌體內(nèi)表達(dá)，構(gòu)建高效子囊霉素基因工程菌及其構(gòu)建方法和工程菌株 在子囊霉素發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。特別是涉及提高生產(chǎn)子囊霉素產(chǎn)量的基因工程菌株及構(gòu)建 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 子囊霉素（ascomycin, FK-520)是由吸水鏈霉菌子囊亞種（Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus)發(fā)酵產(chǎn)生的一種由二十三元環(huán)組成的大環(huán)內(nèi)醋類抗 生素。是由聚酮合酶/非核糖體合成酶共同合成的，具有抗真菌和免疫抑制活性的天然化 合物。子囊霉素最早是從S. hygroscopicus var ascomyceticus發(fā)酵產(chǎn)物中分離出來，被 認(rèn)為是抗真菌的抗生素，在研宄低毒性FK506的類似物時發(fā)現(xiàn)了子囊霉素具有免疫抑制特 征。子囊霉素曾成功用于預(yù)防器官移植排異，并且在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬等方面的治 療也有顯著功效。子囊霉素除了在治療自身免疫疾病中有不錯的療效，還具有抗痙攣、抗 瘧疾、神經(jīng)保護(hù)再生等活性，有巨大的藥用價值和市場價值。（Okuhara M(1990)TriCycl〇 compounds, a process for their production and pharmaceutical composition containing the same:US, 4894366 ；Sierra P G(2008)pharmacology and therapeutic potential as anticonvul-sants and neuroprotectants. CNS Neurosci Ther, 14:36-46) 目前，我國的子囊霉素的相關(guān)研宄還正處于發(fā)展階段，獲得具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn) 子囊霉素的工程菌株和發(fā)酵技術(shù)迫在眉睫。
[0003] 特異調(diào)控基因編碼的不同類型蛋白的表達(dá)水平對次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量影響不同， 比如：allN基因編碼的AsnC調(diào)控蛋白的同源蛋白的過量表達(dá)對次級代謝產(chǎn)物他克莫司的 產(chǎn)量物明顯的影響，而fkbR、fkbN編碼的LysR-type轉(zhuǎn)錄蛋白家族和LAL轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族的 蛋白的過量表達(dá)可明顯地提高他克莫司的產(chǎn)量。因此，過表達(dá)次級代謝物生物合成的特異 調(diào)控基因?qū)μ岣叽渭壌x物的產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本是很有必要的。本發(fā)明對子囊霉素生物 合成基因簇序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，提出fkbN為子囊霉素生物合成相關(guān)基因，其編碼的 蛋白屬于LAL家族的ATP結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，ATP結(jié)合轉(zhuǎn)錄蛋白可以促進(jìn)次級代謝物的合 成。
[0004] 存在吸水鏈霉菌基因組中的frr基因編碼的核糖體再生因子（RRF)可以催化終 止前復(fù)合物核糖體-mRNA-tRNA的解離和核糖體的再循環(huán)，RRF可以有效地促進(jìn)蛋白合成的 活力，終止前復(fù)合物的再循環(huán)成分可以提高蛋白合成的效率，而RRF的過量表達(dá)可以有效 地增強(qiáng)蛋白的合成和抗生素的高產(chǎn)。本發(fā)明選擇編碼ATP結(jié)合轉(zhuǎn)錄蛋白的fkbN和編碼RRF 蛋白的frr基因?yàn)槟繕?biāo)基因構(gòu)建雙基因串聯(lián)的過表達(dá)載體，通過fkbN和frr基因的過量表 達(dá)共同高效促進(jìn)子囊霉素的生物合成，構(gòu)建高效生產(chǎn)子囊霉素工程菌株。
[0005] 目前，對于鏈霉菌基因工程菌株的構(gòu)建方法日趨完善，而國內(nèi)外對于吸水鏈霉菌 子囊亞種基因工程菌株的研宄很少，而通過過表達(dá)fkbN和frr串聯(lián)基因來構(gòu)建子囊霉素基 因工程菌株的專利研宄未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明通過構(gòu)建fkbN和frr雙基因的過表達(dá)載體，在出發(fā)菌株體內(nèi)表達(dá)，使得 fkbN蛋白和RRF蛋白過量表達(dá)從而增強(qiáng)子囊霉素的生物合成，獲得了高效產(chǎn)子囊霉素工程 菌株 Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01。本發(fā)明構(gòu)建過表達(dá) fkbN和 frr串聯(lián)基因的生產(chǎn)子囊霉素工程菌株Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus TD01，對提高子囊霉素的產(chǎn)量具有現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價值。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種提高生產(chǎn)子囊霉素產(chǎn)量的基因工程菌株；其特征在于基因工程菌為吸水鏈霉 菌 Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus TD01，保藏于中國普通微生物菌種 保藏管理中心，保藏編號為CGMCC 10615。
[0009] 本發(fā)明的基因工程菌株構(gòu)建方法；其特征在于：以S. hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC14891為出發(fā)菌株，過表達(dá)fkbN和frr串聯(lián)基因，構(gòu)建獲得了高效生產(chǎn) 子囊霉素工程菌株 Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus TD01 〇
[0010] Streptomyceshygroscopicusvar.ascomyceticusTD01的構(gòu)建步驟如下：
[0011] (1)設(shè)計(jì)fkbN基因的PCR引物和frr基因的簡并引物；
[0012] (2)以吸水鏈霉菌的基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增fkbN和frr基因片段；
[0013] (3)建立連入frr和fkbN編碼基因的克隆載體pUCNR ;
[0014] (4)通過克隆載體pUCNR，建立連入frr和fkbN編碼基因的過表達(dá)載體pIBNR，熱 激轉(zhuǎn)化到ET12567大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在安普霉素、氯霉素、卡那霉素抗性平板上篩選陽 性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證，建立導(dǎo)入外源frr和fkbN基因過表達(dá)載體的重組菌株；
[0015] (5)將導(dǎo)入過表達(dá)載體的大腸桿菌ET12567與吸水鏈霉菌受體菌株進(jìn)行接合轉(zhuǎn) 移，
[0016] (6)篩選具有安普霉素抗性的工程菌Streptomyceshygroscopicusvar. ascomyceticusTD01〇
[0017]基因工程菌株Streptomyceshygroscopicusvar.ascomyceticusTD01構(gòu)建步驟 詳細(xì)說明如下：
[0018] (1)根據(jù) NCBI 報道的 S. hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC14891 (Gene Bank :AF235504. 1)基因簇中的fkbN的DNA序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，目前吸水鏈霉菌的全 基因組還未完全測序，frr基因序列未報道，通過對frr基因編碼的核糖體再生因子（RRF) 的氨基酸序列相關(guān)的同源性分析，設(shè)計(jì)擴(kuò)增frr基因的簡并引物；
[0019] (2)以吸水鏈霉菌的基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增fkbN和frr基因片段；
[0020] (3)建立連入frr和fkbN編碼基因的過表達(dá)載體pIBNR，熱激轉(zhuǎn)化到ET12567大腸 桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在安普霉素、氯霉素、卡那霉素抗性平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行PCR和 雙酶切驗(yàn)證，即得到導(dǎo)入外源frr和fkbN基因過表達(dá)載體的重組菌株；
[0021] (4)將導(dǎo)入過表達(dá)載體的大腸桿菌ET12567與吸水鏈霉菌菌株進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，篩 選具
[0022] 有安普霉素抗性的吸水鏈霉菌基因工程菌Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus
[0023] TD01 ；
[0024] (5)對工程菌株Streptomyceshygroscopicusvar.ascomyceticusTD01進(jìn)行搖 瓶發(fā)酵試
[0025] 驗(yàn)，檢測次級代謝子囊霉素的產(chǎn)量。
[0026] PCR引物序列為：
[0027] (l)fkbN基因擴(kuò)增引物序列
[0028] fkbN-F25, -GGTTGCATATGTAATGTGATGCCTATGGGTTTCC-3' (Ndel 酶切位點(diǎn)）
[0029] fkbN-R25, -GTATTCTAGATTTAGGATCCGCACGGGCATCCACCAGG-3'
[0030](Xbal、BamHI 酶切位點(diǎn)）
[0031] (2) frr基因擴(kuò)增簡并引物序列
[0032] frr-F25, GTTGCATATGTAAGAGATCTATCGAAGAGACCCTCCTCGA-3'
[0033] (NdeI、BglII 酶切位點(diǎn)）
[0034] frr-R25' -TCATTCTAGATTTAGGATCCTCAGACYTCGAGCAGCTCSG-3,
[0035](Xbal、BamHI 酶切位點(diǎn)）
[0036] 從吸水鏈霉菌中分別克隆fkbN和frr基因，將pUC18用BamHI酶切后補(bǔ)平連接， 再用Ndel-Xbal雙酶切后與同樣用Ndel-Xbal雙酶切的fkbN基因連接，質(zhì)粒為pUCN，將質(zhì) 粒pUCN用BamHI-Xbal雙酶切，frr基因用Bglll-Xbal雙酶切，連接后命名為pUCNR。將質(zhì) 粒pUCNR用Ndel-Xbal雙酶切后與相同酶切的pIB139連接，即獲得過表達(dá)質(zhì)粒pIBNR，重 組質(zhì)粒pIBNR構(gòu)建圖譜見附圖。將過表達(dá)載體質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化入宿主菌株，通過安 普霉素抗性篩選，構(gòu)建過表達(dá)fkbN和frr基因的工程菌株Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus TD01，然后對基因工程菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，檢測子囊霉素產(chǎn)量變化。
[0037] 本發(fā)明的產(chǎn)子囊霉素工程菌，為Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus TD01，于2015年3月12日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國普 通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC 10615。
[0038] 本發(fā)明利用基因工程的手段在吸水鏈霉菌原始菌體中實(shí)現(xiàn)fkbN和frr雙基 因串聯(lián)的過表達(dá)，成功構(gòu)建了高產(chǎn)子囊霉素的工程菌Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus TD01。采用本發(fā)明基因工程菌進(jìn)行子囊霉素?fù)u瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，本發(fā) 明構(gòu)建獲得的高效產(chǎn)子囊霉素工程菌的子囊霉素的產(chǎn)量比原始菌株提高了 42%，工程 菌 Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus TD01 的子囊霉素的產(chǎn)量達(dá)到了 500mg/L。可用于子囊霉素的發(fā)酵生產(chǎn)，可提高產(chǎn)量降低成本。本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌 Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus TD01 在子囊霉素工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā) 揮重大的作用，具有重大的潛力和關(guān)闊的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0039] 圖1 :構(gòu)建重組質(zhì)粒pIBNR圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，本領(lǐng) 域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)當(dāng) 視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)有權(quán)利要求來限定。
[0041] 本發(fā)明利用基因工程的研宄手段，以S. hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC14891菌株作為出發(fā)菌株，克隆fkbN和frr基因，利用大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒 PIB139,構(gòu)建fkbN和frr雙基因的過表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ET12567體內(nèi)，再 通過接合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化吸水鏈霉菌，使過表達(dá)載體在出發(fā)菌株體內(nèi)表達(dá)，增強(qiáng)子囊霉 素的生物合成從而在發(fā)酵水平上提高子囊霉素產(chǎn)量，獲得高效生產(chǎn)子囊霉素的工程菌株 Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus TD01〇
[0042]材料：
[0043] 1.TaqDNA聚合酶（天根生化科技有限公司，中國北京）。<